Pacienti po cévní chirurgii se zvýšeným poměrem neutrofilů k lymfocytům mají sníženou expresi RNA komplementu neutrofilů

Zvýšený poměr neutrofilů k lymfocytům (NLR) u pacientů, kteří podstoupí elektivní cévní chirurgii (EVS), má zvýšenou mortalitu nezávisle na perioperačních chirurgických výsledcích. Abychom pochopili, proč je vysoká NLR spojena s vyšší mortalitou, zkoumali jsme expresi transkriptomu neutrofilů a lymfocytů u pacientů podstupujících EVS. Vzorky krve byly odebrány pacientům podstupujícím EVS a zdravým dárcům pro výpočet NLR. Vzorky RNA byly izolovány z neutrofilů a lymfocytů pacientů a rozděleny do NLR_nízké (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Úvod

Kardiovaskulární onemocnění (CVD) je celosvětově hlavní příčinou úmrtí. Je to z velké části způsobeno aterogenezí a aterosklerózou, která je kromě individuální genetiky a stravy zprostředkována zánětlivými a imunitními mechanismy.1-3 V poslední době se do centra pozornosti dostává diferenciální počet leukocytů (neutrofily a lymfocyty). předpovídat kardiovaskulární (CV) výsledky. Poměr absolutního počtu neutrofilů a lymfocytů (NLR) byl rozpoznán jako prediktor celkové mortality v mnoha malých studiích akutních koronárních intervencí,4-6 hypertenze7,8 a srdečního selhání.9

Tabulka 1. Klinické charakteristiky pacientů s elektivní cévní chirurgií vyšetřených pomocí RNA-seq

Předchozí výzkumy také ukázaly, že NLR je prediktorem dlouhodobých výsledků u pacientů s onemocněním periferních cév.10-13 Naše retrospektivní studie populací pacientů s cévní chirurgií tento závěr podporují. V 1 studii se 108 pacienty s elektivní endovaskulární reparací aneuryzmatu břišní aorty nebyl zjištěn žádný rozdíl v 30-denní pooperační mortalitě mezi NLR<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 pacientů, 42,6% riziko cévní mozkové příhody) než u pacientů s NLR<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] skupiny NLR.16 Pacienti s nižší předoperační NLR dosáhli signifikantně vyššího přežití bez amputace při 4-ročním sledování (nízká NLR 65,5 %, střední NLR, 37,5 % a vysoká NLR, 17,6 % [P < 0,0001]).16

V této studii jsme provedli sekvenování RNA (RNA-seq) neutrofilů a lymfocytů od pacientů, kteří se kvalifikovali pro elektivní vaskulární chirurgii (EVS), abychom určili potenciální mechanismy pro zvýšení NLR. Studie zkoumaly, zda existuje molekulární základ pro zvýšenou NLR. Naše výzkumy ukazují, že pacienti se zvýšenou NLR, kteří měli opravu EVS, se vyznačují vysoce významnou downregulací imunoglobulinových a komplementových genů v neutrofilech.

cistanche výhody-posilují imunitní systém

Metody

Pacienti

Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 mg/dl), kouření, léčba statiny, anamnéza chronické obstrukční plicní nemoci, rakoviny, chronického onemocnění ledvin, onemocnění koronárních tepen (CAD), onemocnění periferních tepen, cerebrovaskulární onemocnění a chronické srdeční selhání. Všichni pacienti měli kompletní krevní obraz s diferenciálním počtem bílých krvinek. Pacienti byli rozděleni do skupin s nízkou NLR (NLR_Nízká [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery. 

Separace krve

Plná krev (20 ml na pacienta) byla odebrána do 10 ml vakuových zkumavek antikoagulovaných EDTA a krev byla oddělena do hodiny po odběru. Populace neutrofilních a lymfocytárních buněk byla každá izolována z 8 ml krve pomocí souprav EasySep pro přímou izolaci lidských buněk (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada) a magnetu Big Easy EasySep (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada) podle protokolů výrobce. Magnet byl předtím ochlazen na ledu a krevní buňky a činidla byly jemně promíchány převrácením zkumavky na rozdíl od pipetování. Poměry činidel byly také upraveny následujícím způsobem, aby se optimalizovala výtěžnost: 400 ml směsi protilátek, 400 ml magnetických kuliček a 4 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem bylo přidáno do krve před první separací a následně 200 ml protilátky. směsi a 400 ml kuliček před druhou separací a 200 ml kuliček před třetí a závěrečnou separací. Malý alikvot 200 ml byl odebrán z konečných objemů izolace pro počítání buněk a přípravu sklíček. Zbytek regenerovaného objemu byl centrifugován při 1000 otáčkách za minutu po dobu 7 minut, aby se buňky peletovaly.

