Sekvenování celého genomu pro diagnostiku neurologických poruch opakované expanze ve Spojeném království: Retrospektivní diagnostická přesnost a prospektivní klinická validační studie

Pro více informací:ali.ma@wecistanche.com

souhrn

Pozadí

Poruchy opakované expanze postihují asi 1 z 3000 jedinců a jsou klinicky heterogenními chorobami způsobenými expanzemi krátkých tandemových repetic DNA. Genetické testování je často lokusově specifické, což vede k poddiagnostikování lidí s atypickými klinickými projevy, zejména u dětských pacientů bez předchozí pozitivní rodinné anamnézy. Celogenomové sekvenování se stále více používá jako test první linie u jiných vzácných genetických poruch a my jsme se zaměřili na posouzení jeho účinnosti v diagnostice pacientů sneurologickýopakované expanzní poruchy.

Metody

Retrospektivně jsme hodnotili diagnostickou přesnost sekvenování celého genomu, abychom detekovali nejběžnější opakující se expanzní lokusy spojené sneurologickývýsledky (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT a TBP) pomocí vzorků získaných v rámci National Health Service v Anglii od pacientů, u kterých bylo podezření, že majíneurologickýporuchy; Výsledky předchozích testů PCR byly použity jako referenční standard. Klinická přesnost sekvenování celého genomu k detekci opakovaných expanzí byla prospektivně zkoumána u dříve geneticky testovaných a nediagnostikovaných pacientů přijatých v letech 2013–17 do 100 000 Genomes Project ve Spojeném království, u nichž bylo podezření, že mají genetickéneurologickýporuchy (familiární nebo časné formy ataxie, neuropatie, spastická paraplegie, demence, onemocnění motorických neuronů,parkinsonskýhnutíporuchy, mentální postižení nebo neuromuskulární poruchy). Pokud bylo provedeno opakované expanzní volání pomocí sekvenování celého genomu, byla k potvrzení výsledku použita PCR.

Zjištění

Diagnostická přesnost sekvenování celého genomu k detekci opakovaných expanzí byla hodnocena proti 793 PCR testům, které byly dříve provedeny v rámci NHS od 404 pacientů. Sekvenování celého genomu správně klasifikovalo 215 z 221 expandovaných alel a 1316 z 1321 neexpandovaných alel, přičemž vykazovalo 97,3 procenta senzitivitu (95 procent CI 94,2–99,0) a 99,6 procenta specificitu (99,1–99 ·9) napříč 13 lokusy souvisejícími s onemocněním ve srovnání s výsledky testu PCR. Ve vzorcích od 11 631 pacientů v projektu 100 000 Genomes Project celogenomové sekvenování identifikovalo 81 expanzí repetic, které byly také testovány pomocí PCR: 68 bylo potvrzeno jako repetitivní expanze v plném patogenním rozsahu, 11 nebylo -patogenní mezilehlé expanze nebo permutace a dvě byly neexpandované repetice (16 procent falešných objevů).

Výklad

V naší studii celogenomové sekvenování pro detekci opakujících se expanzí ukázalo vysokou citlivost a specificitu a vedlo k identifikacineurologickýopakované expanzní poruchy u dříve nediagnostikovaných pacientů. Tato zjištění podporují implementaci celogenomového sekvenování v klinických laboratořích pro diagnostiku pacientů, kteří mají aneurologickýprezentace konzistentní s poruchou opakované expanze.

Financování

Medical Research Council, Department of Health and Social Care, National Health Service England, National Institute for Health Research a Illumina.

Úvod

Navzdory nedávným pokrokům v našem chápání genetického základu vzácnýchneurologickýporuchy, až 70 procent pacientů s takovými poruchami zůstává geneticky nediagnostikováno.1–3 Částečně je to způsobeno technickými problémy testování komplexních a opakujících se genetických variant, včetně opakovaných expanzí; odhaduje se, že takové expanze postihují asi 1 z 3 000 lidí (příloha p 1) a jsou hlavní příčinou více než 40 neurogenetických poruch4, včetně Huntingtonovy choroby a syndromu křehkého X. Poruchy opakované expanze jsou klinicky a geneticky heterogenní a opakovaná expanze může být spojena s různými onemocněními. Například expanze v C9orf72 se mohou projevovat buď jako amyotrofická laterální skleróza nebo frontotemporální demence.5 Opakované expanze v různých lokusech mohou také přinést podobné fenotypové rysy, takže je obtížné je klinicky rozlišit: opakované expanze v alespoň deseti genech spinocerebelární ataxie často přítomných v dospělosti -počátek ataxie6 a ty v C9orf72 a AR mohou způsobit onemocnění motorických neuronů.7,8

