Variace v genové expresi mezi dvěma čirokovými bicolorovými liniemi lišícími se vrozenou imunitní reakcí

Abstraktní:

Imunita spouštěná molekulárním vzorem (MAMPs) s mikrobem je klíčovou složkou vrozené imunitní odpovědi rostliny na rozpoznání mikrobů. Většina našich současných znalostí o MTI však pochází z modelových rostlin (tj. Arabidopsis thaliana) s poměrně menším množstvím práce s plodinami. V této práci jsme studovali oxidativní vzplanutí (ROS) spouštěné MAMP a transkripční odpověď ve dvou genotypech Sorghum bicolor, BTx623 a SC155-14E. SC155-14E je řada, která vykazuje vysokou odolnost proti antraknóze a řada BTx623 je citlivá na antraknózu. Naše výsledky odhalily jasné rozdíly v genové expresi a ROS v reakci na elicitaci bičíku (flg22) nebo chitinu mezi těmito dvěma liniemi. Zatímco transkripční odpověď na každý MAMP a v každé linii byla jedinečná, existoval zde značný stupeň překrývání a my jsme byli schopni definovat základní sadu genů spojených s transkripční odpovědí čiroku MAMP. Analýza obohacení GO termínu a KEGG dráhy objevila více DEG souvisejících s imunitou a rezistencí patogenů ve vzorcích SC155-14E ošetřených MAMP než v BTx623 se stejnou léčbou. Výsledky poskytují základ pro budoucí studie k prozkoumání cest přirozené imunity u čiroku, včetně úsilí o zvýšení odolnosti vůči chorobám.

Kliknutím zakoupíteprodukt na zlepšení imunity

    For more information:1950477648nn@gmail.com

Klíčová slova:

Sorghum bicolor; ROS; imunita; MAMPs; RNA-seq; genová exprese

1. Úvod

Rostliny jsou přirozeně vystaveny různým stresům, včetně mnoha bakteriálních, plísňových a virových patogenů [1]. Rostliny se chrání před patogeny pomocí předem vytvořených struktur a chemikálií a reakcí imunitního systému vyvolaných infekcí. Imunitní systém rostlin využívá dvouúrovňový systém vnímání se dvěma vzájemně propojenými vrstvami receptorů.

První vrstva je aktivována povrchově lokalizovanými receptory pro rozpoznávání vzorů (PRRs), které snímají molekuly mimo buňku rozpoznáním invazního patogenu prostřednictvím detekce konzervovaných strukturních motivů, nazývaných Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMPs), které spouštějí střední, ale široká, obranná reakce [2]. Flagellin, chitin, lipopolysacharidy, peptidoglykany (PGN) a elongační faktor Tu jsou příklady dobře prostudovaných MAMP [3–5]. Tato obranná odpověď se nazývá MAMPtrigged imunita (MTI) [6]. Druhá vrstva obrany známá jako efektorem spouštěná imunita (ETI) nastává v reakci na specifické efektorové proteiny odvozené od patogenů, které jsou rostlinou rozpoznávány působením proteinů rezistence, což vede k silné, ale vysoce specifické imunitní reakci. ETI lze často rozpoznat indukcí lokalizované buněčné smrti označované jako hypersenzitivní odpověď (HR) [7]. Systémy MTI i ETI snímají patogeny a reagují aktivací antimikrobiální obrany v infikované buňce a sousedních buňkách [3,8]. Rostliny také nesou imunitní receptory, které rozpoznávají vysoce variabilní efektory patogenů, mezi ně patří proteiny třídy NBS-LRR [9].

Kromě toho je systémová získaná rezistence (SAR) reakcí rezistence „celé rostliny“, ke které dochází po dřívější lokalizované expozici patogenu. SAR je spojena s indukcí širokého spektra genů (geny související s patogenezí) a aktivace SAR vyžaduje akumulaci endogenní kyseliny salicylové (SA) [10].

Studie provedené primárně pomocí Arabidopsis ukázaly, že MTI může způsobit různé reakce včetně změn v produkci reaktivních forem kyslíku (ROS), reaktivních forem dusíku, jako je oxid dusnatý (NO), ukládání kalózy, hladiny intracelulárního vápníku, tok iontů plazmou. membrána, indukce nebo represe exprese několika genů souvisejících s obranou rostlin, změny v rostlinné buněčné stěně, indukce antimikrobiálních sloučenin a syntéza proteinů souvisejících s patogenezí (PR) [3,11].

Ačkoli některé z těchto reakcí MTI lze považovat za obecné reakce rostlin, jejich rozsah může být specifický pro rostlinný druh a dokonce i pro kultivar [12–17]. Byly vyvinuty metody pro kvantifikaci MTI reakce rostlin. Tyto metody zahrnují měření produkce ROS nebo NO, mitogenem aktivovanou fosforylaci proteinkináz, specifickou MAMP indukovanou genovou expresi, inhibici růstu semenáčků, lignin a fenoly vázané na buněčnou stěnu a MAMP-indukovanou rezistenci vůči bakteriálním a houbovým patogenům [18–20].