Obrázek 1. Celý transkriptom RNA z neutrofilů a lymfocytů odebraných od pacientů s NLR, vysokou (NLR_vysoká), nízkou (NLR_nízká) nebo kontrolní (NLR_kontrola) . Písmenný kód "N" nebo "L" v názvu vzorku znamená, že zdrojem RNA byly buď neutrofily, nebo lymfocyty. V každé kategorii bylo 6 pacientů. Modrá=snížená úroveň výrazu; červená=vysoká úroveň výrazu.

Počítání buněk a příprava preparátů

Buňky resuspendované ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem byly dále rozděleny na alikvoty, smíchány s trypanovou modří a ručně počítány pomocí hemocytometru. Typicky bylo izolováno 9 x 106 až 15 x 106 neutrofilů a 3 x 106 až 10 x 106 lymfocytů na vzorek. Sklíčka izolovaných buněk byla připravena pomocí cytocentrifugy, odstřeďována při 600 otáčkách za minutu po dobu 3 minut a poté obarvena barvivem Wright-Giemsa. Čistota každé buněčné populace byla stanovena manuálním počítáním, při kterém bylo rozlišeno alespoň 1000 buněk na sklíčko. Průměrné čistoty separací neutrofilů a lymfocytů podle počítání buněk byly 98,3 %, respektive 96,2 %. Průtoková cytometrie byla provedena na 1 páru vzorků neutrofilů a lymfocytů a ukázala 90,6% a 92,2% čistotu, v daném pořadí. Ostatní buňky v neutrofilním přípravku byly rozloženy na lymfocyty (4 %), monocyty (2 %), eozinofily (2,3 %) a bazofily (0,3 %). V lymfocytárním preparátu byly dalšími buňkami neutrofily (1,2 %), monocyty (1,4 %), eozinofily (1,2 %) a bazofily (1,8 %). Hromadná data RNA-seq ze všech jednotlivých vzorků byla také použita ke stanovení rozsahu monocytové kontaminace v buněčných preparátech stanovením, zda neutrofily nebo lymfocyty ze vzorků NLR_Vysoká nebo NLR_nízká významně zvýšila CD14 , CD68, CD83 nebo CD163. Nezávisle na tom byla data RNA-seq vložena do odhadu podílu imunitních a rakovinných buněk (EPIC), což je program určený k odhadu podílu imunitních a rakovinných buněk v hromadných datech genové exprese.17 Použitý referenční profil poskytl EPIC pro krevní cirkulující imunitní buňky a obsahuje profil pro B buňky, CD4 a CD8 T buňky, monocyty, neutrofily a přirozené zabíječe. Uváděný výstup je dán jako buněčné frakce na vzorek.

Obrázek 2. Významně odlišně exprimované geny z neutrofilů a lymfocytů. (A) Počet významně odlišně exprimovaných genů v neutrofilech (modrá) a lymfocytech (oranžová). (B) Graf analýzy hlavních složek významně odlišně exprimovaných genů v neutrofilech (zelená a fialová) a lymfocytech (červená a modrá) v NLR_Vysoké (kruhy) a NLR_Nízké (čtverečky). (C) Tepelná mapa významně odlišně exprimovaných genů z NLR_Vysoká vs NLR_Nízká neutrofilní RNA. (D) Tepelná mapa významně odlišně exprimovaných genů z NLR _vysoké vs NLR_nízké lymfocytové RNA.

RNA-seq a statistická analýza

Podrobné metody pro extrakci a sekvenování RNA jsou uvedeny v doplňkových metodách. Sekvenační čtení byla hodnocena z hlediska kvality a adaptér byl oříznut pomocí TrimGalore! (Babraham Institute), obalový skript pro FastQC a CutAdapt. Čtení procházející kontrolou kvality byla porovnána s lidským referenčním genomem GRCh38 pomocí softwaru STAR aligner. Zarovnaná čtení byla zpracována pomocí Cufflinks verze 2.2.1 pro analýzu diferenciální exprese pomocí genové anotace GENCODE pro GRCh38 a data exprese na úrovni genu byla hlášena ve fragmentech na kilobázi transkriptu na milion mapovaných přečtení.18 Významně odlišně exprimované geny byly identifikovány pomocí falešné rychlost objevu cutoff P hodnota<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.