Poruchy opakované expanze jsou způsobeny zvýšením počtu opakujících se krátkých tandemových sekvencí DNA a prahy patogenity pro každou poruchu jsou specifické pro daný lokus. Velikost expanze se pohybuje od méně než 30 opakování (např. v CACNA1A) až po několik tisíc jednotek opakování (např. ve FMR1, DMPK, C9orf72 a FXN, které mohou mít velikost až 5 kb). Opakované expanze vykazují molekulární nestabilitu, která může vést ke změnám velikosti repetice (obecně se zvětšující délka) napříč generacemi a tkáněmi.4 Za těchto podmínek zvýšení počtu repetic často vede k časnějšímu nástupu a závažnějšímu onemocnění v řadě za sebou. generací.4 Pediatrický nástup poruch opakované expanze se může projevovat jako multisystémové syndromy bez specifických fenotypových znaků9 a děti s těmito poruchami jsou proto častěji poddiagnostikovány, pokud rodinná anamnéza poruchy opakované expanze chybí, než když je přítomna.10– 12

Laboratorní hodnocení opakujících se expanzí se typicky omezuje na cílené molekulární hodnocení jednotlivého lokusu řízené suspektní klinickou diagnózou pomocí metod založených na PCR nebo Southern blotu,13 což může být nákladné a časově náročné. Navíc vzhledem k různým a překrývajícím se fenotypovým rysům těchto poruch mohou lokusy expanze spojené s nemocí zůstat nevyzkoušeny.14

Sekvenování celého genomu se objevuje jako diagnostický nástroj první linie u pacientů se vzácným onemocněním15, ale donedávna se mělo za to, že má omezenou schopnost hodnotit lokusy obsahující opakované expanze.16 Pokroky v bioinformatice však umožnily detekci onemocnění -způsobující opakované expanze z dat sekvenování nové generace.17–22 Zde informujeme o diagnostickém hodnocení přístupu sekvenování celého genomu k detekci opakovaných expanzí pomocí retrospektivních dat PCR a jeho klinické validaci u pacientů v rámci projektu 100000 Genomes Project, kteří měl podezření na neurologickou poruchu, která nebyla diagnostikována předchozím genetickým vyšetřením.

Metody

Návrh studie a účastníci

Toto hodnocení sekvenování celého genomu pro detekci opakovaných expanzí zahrnovalo jak diagnostickou přesnost, tak hodnocení klinické přesnosti. Diagnostická přesnost byla hodnocena pomocí údajů od pacientů, kteří byli dříve testováni pomocí PCR na opakované expanze, o nichž je známo, že způsobují neurologické onemocnění.4 Pacienti byli identifikováni ze dvou zdrojů: 100 000 Genomes Project a Genomic Laboratory se sídlem v Cambridge University Hospitals ( Cambridge, Spojené království). U obou souborů pacientů provedly laboratoře Národní zdravotní služby (NHS) testování PCR na vzorcích pacientů jako součást rutinního klinického hodnocení: u vzorků v projektu 100 000 genomů byly testy PCR provedeny před náborem do projektu Laboratoř neurogenetiky nemocnice University College London (Londýn, Velká Británie); vzorky s PCR potvrzenými expanzemi repetice byly získány od pacientů testovaných v Genomic Laboratory se sídlem v Cambridge. Pacienti s PCR-pozitivními a PCR-negativními výsledky testů na poruchy opakované expanze byli identifikováni pro zařazení do naší studie pomocí laboratorních záznamových systémů; všichni pacienti dali písemný informovaný souhlas s použitím jejich vzorku pro účely zajištění kvality a výzkumu a školení, jako součást optimalizace a validace klinické služby.

Sekvenování celého genomu každého vzorku bylo provedeno v jedné ze dvou laboratoří: Genomics England (Hinxton, UK) pro vzorky 100 000 Genomes Project (n=254) a Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, USA) pro vzorky získané Genomickou laboratoří se sídlem v Cambridge (n=150). Celkově byl tento soubor dat použit pro část studie týkající se diagnostické přesnosti a sestával z dat PCR a celogenomového sekvenování od 404 pacientů, pokrývajících 13 lokusů, které představují nejběžnější neurologické poruchy expanze opakování: 11 lokusů spojených s ataxií a pozdním počátek neurodegenerativních poruch (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 a FXN), jeden lokus spojený s mentálním postižením (FMR1) a jeden lokus spojený s myotonickou dystrofií (DMPK). Pro každý lokus byla k dispozici data testu PCR pro alespoň jednu expandovanou alelu (příloha str. 24).