Výsledek

Charakteristika pacienta

Bylo vybráno šest párů vzorků pacientů ze 7 NLR_Vysoké a 9 NLR_Nízké na základě nejvyšší kvality RNA v páru hodnocené pomocí čísla integrity RNA (RIN) (Tabulka 1 ). Bylo také vyšetřeno šest kontrol od 8 zdravých dárců. U pacientů zařazených do studie byla průměrná ± standardní odchylka NLR pro NLR_vysoká 4,37 ± 0,66 vs. pro NLR_nízká, 1,87 ± 0. 39 (P < .0001). Průměrná ± standardní odchylka věku pacientů byla 61,0 ± 17,0 let pro NLR_vysokou a 64,5 ± 7,5 let pro NLR_nízkou (P= 0,68). Všichni kromě 1 měli onemocnění aneuryzmatu aorty, 9 bylo torakální/thorakoabdominální a 2 byli břišní. Oba pacienti s aneuryzmatem břišní aorty byli ve skupině NLR_Low. Jedenáct z 12 pacientů mělo v anamnéze hypertenzi. Čtyři ze 6 pacientů v obou skupinách NLR_Vysoká nebo NLR_nízká měla v anamnéze lipidové abnormality. Čtyři pacienti ve skupinách NLR_Vysoká a 3 pacienti ve skupinách NLR_Nízké byli bývalí kuřáci. Jeden pacient ve skupině NLR_Low byl aktivní kuřák. Pět pacientů ve skupinách NLR_Vysoká a 4 ve skupinách NLR_Nízké užívalo statiny. Pouze 3 pacienti v obou skupinách byli diabetici. Jeden pacient v každé skupině měl v anamnéze ICHS a 2 pacienti ve skupině NLR_Low měli onemocnění periferních tepen.

Obrázek 3. Data RNA-seq v tomto výzkumu byla použita jako nezávislý prostředek ke stanovení jiné buněčné kontaminace v preparátech neutrofilů a lymfocytů. Jsou zobrazena pouze data z neutrofilů. Pro odhad podílu imunitních a rakovinných buněk v hromadných datech genové exprese byla provedena analýza EPIC. Tato analýza poskytla procento neutrofilů, monocytů, B buněk, CD4 T buněk, CD8 T buněk, přirozených zabíječských (NK) buněk a dalších buněk v neutrofilním přípravku.

Celý přepis

Při srovnání profilů genové exprese mezi neutrofily a lymfocyty jsme pozorovali globální rozdíly v celém transkriptomu (obrázek 1). Toto zjištění nebylo překvapivé, protože genová exprese specifická pro buněčný typ byla dříve charakterizována jako odlišná.19 V sekci neutrofilů u pacientů v NLR _Vysoká, NLR_Nízká a NLR{{ 4}}Kontrolní skupiny, tam bylo mnoho genů upregulovaných, které jasně nebyly upregulovány v lymfocytární sekci a naopak. Na úrovni celého transkriptomu byly buněčně specifické rozdíly mezi neutrofily a lymfocyty zřetelné a dominantní bez ohledu na NLR nebo zda jde o pacienta nebo kontrolu. Při bližším zkoumání se však začaly objevovat rozdíly. Graf analýzy hlavních složek ukázal, že NLR_kontrola pro neutrofily nebo lymfocyty se překrývala s NLR_vysokou a NLR_nízkou v obou buňkách (doplňkový obrázek 1). Výzkumy se dále snažily najít další rozdíly mezi NLR_vysokou a NLR{11}}nízkou skupinou ve významně odlišně exprimovaných genech. Bylo pozorováno, že 900 (74,5 %) významně odlišně exprimovaných genů bylo pozorováno u neutrofilů ve skupinách NLR_Vysoká vs NLR_Nízká (obrázek 2A). Pro srovnání, lymfocyty měly pouze 190 (15,7 %) významně odlišně exprimovaných genů. Graf analýzy hlavních komponent genů NLR_Vysoké vs. NLR_Nízké geny v neutrofilech a lymfocytech odhalil, že skupina genů NLR_Vysoká vs NLR_nízká v neutrofily se segregovaly do 2 odlišných oblastí, zatímco geny pro NLR_vysoké a NLR_nízké lymfocyty se překrývaly (obrázek 2B). Opět, stejně jako u celých transkriptomových dat, se NLR_kontrola překrývala s NRL_vysokou a NLR_nízkou významně odlišně exprimovanými geny jak v neutrofilech, tak v lymfocytech (doplňkový obrázek 2). Většina významně odlišně exprimovaných genů v NLR _High neutrofilů byla downregulována z NLR_Low (obrázek 2C). Podobný, ale mnohem nižší počet genů byl downregulován u NLR_High lymfocytů než u neutrofilů (obrázek 2D). Tato data naznačují, že hladiny NLR byly většinou spojeny se změněnou genovou expresí v neutrofilech. Kromě toho bylo potřeba ji porovnat s pacienty z její skupiny onemocnění NLR_nízká, nikoli NLR-kontrola, protože první skupina se jasně oddělila od NLR_vysoké, ale ne NLR_kontroly ( Obrázek 2B, doplňkový obrázek 2).

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Před zkoumáním rozdílné exprese genů a obohacení genové sady charakterizovaly další studie stupeň kontaminace monocyty v preparátu neutrofilů. Pomocí dat RNA-seq jsme pozorovali, že exprese monocytových markerů CD14, CD68, CD83 a CD163 v preparátech NLR_Vysoká vs NLR_nízká neutrofilů nebo lymfocytů se významně nelišila. EPIC analýza dat neutrofilní RNA-seq ukázala, že neimunní buňky ("jiné buňky") a CD4 T buňky byly hlavními kontaminanty v neutrofilních preparátech (obrázek 3). Kromě NLR{{10}}nízkých CD4 T buněk a B buněk se žádná z ostatních kontaminujících buněk významně nelišila v NLR_Nízké neutrofily vs. NLR_Vysoké neutrofily . V preparátu neutrofilů byla kontaminace monocyty podle EPIC analýzy pouze 0,17 % ± 0.05 % pro NLR_Nízká oproti 0,1 % ± 0,033 % pro the NLR_Vysoká příprava (P=0,12). Tato hodnota ukazuje, že kontaminace monocyty byla o řád nižší, když byla stanovena analýzou dat RNA-seq vs průtoková cytometrie.

Obrázek 4. Bodový bublinový graf významně exprimovaných kategorií genových sad GO pro biologické procesy mezi NLR_vysokou a NLR_nízkou. Poměr k: K na vodorovné ose je počet genů, které jsou významně odlišně exprimovány (k) ve srovnání s celkovým počtem genů v kategorii (K). Na ose y je význam obohacení vyjádřený jako log (hodnota P). (A) Sady genů GO odvozené z neutrofilní RNA-sekv s porovnáním NLR_Vysoká a NLR_Nízká. (B) Sady genů GO odvozené z lymfocytové RNA-sekv. Nejméně významné jsou sady genů v levém dolním rohu obou grafů. Nejvýraznější jsou sady genů v pravém horním rohu obou pozemků.

Obrázek 4 (pokračování)

Abychom prozkoumali povahu odlišně exprimovaných genů, provedli jsme GSEA s kategoriemi genové ontologie (GO) pro biologické procesy s použitím významně odlišně exprimovaných genových sad mezi NLR_vysokou a NLR{1}}nízkou. Výsledky jsou uvedeny v bublinových grafech rozptylu (obrázek 4). Segregace genových sad do pravého horního rohu každého z grafů ukazuje (1) vysoké procento genů v genových sadách, které jsou významně změněny, a (2) vysoký stupeň významnosti pro obohacení genové sady. V našem vzorku grafy rozptylových bublin ukázaly obohacení kategorií GO komplementu i humorální odpovědi nezávisle jak pro neutrofily, tak pro lymfocyty. U neutrofilů byly nejvýznamnější sady genů pro klasickou dráhu aktivace komplementu, regulaci kaskády aktivace proteinů a humorální imunitní odpověď zprostředkovanou cirkulujícím imunoglobulinem, přičemž nejvyšší procento členů genové sady se významně změnilo (obrázek 4A). Nezávisle na tom bylo také pozorováno, že identické sady genů v lymfocytech mají vysoký poměr významně změněných genů a stupeň významnosti jako ve studiích s neutrofily (obrázek 4B).

Tabulka 2. Imunologické genové sady v neutrofilech a lymfocytech

Tabulka 2 uvádí nejvýrazněji změněné sady imunologických genů u neutrofilů (tabulka 2, panel A) a lymfocytů (tabulka 2, panel B). Tato studie porovnávala genovou expresi v neutrofilech nebo lymfocytech mezi vzorky NLR_High and NLR_Low. Zdravé kontrolní vzorky NLR_nebyly porovnávány, protože jejich úrovně exprese se překrývaly se vzorky pacientů s NLR_vysokou a nízkou hodnotou NLR_v celém transkriptomu a významně odlišně exprimovaných genových souborech. Kromě toho zdravé kontrolní vzorky NLR_neodpovídaly věku, onemocnění a chirurgickému stavu (doplňkové obrázky 1 a 2). U neutrofilů (tabulka 2) i lymfocytů (tabulka 2) data naznačovala, že exprese genových sad souvisejících s imunitním systémem byla velmi významně odlišná, když NLR_vysoká byla srovnána s NLR_nízká . Na RNA seq má každý buněčný typ stejné nálezy jako jiný buněčný typ. V obou panelech se hladiny významnosti hlavních genových sad maximalizovaly při P < 1E-24. Tyto údaje byly vysoce významné bez ohledu na to, zda byl vyšetřován neutrofil nebo lymfocyt. Abychom se zaměřili na vysoce významnou obsahovou oblast tohoto výzkumu RNA-seq, byla zkoumána významně odlišně exprimovaná genová exprese imunoglobulinu. Za prvé, graf analýzy hlavních složek neutrofilních genů ukázal, že pro NLR_Vysoká vs NLR_Nízká, byly významně odlišně exprimované imunoglobulinové geny segregovány do 2 skupin (doplňkový obrázek 3A). Alternativně překrývaly geny lymfocytů NLR_Vysoká vs NLR_Nízká (doplňkový obrázek 3A). Dále byla porovnána kombinovaná tepelná mapa imunitně podmíněné genové exprese mezi NLR_vysokou s NLR_nízkou v neutrofilech a lymfocytech (obrázek 5). Celkově, když se prozkoumá celá tepelná mapa, je zřejmá downregulace celé genové rodiny imunoglobulinových genů ve skupině neutrofilů NLR_High ve srovnání se skupinou NLR_Low. Většina genů (69/156, 44 %) souvisela s imunoglobulinem. Pouze 12 ze 156 (7,7 %) genů souviselo s komplementem: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD a CD59. Ve skupině lymfocytů také došlo k downregulaci převážně imunoglobulinových genů v kategorii NLR_High.