Klinická přesnost byla hodnocena zkoumáním shody opakovaných expanzí, jak bylo zjištěno sekvenováním celého genomu, s podezřením na klinickou diagnózu po potvrzení PCR u pacientů s podezřením na genetické neurologické poruchy (familiární nebo časně vzniklé formy ataxie, neuropatie, spastická paraplegie, demence onemocnění motorických neuronů,parkinsonskýpohybové poruchy, mentální postižení nebo neuromuskulární poruchy) zařazené do projektu 100 000 genomů v letech 2013–17. Projekt 100000 Genomes je britský program, jehož cílem je posoudit hodnotu sekvenování celého genomu u pacientů s nenaplněnými diagnostickými potřebami u vzácných onemocnění a rakoviny. Po etickém schválení projektu 100 000 genomů Etickým výborem pro výzkum Cambridge South East of England (referenční číslo 14/EE/1112), včetně analýzy dat a vracení diagnostických nálezů pacientům, byli tito pacienti rekrutováni zdravotnickými odborníky a výzkumníky z 13 center genomické medicíny v Anglii a byli do projektu zapojeni, pokud oni nebo jejich opatrovník poskytli písemný souhlas s použitím jejich vzorků a dat ve výzkumu, včetně této studie. Probandi a pokud to bylo možné i další rodinní příslušníci byli zařazováni podle kritérií způsobilosti stanovených pro specifické stavy vzácných onemocnění (příloha s. 5–11). Pacienti byli přijati do projektu 100 000 genomů po standardním genetickém testování v NHS, jak je uvedeno v kritériích způsobilosti. Standardizovaná výchozí klinická data byla zaznamenávána pomocí Human Phenotyping Ontology (HPO)23 proti modelům dat specifických pro onemocnění.24 Byl také shromážděn stav onemocnění rodinných příslušníků ve vztahu ke klinické indikaci probanda k testování.

Abychom identifikovali kauzativní opakované expanze u pacientů s geneticky nediagnostikovaným onemocněním, testovali jsme pacienty s podezřením na genetické poruchy konzistentní s onemocněním opakované expanze. Pacienti byli vybráni na základě shody jejich onemocnění a termínů HPO s poruchami spojenými s opakovanou expanzí. Údaje o sekvenování celého genomu pacientů byly dotazovány za účelem hledání expanzí v konkrétních sadách repetic pomocí čtyř různých panelů expanze repetic podle jejich klinických charakteristik (příloha str. 5). Opakované expanze vybrané pro zahrnutí do těchto panelů jsou nejběžnějšími lokusy opakované expanze způsobující neurologické onemocnění. Pacienti s klinickými rysy potenciálně kompatibilními s více než jednou poruchou opakované expanze byli testováni na více panelech. Pokud bylo provedeno opakované expanzní volání pomocí sekvenování celého genomu, bylo provedeno potvrzující testování pomocí PCR.

U každého pacienta s potvrzenou opakovanou expanzí byl místní lékař informován o potenciálním diagnostickém výsledku a byl hodnocen příspěvek opakované expanze ke klinickým rysům pacienta. Pro opakované expanze, které plně nebo částečně vysvětlovaly klinické rysy pacienta, byla vydána diagnostická zpráva podle místních standardních postupů.

Postupy

U historických vzorků NHS použitých v části naší studie týkající se diagnostické přesnosti byla dříve testována opakovaná expanze pomocí PCR amplifikace a analýzy fragmentů. Southern blotting byl proveden pro velké expanze C9orf72. V části klinické přesnosti naší studie byly opakované expanze zjištěné celogenomovým sekvenováním u pacientů z projektu 100 000 Genomes Project testovány pomocí PCR ve vzorcích uložených v genetických laboratořích NHS. Další podrobnosti, včetně sekvencí primerů, jsou uvedeny v příloze (str. 2–3, 25–26).

DNA byla připravena pro sekvenování celého genomu pomocí přípravy knihovny TruSeq DNA PCR-Free a sekvenování párových konců 150 bp nebo 125 bp bylo provedeno na platformách HiSeq 2000 nebo HiSeq X ve vysoce výkonném genomovém zařízení pro Genomics England a na ICSL . Genomy byly sekvenovány do průměrné hloubky 35× (31× až 37×; příloha str. 27). Genotypování s krátkým tandemovým opakováním bylo provedeno pomocí softwarového balíku ExpansionHunter verze 3.1.2.25,26 Stručně řečeno, ExpansionHunter přerovnává čtení sekvenování přes předem definovanou sadu krátkých tandemových opakování za účelem odhadu velikosti obou alel od jednotlivce (příloha p 3).

Výstup ExpansionHunter obsahuje odhad počtu opakujících se prvků, celkovou velikost a limit spolehlivosti pro každý hodnocený lokus. Pokyny Asociace pro lékařskou patologii a College of American Pathologists doporučují vizuální kontrolu variantních volání během rutinního hodnocení vysoce výkonných sekvenačních variant.27

Krátké varianty tandemové repetice však nelze adekvátně vizualizovat běžnými vizualizačními nástroji, jako je Integrative Genomics Viewer.28 Ke zkoumání dat sekvenování celého genomu, která jsou základem každého volání genotypu, byl použit nástroj pro vizualizaci grafů, který umožňuje přímou vizualizaci haplotypů a odpovídající pileup čtení. genotypů ExpansionHunter (příloha str. 3, 15). Vizuální kontrola pileup grafu byla provedena u všech krátkých tandemových opakovaných volání sekvenování celého genomu, aby se potvrdilo, že předpověď ExpansionHunter pro alely byla zcela obsažena v každém čtení (tj. sekvence opakování byla menší než délka čtení sekvenování); potvrdit přítomnost monoalelické nebo bialelické expanze; detekovat domnělé falešně pozitivní hovory; a k detekci falešně negativních alel v expanzích bialelických repetic, jako je FXN (příloha str. 4, 16).