Sady komplementových genů v neutrofilech a lymfocytech jsou podrobně uvedeny v tabulce 3. U neutrofilů (Tabulka 3) i lymfocytů (Tabulka 3) byla exprese genů ve 3 sadách genů souvisejících se systémem komplementu vysoce významně odlišná (P < 1E{{ 5}}), když byly NLR_vysoké vzorky porovnány s NLR_nízkými vzorky. Toto pozorování bylo stejné, ať už bylo srovnání mezi RNA z neutrofilů nebo lymfocytů. Tyto 3 sady genů zahrnují aktivaci komplementu, klasickou dráhu aktivace komplementu a regulaci aktivace komplementu. Graf analýzy hlavních složek neutrofilních genů opět ukázal, že pro NLR_Vysoká vs NLR_Nízká, byly významně odlišně exprimované geny komplementu segregovány do 2 skupin (doplňkový obrázek 3B). Alternativně se překrývají lymfocytární geny NLR_Vysoká vs NLR_Nízká (doplňkový obrázek 3B).

Obrázek 5. Tepelná mapa významně odlišně exprimovaných genů v souboru imunoglobulinových genů v neutrofilech (vlevo) a lymfocytech (vpravo). Geny uvedené na pravé straně každé tepelné mapy jsou členy imunoglobulinu

Tepelná mapa exprese neutrofilů a lymfocytů sady genů souvisejících s komplementem srovnávající NLR_Vysoká s NLR_Nízká je znázorněna na obrázku 6. U neutrofilů byl enormní počet genů downregulován v NLR_Vysoká populace. V této sadě genů, podobně jako v sadách imunoglobulinových genů, byla většina genů (69/ 86, 80 %) příbuzná s imunoglobulinem. Pouze 12 z 86 (14 %) byly komplementové komponenty a regulační geny (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH a CFD). Ve skupině lymfocytů bylo celkově méně expresí komplementových genů a imunoglobulinové geny byly mírně více downregulované ve skupině NLR_High. Protože existuje větší porozumění genům komplementového systému ve srovnání s geny imunoglobulinových systémů, pozornost byla zaměřena na komplementový systém jako potenciálního kandidáta na cílové geny související s vysokou a nízkou NLR. Byla připravena složená tepelná mapa porovnávající NLR_High s NLR_Low ukazující expresi systému komplementu a příbuzných genů ve vzorcích neutrofilů i lymfocytů (obrázek 7). Lymfocyt z větší části není rezervoárovým buněčným systémem pro systém komplementu. Většina komplementových genů není v lymfocytech upregulována. Byly přítomny pouze C1S, CR2, C5, C8G, C5 a CFB s rozdílem v expresi mezi NLR_vysokými a NLR_nízkými lymfocyty (obrázek 7). CD81 v lymfocytech je B-buněčný tetraspanin. Exprese C1S a C8G se zdají být významně vyšší u lymfocytárního NLR_Vysoká než u lymfocytárního NLR_Nízká, podobně jako u KLKB1, genu pro plazmatický prekalikrein.

Naproti tomu u neutrofilů NLR_High vykázala downregulaci genů složky komplementu C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 a C3AR1 a jejich genů pro regulaci komplementu (inhibiční) CD59, CFB a CFI . Pouze geny C2 a CFD byly upregulovány u pacientů s NLR_High{13}}N. CD59 a C9 jsou relativně upregulovány u neutrofilů NLR_Nízká{17}}N ve srovnání s těmi u NLR_Vysoká_N. FGFR4 je receptor růstového faktoru. CFH byla přítomna, ale nezdálo se, že by byla ovlivněna neutrofilními NLR_vysoká nebo NLR_nízká. Je více exprimován v lymfocytech.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Diskuse