ExpansionHunter odhaduje velikost opakování z dat sekvenování celého genomu analýzou sekvenčních čtení, která plně nebo částečně obsahují krátké tandemové opakování. Pokud je krátká alela tandemového opakování kratší než délka čtení, ExpansionHunter předpovídá přesnou velikost; pokud je krátká alela tandemové repetice delší než délka čtení, ExpansionHunter odhadne velikost repetice v rámci CI v závislosti na složení sekvence lokusu, hloubce sekvenování a kvalitě sekvenování.

Statistická analýza

Klasifikovali jsme repetice jako expandované sekvenováním celého genomu, pokud velikost předpokládaná pomocí ExpansionHunter byla nad hranicí premutace, nebo neexpandovaná, pokud byla předpokládaná velikost pod hranicí (příloha str. 28).

Citlivost a CI pro detekci expanze repetice sekvenováním celého genomu byly vypočteny jako podíl alel s rozšířenými repeticemi mezi dříve potvrzenými PCR alelami s rozšířenými repeticemi. Specifita byla odhadnuta jako podíl neexpandovaných alel mezi dříve testovanými neexpandovanými repeticemi pomocí PCR. Úplný popis statistických vzorců je uveden v příloze (str. 1).

Pro porovnání velikostí repetic pomocí PCR s odhady velikosti repetice pomocí sekvenování celého genomu byly alely kvantifikované pomocí PCR porovnány s velikostmi repetic předpovídanými pomocí ExpansionHunter pro alely kratší, než je délka čtení přes všech 13 krátkých lokusů tandemové repetice. Konkordance byla vypočtena procentem velikostí repetic předpovězených pomocí ExpansionHunter, které byly v souladu s velikostí kvantifikovanou pomocí PCR, přičemž se vzala v úvahu chyba PCR plus nebo minus jedna repetice. Statistická analýza byla provedena pomocí statistického softwaru R verze 3.6.3.

Role zdroje financování

Návrh studie, zápis pacientů, sběr dat a sekvenování vedli zaměstnanci Genomics England a akademičtí vědci. Zaměstnanci společnosti Illumina provedli sekvenování 150 vzorků pacientů jako plánovanou součást studie diagnostické přesnosti sekvenování celého genomu a vyvinuli ExpansionHunter. Zaměstnanci Genomics England, akademičtí výzkumníci a spoluautoři RTH, ED a MAE provedli analýzu a interpretaci opakovaných expanzí u pacientů přijatých do projektu 100 000 Genomes Project. Zdroje financování neměly žádnou roli při interpretaci dat nebo psaní zprávy.

Výsledek

Diagnostická přesnost sekvenování celého genomu k detekci expanzí repetic byla hodnocena proti 793 PCR testům dříve provedeným v rámci NHS od 404 pacientů (64 pacientů bylo testováno na více než jedno opakování; obrázek 1). Z těchto testů bylo 183 klasifikováno jako mající rozšířenou repetici a 610 jako bez repetitivní expanze pomocí PCR, což poskytlo celkem 221 expandovaných a 1321 neexpandovaných individuálních alel napříč 13 lokusy onemocnění (příloha str. 24, 28). Celogenomové sekvenování správně klasifikovalo 215 z 221 expandovaných alel a 1316 z 1321 neexpandovaných alel ve srovnání s výsledky PCR testu (příloha str. 27, 29), což ukazuje počáteční citlivost 97,3 procenta (95 procent CI 94,2–99). ·0) a specificita 99,6 procent (99,1–99,9; tabulka 1). Po vizuální korekci všech volání na základě kvality odečtů se senzitivita zvýšila na 99,1 procenta (96,8–99,9) a specificita na 100 procent (99,7–100; obrázek 2A, tabulka 1). Vizualizace expandovaných alel umožnila detekci falešně pozitivních výsledků a reklasifikaci všech falešně negativních alel u FXN, z nichž pouze jedna alela byla správně klasifikována jako expandovaná ve vzorcích s bialelickými expanzemi (příloha str. 17, 18).

Délka opakování byla kvantifikována pomocí PCR v 509 testech PCR dotazujících se 945 alel na 13 expanzních lokusech repetice. Korelace mezi ExpansionHunter a PCR pro velikosti opakování kratší a větší než délka čtení sekvenování (tj. 150 bp) jsou uvedeny v příloze (příloha str. 19). Vysoká konkordance byla pozorována u repetic kratších než délka čtení, s 92,7% shodou (836 z 902) mezi PCR a ExpansionHunter. Byla pozorována variabilita lokusu s vysokou shodou mezi ExpansionHunter a PCR pro ATXN2, ATXN7, CACNA1A a HTT a nízkou shodou pro DMPK nebo TBP (příloha str. 30). Délky alel větší než čtená délka byly ExpansionHunterem podhodnoceny, což ovlivnilo přesnost volání v DMPK, FMR1 a FXN (obrázek 2B, příloha na str. 19, 31).