NLR na diferenciálním počtu leukocytů se stal široce používaným jednoduchým markerem pro rozpoznání potenciálních škodlivých výsledků u široké řady poruch, včetně CVD, solidních nádorů a zánětlivých poruch, jako je systémový lupus erythematodes a systémová skleróza. V našich vlastních retrospektivních výzkumech na pacientech s aterosklerotickým KVO jsme pozorovali, že pacienti s vysokou NLR mají vyšší pozdní mortalitu po elektivní opravě aneuryzmatu aorty, vyšší míru pozdní mrtvice/úmrtí po profylaktické karotické endarterektomii a snížené přežití bez amputace po elektivní femorální-popliteální revaskularizace, pokud je jejich NLR zvýšená.{1}} Současné výzkumy byly zahájeny s cílem najít mechanický základ pro vysokou NLR. lymfom, mnohočetné pevné nádory a zánětlivé poruchy, jako je systémový lupus erythematodes a systémová skleróza. V našich vlastních retrospektivních výzkumech na pacientech s aterosklerotickým KVO jsme pozorovali, že pacienti s vysokou NLR mají vyšší pozdní mortalitu po elektivní opravě aneuryzmatu aorty, vyšší míru pozdní mrtvice/úmrtí po profylaktické karotické endarterektomii a snížené přežití bez amputace po elektivní femorální-popliteální revaskularizace, pokud je jejich NLR zvýšená.{3}} Současné výzkumy byly zahájeny s cílem nalézt mechanistický základ pro vysokou NLR.

Tabulka 3. Sady komplementových genů v neutrofilech a lymfocytech

Abychom vyvinuli nezaujatý přístup k mechanismu (mechanismům) rozdílných účinků NLR na výsledky CV, provedli jsme RNA-seq na neutrofilech i lymfocytech od stejných pacientů. Pro tuto studii byli prospektivně shromážděni všichni pacienti s onemocněním aorty a seskupeni do kategorií NLR podle jejich výsledků. Posledních 6 vzorků v každém ze 2 buněčných typů bylo vybráno podle nejvyšší úrovně jejich RIN v připravené RNA párových vzorků neutrofilů a lymfocytů bez ohledu na pohlaví, věk nebo předchozí zdravotní stav. Jak je vidět v tabulce 1, pacienti ve skupinách NLR_Vysoká a NLR_Nízká si byli dosti podobní a odlišovali se pouze podle své NLR.

Kvalitu RNA použité v této studii ukazuje RIN a úplná segregace vzoru genové exprese mezi neutrofily a lymfocyty ve všech shromážděných skupinách pacientů (vysoká NLR, nízká NLR a kontroly) (obrázek 1). Graf analýzy hlavních komponent ukazuje, že NLR_kontrolní údaje byly v tomto vyšetřování irelevantní, protože NLR pacientů se překrývaly s NLR_vysokým a NLR_nízkým v populaci pacientů neutrofilů a lymfocytů . Analýza GSEA poskytla skvělý přehled o tom, které sady genů byly obohaceny v sadách genů GO biologických procesů, a graf rozptylové bubliny to jasně demonstroval vynesením logaritmické významnosti vs poměru počtu genů změněných k celkovému počtu genů. v genových sadách. Při přezkoumání byly soubory genů, které se oddělují od celého seznamu, ty v humorální (imunoglobulinové) imunitě a systému komplementu (tabulky 2 a 3) na základě poměru a statistické významnosti v přístupu nezaujatého objevování.

S velkým počtem zapojených genů imunoglobulinu humorální imunity je obtížné pracovat, protože důležité rozdíly mezi těmito geny nejsou dobře známy. Alternativně je o komplementovém systému známo mnohem více a zaměření na klasický komplementový systém, který je aktivován imunoglobulinem, je rozpoznatelným cílem pro zánět a onemocnění související s imunoglobuliny. Naše data naznačují, že klasické geny komplementové složky C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9 a několik regulačních genů (CD59, CFB CFI a CFH) jsou v neutrofilech pacientů downregulovány. s vysokým NLR (obrázek 7). Tato zjištění jsou zarážející ze 3 důvodů. Za prvé, zapojené geny jsou většinou geny klasické komplementové dráhy. Za druhé, u pacientů s vysokým NLR jsou tyto komplementové geny z větší části downregulovány ve srovnání s těmi u pacientů s nízkým NLR. A konečně, více F12 je exprimováno v neutrofilech ze vzorků NLR_Vysoká než neutrofilů ze vzorků NLR_Nízká. Enzymatické formy proteinového produktu F12 (faktor XII [FXII]) aktivují klasickou dráhu komplementu a neutrofilů.20 Naproti tomu PLG, gen pro plazminogen a aktivátor FXII, je downregulován v lymfocytech a neutrofilech pacientů v rámci NLR{ {21}}Vysoká, což naznačuje, že samotná aktivace FXII může být regulátorem aktivace komplementu.

Navíc se ukázalo, že klasický komplementový systém se podílí na akcelerované KVO. Komponenta komplementu 1q (C1q) je počátečním faktorem dráhy komplementu, který má důležitou roli ve vrozeném i získaném imunitním systému.21 Bylo prokázáno, že C1q má dvojí roli, pozitivní a negativní vliv na aterosklerózu.22 V klasickém cesta komplementu, C1q má protektivní roli v raném stadiu aterosklerózy tím, že reguluje molekulární signál makrofágů cestou nezávislou na komplementu, moduluje vychytávání aterogenního lipoproteinu, zprostředkovává apoptotické buňky a eliminaci buněčného odpadu.23,24 Nedávná studie Jia et al23 ukazují, že snížená hladina C1q v séru je spojena s CAD. Jiná studie Guo et al24 ukazuje, že zvýšená aktivita C1q je spojena s CAD. A konečně nedávné studie naznačují, že pacienti s diabetem se sníženým C1q mají zkrácené přežití.25 Tyto údaje ukazují, že vyšetření systému komplementu může být důležité pro pochopení zánětem zprostředkované patogeneze KVO.