Ačkoli ExpansionHunter byl schopen správně identifikovat velké expandované alely v FMR1, DMPK, C9orf72 a FXN (příloha p 29), odhady předpokládané velikosti měly tendenci být nižší než ty, které byly získány pomocí PCR, protože velikost repetice se zvýšila v patogenním rozsahu, což ovlivnilo schopnost rozlišovat mezi velkými a malými expanzemi v DMPK, C9orf72 a FXN nebo mezi úplnými expanzemi a permutacemi v FMR1 (příloha str. 31). Například lokusy s délkou repetice hodnocené pomocí PCR větší než 200 repetic ve FMR1 a klasifikované jako úplná mutace měly průměrnou velikost repetice odhadnutou pomocí ExpansionHunter 92,6 (SD 17,8; příloha str. 31).

Abychom otestovali schopnost detekce opakované expanze pomocí sekvenování celého genomu za účelem vyřešení diagnózy dříve testovaných a geneticky nediagnostikovaných pacientů, testovali jsme 11 631 pacientů s podezřením na genetickou neurologickou poruchu zařazených do projektu 100 000 genomů (obrázek 1). Údaje o sekvenování celého genomu byly vyhodnoceny pomocí čtyř různých panelů expanze opakování podle klinických vlastností pacienta. Počty pacientů testovaných na každém ze čtyř panelů jsou uvedeny v tabulce 2.

Celkově jsme detekovali a vizuálně potvrdili opakované expanze ve vzorcích od 105 pacientů (tabulka 2, příloha str. 20, 33). Z toho bylo 81 vzorků k dispozici pro konfirmační testování pomocí PCR a u 68 bylo potvrzeno, že má opakovanou expanzi (0·6procentní výtěžek): 45 (1,2 procenta) z 3692 v panelu A, osm ({ {18}}·3 procenta ) z 2743 v panelu B, pět (0,6 procenta) z 860 v panelu C a deset (0,1 procenta) z 6731 v panelu D. Třináct z 81 rozšíření nebyly potvrzeny jako patogenní opakující se expanze (16 procent falešných objevů). Z toho dvě byly neexpandované alely v ATXN1 a ATXN2, čtyři byly volání střední velikosti FMR1 (příloha p 21) a sedm byly permutace FMR1.

Klinické podrobnosti o 68 pacientech s opakovanými expanzemi potvrzenými PCR, včetně jejich klinických projevů, identifikované opakované expanze a příspěvku opakované expanze ke klinickým rysům pacienta jsou uvedeny v tabulce 3; termíny HPO, velikost opakování odhadovaná pomocí ExpansionHunter a informace o tom, zda byla vydána diagnostická zpráva, jsou uvedeny v příloze (str. 33).

Expanze byly pozorovány u pacientů s širokou škálou překrývajících se klinických projevů testovaných panelem A (tabulka 3, příloha str. 22), včetně opakované expanze ATXN2 u pacienta s Parkinsonovou nemocí s časným nástupem reagujícím na levodopu a anamnézou progresivní cerebelární ataxie a expanze AR u čtyř pacientů klinicky diagnostikovaných s Charcot-Marie-Toothovou chorobou, včetně jednoho s geneticky potvrzenou demyelinizační neuropatií (tj. Charcot-Marie-Toothova choroba typu 1, pacient 42; příloha str. 33). U pacientů s patogenními opakujícími se expanzemi bylo pozorováno široké spektrum předchozích klinických diagnóz.

Například u sedmi pacientů s amyotrofickou laterální sklerózou nebo jiným onemocněním motorických neuronů byly zjištěny expanze v AR (n=4) a C9orf72 (n=3). U pacientů s podezřením na dědičnou ataxii jsme identifikovali expanze lokusů, které nebyly hodnoceny jako součást rutinního diagnostického vyšetření v rámci NHS v době náboru, včetně ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP a HTT ( tabulka 3). Zjistili jsme také opakované expanze u pacientů s klinickými rysy konzistentními s alternativními poruchami opakované expanze, včetně expanze C9orf72 u časného nástupu a familiární Parkinsonovy choroby (pacient 24, tabulka 3) a opakovaných expanzí ve sníženém rozsahu penetrance u HTT (38 opakování). u dvou sester s poruchou hybnosti, demencí, depresí a řečovými obtížemi (pacienti 44 a 45), což podtrhuje diagnostický problém, který tyto opakované expanzní poruchy představují.

U osmi dětí testovaných panelem B bylo zjištěno, že má velké expanze opakování CAG (obrázek 3), z nichž sedm plně vysvětlilo klinické rysy pacienta. Šest pacientů nemělo informativní rodinnou anamnézu a v době náboru jim nebylo nabídnuto opakované expanzní testování jako součást jejich klinického hodnocení (pacienti 48–53; tabulka 3, příloha str. 33). Dvě z těchto dětí nesly velké expanze HTT (90–100 opakování CAG). Je třeba poznamenat, že jedno dítě zdědilo opakování od nepostiženého rodiče bez rodinné anamnézy Huntingtonovy choroby. Rodinné testování probíhá, ale v rozšířené rodině byla identifikována snížená penetrační alela, což naznačuje, že se repetice rozšířila o více než 60 jednotek opakování v jedné generaci (pacient 52). V době psaní tohoto článku nikdo z rodiny nevykazoval žádné známky Huntingtonovy choroby a pro rodiče probíhá genetické poradenství a testování. Dvě děti mladší 5 let měly velké opakované expanze v ATXN7 a vykazovaly komplexní multisystémové onemocnění. U jednoho z těchto dětí (pacient 50) vykazoval jejich rodič problémy s chůzí 2 roky po zařazení do projektu 100 000 genomů. Podobně bylo zjištěno, že u dívky ve věku 10 let s mentálním postižením došlo k 99-opakované expanzi v ATXN2, přestože oba rodiče byli označeni jako nepostižení, a u dívky ve věku 18 let s demencí bylo zjištěno, že je nositelkou { {19}}opakujte expanzi v ATN1 (příloha p 33).

Bylo detekováno pět expanzí DMPK (panel C), včetně u dítěte a matky s klinickou diagnózou svalové dystrofie, u dvou sourozenců s podezřením na distální myopatii a u adolescenta s vrozenou myopatií (pacienti 54–58). Expanze FMR1 (panel D) byly detekovány u devíti chlapců a jedné dívky a diagnóza syndromu Fragile X plně nebo částečně vysvětlila současné klinické příznaky (pacienti 59–68).

Diskuse

Diagnostika poruch opakované expanze je ve zdravotnictví náročná kvůli heterogenním a překrývajícím se klinickým rysům a nespecifickým klinickým nálezům, jejichž závažnost se může zvyšovat s věkem a v každé další generaci. Poruchy opakované expanze patří mezi nejčastější příčiny dědičných neurologických onemocnění.4 Přesto mohou být pacienti poddiagnostikováni, ať už proto, že nebylo provedeno dostatečné genetické vyšetření, nebo proto, že příčinné genetické varianty dosud nebyly objeveny. Testovací přístupy jsou v současnosti roztříštěné a pacienti mohou mít testován nesprávný lokus opakované expanze29 nebo mohou dostat molekulární test na jinou třídu variant kvůli překrývání klinických znaků s jinými neurologickými genetickými poruchami.30

Sekvenování celého genomu bylo použito v různých prostředích jako diagnostický test první linie u vzácných neurologických poruch, ale dříve se mělo za to, že má nízkou schopnost detekovat opakované expanze.16 Bylo vyvinuto několik nástrojů k identifikaci opakovaných expanzí z celého genomu. sekvenování ve výzkumném prostředí31, ale žádný z těchto přístupů nebyl aplikován na celogenomová sekvenační data shromážděná od velkého počtu pacientů v jedné zdravotnické službě. Předkládáme důkaz, že algoritmus navržený k detekci opakovaných expanzí ze sekvenování celého genomu může spolehlivě posoudit nejběžnější expanze způsobující onemocnění a vyřešit dříve geneticky nediagnostikované případy u velké skupiny pacientů s neurologickými poruchami. Naše výsledky naznačují, že sekvenování celého genomu dokáže rozlišit mezi neexpandovanými a expandovanými alelami s vysokou senzitivitou a specificitou napříč 13 opakujícími se expanzními lokusy (které lze dále zlepšit vizuální kontrolou), dokáže přesně vypočítat velikost alel menších, než je délka čtení. a může podcenit velikost velkých rozšíření ve FMR1, DMPK, FXN a C9orf72.

Když byla detekce opakovaných expanzí sekvenováním celého genomu hodnocena proti pozitivním a negativním výsledkům dříve získaným v klinických diagnostických genomických laboratořích za použití metod zlatého standardu, zjistili jsme minimálně 97,3% senzitivitu a 99,6% specificitu. Dále jsme ukázali, že jak specificitu, tak senzitivitu lze zlepšit manuální kurací čteného pileupu, což umožňuje detekci falešně pozitivních výsledků a reklasifikaci falešně negativních alel ve vzorcích s bialelickými expanzemi. Z 6731 pacientů testovaných na FMR1 (panel D) bylo předpovídáno rozšíření 124 hovorů. Pomocí vizuální kontroly jsme byli schopni vyloučit 97 jako pravděpodobně falešně pozitivní. To naznačuje, že 1 z 54 celogenomových sekvenačních testů by měl volání FMR1, které by bylo nutné vizuálně zkontrolovat, aby se odstranil potenciální falešně pozitivní hovor. Pokračují práce na vylepšení metody genotypování ExpansionHunter, aby se snížil počet falešně pozitivních volání FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 repetic) způsobuje závažnější onemocnění a spinocerebelární ataxie typu 36 (NOP56), pro kterou jsou expanze větší než 650 repetic považovány za patogenní a velikosti repetic 15–650 jsou považovány za střední a varianty s nejistým významem.