Obrázek 6. Tepelná mapa významně odlišně exprimovaných genů v sadě komplementových genů v neutrofilech (vlevo) a lymfocytech (vpravo). Geny uvedené napravo od každé tepelné mapy jsou členy sady genů komplementu. RNA pochází z neutrofilů nebo lymfocytů odebraných pacientům s vysokou (NLR_vysoká) nebo nízkou (NLR_nízká) NLR. Šest jednotlivých vzorků z NLR_High je porovnáno se 6 jednotlivými vzorky z NLR_Low z neutrofilů a lymfocytů.

Obrázek 7. Složená tepelná mapa komplementu a příbuzných genů z neutrofilů nebo lymfocytů NLR_Vysoká nebo NLR_Nízká. V každé kategorii byla složená tepelná mapa připravena ze 6 jednotlivých vzorků RNA-seq z každého buněčného typu.

Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Ačkoli snížení lipidů nemělo žádný vliv na NLR, protizánětlivá léčba kanakinumabem, inhibitorem interleukinu 1, snížila NLR (P < 0,0001).26 Tyto údaje naznačují, že NLR může být markerem CVD nezávislým na lipidech a vliv statinů. Tato ad hoc analýza mnoha prospektivních randomizovaných studií naznačuje, že NLR může být nezávislým rizikovým faktorem mortality u KVO.

V této studii existují určitá omezení. Naše preparáty neutrofilů měly kontaminaci 4 % lymfocyty a 2 % monocyty pomocí průtokové cytometrie. Protože není známo, že by neutrofily syntetizovaly imunoglobulin, změny genu neutrofilního imunoglobinu by mohly být způsobeny kontaminací B buněk. Při analýze EPIC došlo k významnému zvýšení kontaminace B-buňkami vzorků NLR-Low. Toto pozorování naznačuje, že zvýšení hladiny imunoglobulinových genů ve vzorcích NLR_nízkých neutrofilů může vzniknout v důsledku kontaminace B-buňkami. Snížené imunoglobulinové geny ve vzorcích NLR_Vysoká úroveň může být způsobena zvýšeným počtem B buněk ve vzorcích NLR_Nízká hladina a nemusí být nutně snížena hladina genu imunoglobulinu ve vzorcích NLR_Vysoká. Stejně tak není známo, že by neutrofily byly buňkami produkujícími komplement. Zdrojem komplementových genů by mohla být dvouprocentní kontaminace monocyty. S použitím RNA seq dat jsme však pozorovali, že neexistuje žádný významný rozdíl v monocytové kontaminaci preparátů neutrofilů mezi NLR_nízkou a NLR_vysokou. Kromě toho provedení EPIC analýzy dat RNA-seq ukazuje, že došlo ke kontaminaci monocyty<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Stručně řečeno, hlavním zjištěním v tomto výzkumu je, že ve stavech s vysokým NLR je mnoho genů komplementových komponent a některých jejich regulátorů downregulováno v neutrofilech. Není jasné, jaký je celkový význam a stav aktivace identifikovaných down-regulovaných komplementových genů. Protože sady komplementových genů jsou nápadně sníženy, spekulujeme, že jedinci s NLR_vysokým a zkráceným pooperačním přežitím mají ztrátu hlavních CV ochranných mechanismů poskytovaných systémy komplementu. Toto hodnocení je třeba prospektivně prozkoumat v klinických studiích pro základní mechanismus (mechanismy) tohoto výsledku.

Reference

1. Ross R. Ateroskleróza – zánětlivé onemocnění. N Engl J Med. 1999;340(2):115-126.

2. Getz GS. Tematická přehledová řada: imunitní systém a aterogeneze. Imunitní funkce v aterogenezi. J Lipid Res. 2005;46(1):1-10.

3. Hansson GK, Hermansson A. Imunitní systém při ateroskleróze. Nat Immunol. 2011;12(3):204-212.

4. Duffy BK, Gurm HS, Rajagopal V, Gupta R, Ellis SG, Bhatt DL. Užitečnost zvýšeného poměru neutrofilů k lymfocytům při predikci dlouhodobé mortality po perkutánní koronární intervenci. Am J Cardiol. 2006;97(7):993-996.

5. Tamhane UU, Aneja S, Montgomery D, Rogers EK, Eagle KA, Gurm HS. Souvislost mezi přijatým poměrem neutrofilů a lymfocytů a výsledky u pacientů s akutním koronárním syndromem. Am J Cardiol. 2008;102(6):653-657.