Bylo identifikováno více než 40 opakujících se expanzních lokusů; mnoho z těchto lokusů bylo identifikováno teprve nedávno a nyní je spojeno s dříve nevysvětlenými stavy, včetně cerebelární ataxie s neuropatií a vestibulárním syndromem areflexie (RFC1) 32 a myoklonickou epilepsií (SAMD12).33 Nejčastějšími lokusy opakované expanze způsobující neurologické onemocnění byly vybrané pro naši studii na základě dostupnosti pozitivních a negativních kontrolních vzorků.

Zde prezentovaná zjištění naznačují, že ExpansionHunter by měl být schopen přesně klasifikovat neexpandované a expandované alely v jakémkoli lokusu opakované expanze, pokud jsou neexpandované alely menší než čtená délka (tj. 150 bp). Ačkoli většina opakujících se expanzních lokusů má alely, které jsou menší než 150 bp, když neexpandují, některé lokusy, jejichž velikost neexpandované alely je blízká 150 bp (např. NOTCH2NLC)34, může být obtížnější genotypovat pomocí tohoto přístupu. U lokusů, kde je expandovaná repetice významně větší než čtená délka, může sekvenování celého genomu detekovat patogenní expanze (např. NOP56,35 RFC120,32). Vznikající technologie sekvenování s dlouhým čtením mohou nabídnout doplňkové přístupy při genotypování velkých expanzí.36

Hodnocení opakovaných expanzí pomocí sekvenování celého genomu u 11 631 nediagnostikovaných pacientů přijatých do 100 000 projektu Genomes přineslo 68 pacientů s vysvětlujícími nálezy. Pacienti byli přijati do 100 000 Genomes Project po standardním genetickém testování; proto podíl opakovaných expanzí identifikovaných v této kohortě představuje zvýšení diagnostického výtěžku ze standardního testování NHS, které zahrnuje lokusově specifické testování poruch opakované expanze, jako je FXN nebo DMPK. Je třeba poznamenat, že některé diagnózy nebyly podezřelé na základě klinických příznaků pacienta, včetně šesti dětských pacientů, kteří neměli v rodinné anamnéze žádnou poruchu opakované expanze. Průměrné velikosti expanze opakování předpokládané sekvenováním celého genomu u pediatrických pacientů popsané v této studii jsou podstatně větší než průměr u dospělých, což je v souladu s očekáváním, že větší expanze jsou spojeny s časnějším a závažnějším nástupem, a to i u dětí. Je zapotřebí další práce, ale toto zjištění naznačuje, že hodnocení patogenity závislé na věku a opakované na velikosti by mohlo podpořit pediatrickou diagnózu snížením potenciálního rizika identifikace rizikových alel s nástupem v dospělosti, což vede k nevyžádanému prediktivnímu testování u dětí.

Naše zjištění umožňují vytvoření klinického diagnostického pracovního postupu pro sekvenování celého genomu (příloha str. 23). Navrhujeme, aby se vizuální kontrola prováděla u všech hovorů klasifikovaných jako rozšířené za účelem detekce falešně pozitivních výsledků a u bialelických expanzí, u kterých byla detekována pouze jedna rozšířená alela (např. FXN). Doporučujeme, aby laboratoře používaly ExpansionHunter k posouzení přítomnosti expanze bez dodržení odhadu velikosti a prováděly potvrzující PCR testování jako standardní součást pracovního postupu testování.

Vzácná dědičná onemocnění zahrnují širokou škálu klinických příznaků, takže testování genomu specifického pro daný lokus je neefektivní, namáhavé a drahé. Předkládáme důkaz, že sekvenování celého genomu klinického stupně s potenciálem diagnostikovat řadu vzácných neurologických onemocnění, které se typicky projevují variantami s jedinou bází, indel nebo počtem kopií, by nyní mohlo být rozšířeno na opakované expanze. Vzhledem k tomu, že sekvenování celého genomu poskytuje jediný test, který dokáže identifikovat nejběžnější expanze opakování a zároveň umožňuje testování bodových mutací a variant počtu kopií v genech spojených s těmito stavy současně, nabízí příležitost identifikovat většinu pacientů s těmito heterogenními poruchami. kteří nebyli diagnostikováni pomocí lokusově specifického testování. V éře nově vznikajících terapií těchto poruch by se včasná detekce mohla stát zásadní.37 Tyto výsledky podporují implementaci celogenomového sekvenování pro detekci opakovaných expanzí v klinických diagnostických laboratořích, což je přístup, který již byl zahrnut do NHS England National Genomic Test Directory,38 pro vyšetřování nediagnostikovaného vzácného neurologického onemocnění.