6. Gibson PH, Croal BL, Cuthbertson BH a kol. Předoperační poměr neutrofilů a lymfocytů a výsledek aortokoronárního bypassu. Am Heart J. 2007;154(5):995-1002.

7. Fici F, Celik T, Balta S, et al. Srovnávací účinky nebivololu a metoprololu na šířku distribuce červených krvinek a poměr neutrofilů/lymfocytů u pacientů s nově diagnostikovanou esenciální hypertenzí. J Cardiovasc Pharmacol. 2013;62(4):388-393.

8. Karaman M, Balta S, Ay SA, a kol. Srovnávací účinky valsartanu a amlodipinu na hladiny vWf a poměr N/L u pacientů s nově diagnostikovanou hypertenzí. Clin Exp Hypertens. 2013;35(7):516-522.

9. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S, et al. Užitečnost poměru neutrofilů k lymfocytům při predikci dlouhodobých výsledků u akutního dekompenzovaného srdečního selhání. Am J Cardiol. 2011;107(3):433-438.

10. Bhat TM, Afari ME, Garcia LA. Poměr neutrofilních lymfocytů u onemocnění periferních cév: přehled. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2016;14(7):871-875.

11. Bhutta H, Agha R, Wong J, Tang TY, Wilson YG, Walsh SR. Poměr neutrofilů a lymfocytů předpovídá střednědobé přežití po plánované velké cévní operaci: průřezová studie. Vasc Endovasc Surg. 2011;45(3):227-231.

12. Appleton ND, Bailey DM, Morris-Stiff G, Lewis MH. Poměr neutrofilů a lymfocytů předpovídá perioperační mortalitu po otevřené elektivní reparaci aneuryzmat břišní aorty. Vasc Endovasc Surg. 2014;48(4):311-316.

13. Bath J, Smith JB, Kruse RL, Vogel TR. Poměr neutrofilů a lymfocytů předpovídá závažnost onemocnění a výsledek po výkonech na dolních končetinách. J Vasc Surg. 2020;72(2):622-631.

14. King AH, Schmaier AH, Harth KC, et al. Zvýšený poměr neutrofilů a lymfocytů předpovídá mortalitu po elektivní endovaskulární opravě aneuryzmatu. J Vasc Surg. 2020;72(1):129-137.

15. King AH, Kim AH, Kwan S, a kol. Zvýšený poměr neutrofilů k lymfocytům je spojen s horšími výsledky po karotické endarterektomii u asymptomatických pacientů. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2021;30(12):106120.

16. King AH, Kwan S, Schmaier AH, et al. Zvýšený poměr neutrofilů k lymfocytům je spojen se sníženým přežitím bez amputace po femoropopliteální perkutánní revaskularizaci. Int Angiol. 2021;40(5):442-449.

17. Racle J, de Jonge K, Baumgaertner P, Speiser DE, Gfeller D. Simultánní výčet typů rakovinných a imunitních buněk z dat hromadné exprese genu nádoru. Elife. 2017;6:e26476.

18. Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Analýza diferenciální genové a transkriptové exprese experimentů RNA-seq s TopHat a Cufflinks. Nat Protoc. 2012;7(3):562-578.

19. Palmer C, Diehn M, Alizadeh AA, Brown PO. Profily exprese genů specifických pro buněčný typ leukocytů v lidské periferní krvi. BMC Genomics. 2006;7:115.

20. Stavrou EX, Fang C, Bane KL a kol. Faktor XII a uPAR upregulují funkce neutrofilů a ovlivňují hojení ran. J Clin Invest. 2018;128(3): 944-959.

21. Dunkelberger JR, Píseň WC. Komplement a jeho role ve vrozených a adaptivních imunitních odpovědích. Cell Res. 2010;20(1):34-50.

22. Speidl WS, Kastl SP, Huber K, Wojta J. Komplement u aterosklerózy: přítel nebo nepřítel? J Thromb Haemost. 2011;9(3):428-440.

23. Jia Y, Wen W, Yang Y, a kol. Klinická úloha kombinovaného sérového C1q a hsCRP v predikci onemocnění koronárních tepen. Clin Biochem. 2021;93:50-58.

24. Guo S, Mao X, Li X, Ouyang H, Gao Y, Ming L. Aktivita C1q komplementu v séru je spojena s obstrukčním onemocněním koronárních tepen. Přední Cardiovasc Med. 2021;8:618173.

25. Cavusoglu E, Kassotis JT, Anwar A, et al. Užitečnost komplementu C1q k predikci 10-roční mortality u mužů s diabetes mellitus odeslaných na koronarografii. Am J Cardiol. 2018;122(1):33-38.

26. Adamstein NH, MacFadyen JG, Rose LM a kol. Poměr neutrofilů a lymfocytů a incidentní aterosklerotické příhody: analýzy z pěti současných randomizovaných studií. Eur Heart J. 2021;42(9):896-903.