Reference

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H a kol. Diagnostický strop pro sekvenování exomů u cerebelární ataxie a souvisejících neurologických poruch. Hum Mutat 2020; 41: 487-501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Dědičná spastická paraplegie v Řecku: charakterizace dříve neprozkoumané populace pomocí sekvenování nové generace. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F a kol. Diagnostický výnos cíleného sekvenačního genového panelu nové generace pro pohybové poruchy s nástupem u dětí: 3-letá kohortová studie. Přední Genet 2019; 10:1026.

4 Paulson H. Opakované expanzní nemoci. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 frontotemporální demence a/nebo amyotrofická laterální skleróza. Seattle, WA: University of Washington, 2015.

6 Kloggether T, Mariotti C, Paulson HL. Spinocerebelární ataxie. Nat Rev Dis Primers 2019; 5:24.

7 Shakkottai VD, Fogel BL. Klinická neurogenetika: autozomálně dominantní spinocerebelární ataxie. Neurol Clin 2013; 31: 987-1007.

8 La Spada A. Spinální a bulbární svalová atrofie. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA a kol., ed. GeneReviews. Seattle, WA: University of Washington, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. Letální forma spinocerebelární ataxie typu 7 s časným nástupem v dětství. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Agregace a ubikvitinace ataxinu u infantilního SCA7 se 180 opakováními CAG. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Spinocerebelární ataxie typu 2 projevující se kognitivní regresí v dětství. J Child Neurol 2008; 23: 999-1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Spinocerebelární ataxie 3 začínající v dětství: dystonie jazyka jako časný projev. Tremor Other Hyperkinetic Mov 2019; zveřejněno online 13. září.

13 Bird TD. Myotonická dystrofie typu 1. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Seattle, WA: University of Washington, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Frekvence opakovaných expanzí SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS a C9orf72 u pacientů se SCA negativních na nejběžnější podtypy SCA. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K a kol. Celogenomové sekvenování pacientů se vzácnými onemocněními v národním zdravotnickém systému. Příroda 2020; 583: 96–102.

16 Ashley EA. Směrem k přesné medicíně. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et al. Diagnostická a klinická užitečnost sekvenování celého genomu v kohortě nediagnostikovaných čínských rodin se vzácnými onemocněními. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profiling the genom-wide landscape of tandem repeat expans. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Detekce expanzí tandemových repetic v kohortách sekvenovaných pomocí krátkých sekvenačních dat. Am J Hum Genet 2018; 103: 858-73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF a kol. Identifikace rozšířených repetic na základě bioinformatiky: nereferenční intronová expanze pentameru v RFC1 způsobuje CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Varianty počtu kopií v klinickém sekvenování genomu: nasazení a interpretace pro vzácné a nediagnostikované onemocnění. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM a kol. Detekce tandemových repetic DNA v celém genomu, které jsou rozšířeny u autismu. Příroda 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. The Human Phenotype Ontology: nástroj pro anotaci a analýzu lidských dědičných onemocnění. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomics Anglie. Klinické datové modely stavů vzácných onemocnění. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (vstup 4. srpna 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Detekce expanzí dlouhých repetic z dat celé genomové sekvence bez PCR. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: nástroj založený na sekvenčním grafu pro analýzu variací v krátkých tandemových opakujících se oblastech. Bioinformatika 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Standardy a pokyny pro ověřování sekvenačních bioinformatických potrubí nové generace: společné doporučení Asociace pro molekulární patologii a College of American Pathologists. J Mol Diagn 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Integrativní prohlížeč genomiky. Nat Biotechnol 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD a kol. Fenotypová homogenita prezentace podobné Huntingtonově chorobě v rodině SCA17. Neurologie 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Bird T. Huntingtonova choroba, podobající se Huntingtonově chorobě a benigní dědičná chorea: co je nového? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Nedávné pokroky v detekci opakujících se expanzí pomocí krátkého čtení sekvencí nové generace. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R., Sullivan R, et al. Bialelická expanze intronové repetice v RFC1 je běžnou příčinou ataxie s pozdním nástupem. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Expanze intronických repetic TTTCA a TTTTA u benigní familiární myoklonické epilepsie dospělých. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. Nekódující expanze opakování CGG u neuronální intranukleární inkluzní choroby, okulofaryngodistální myopatie a překrývajícího se onemocnění. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K a kol. Rychlá diagnostika spinocerebelární ataxie 36 v třígenerační rodině pomocí krátkých dat sekvenování celého genomu. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Long-read sekvenování objevující se v lékařské genetice. Přední Genet 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Poruchy opakované expanze: mechanismy a terapeutika. Neuroterapeutika 2019; 16: 924–27.

38 Národní zdravotní systém. National Genomic Test Directory: testovací kritéria pro vzácné a dědičné onemocnění. říjen 2021.