Sorghum bicolor (L.) Moench je klíčová celosvětová obilnina, která byla přizpůsobena řadě stanovišť a vyšlechtěna pro různé účely [21]. Očekává se, že pěstování čiroku celosvětově podstatně vzroste jako jedné z hlavních plodin pro výrobu potravin a biomasy [22].

S rostoucí praxí a geografickými oblastmi pěstování čiroku je nevyhnutelné, že se zvýší tlak chorob. Čirok se mezi ostatními obilovinami vyznačuje neobvykle širokým spektrem chorob, což je jedna z nejdůležitějších omezení jeho produkce. Celosvětově rozšířené houbové choroby jsou nejničivějšími chorobami čiroku, které mají za následek obrovské ztráty na výnosu, a to jak z hlediska množství, tak kvality zrn [23]. Antraknóza je jednou z nejzávažnějších houbových chorob ovlivňujících výnos zrna čiroku a produkci biomasy. Ztráty na výnosu způsobené tímto patogenem mohou být u náchylných kultivarů 50 až 70 procent [24,25]. Rostliny vyvinuly různé obranné strategie pro boj proti invazi patogenů. U čiroku tyto strategie zahrnují aktivaci PR proteinů [26], akumulaci peroxidu vodíku [27] a biosyntézu flavonoidních fytoalexinů [28]. Ke studiu rezistence čiroku, identifikaci obranných sloučenin a identifikaci fyzických bariér proti antraknóze byly použity různé přístupy (přehled viz odkaz [29,30]). Studie genové exprese byly široce používány k identifikaci kandidátních genů rezistence v rostlinách na základě rozdílné exprese mezi rezistentními a citlivými kultivary nebo neočkovanými rostlinami a rostlinami naočkovanými patogeny (např. odkazy [31–37]). Wang et al., [37] provedli transkriptomickou analýzu ke studiu odpovědi kultivaru čiroku BTx623 na C. subline-ola. Uvedli, že geny zapojené do metabolismu fenylpropanoidů a biosyntézy sekundárních metabolitů byly identifikovány jako odlišně exprimované v reakci na infekci patogenem ve srovnání s nenaočkovanými kontrolními rostlinami.

Tyto experimenty však byly prováděny se sazenicemi náchylného kultivaru BTx623. Další transkriptomické studie pro srovnání odpovědi genové exprese na patogen u citlivých a rezistentních kultivarů čiroku by byly cenné. Proto je důležité porozumět genetické architektuře kontrolující rezistenci vůči bazálnímu onemocnění čiroku a její spojení s kvantitativní odolností vůči chorobám.

Jako první krok v tomto směru jsme nedávno provedli screening souboru různých zárodečných plazmat čiroku na variace v jejich odpovědi na elicitaci flg22 a chitinu a také na rezistenci k houbovým chorobám [38]. V tomto případě byl MTI kvantifikován měřením produkce ROS po vyvolání MAMP. Mezi výsledky této dřívější studie byla identifikace genotypů čiroku, které vykazovaly buď silnou nebo slabou reakci na vyvolání MAMP.

Vysoce výkonné sekvenování a studium transkriptomů nové generace může pomoci objasnit reakce na houbové infekce v rostlinách a zvýšit porozumění reakcím hostitele. Analýzy transkriptomů byly široce používány ke studiu reakcí rostlin na plísňovou infekci u mnoha druhů rostlin včetně obilnin (např. odkazy [31–37]).

Publikované údaje o srovnávací transkriptomové analýze obilných plodin se však primárně zaměřily na reakci na různé patogeny. U čiroku se několik publikací zaměřilo na srovnání transkriptomů rostlin ošetřených různými patogeny, včetně antraknózy [35,37]. Některé předchozí publikace naznačovaly, že neexistuje žádná významná korelace mezi odpovědí na MAMP a plísňovým onemocněním. Například Zhang a kol. [17] uvádějí silnou korelaci mezi odpovědí na dva MAMPs flg22 a chitinem v populaci mapující kukuřici, ale žádnou shodu s odpovědí na plísňové onemocnění. Kimball a kol. [38] také uvedli nízkou korelaci mezi skóre reakce ROS indukované flg{5}} a skóre rezistence vůči cílové skvrnitosti listů u dvou populací RIL čiroku včetně populace BTx623/SC155-14E. Proto jsme vzhledem k nedostatku dat považovali za důležité transkripčně profilovat odpověď čiroku na léčbu MAMP.

V této aktuální zprávě rozšiřujeme naši dřívější analýzu měřením globální transkripční reakce na elicitaci MAMP. Použili jsme analýzu sekvenování RNA na bázi Illumina k průzkumu transkripčních změn v reakci na léčbu flg22 nebo chitinem v genotypech čiroku BTx623 a SC155-14E, které jsme dříve charakterizovali jako slabé, respektive silné MTI respondéry. BTx623 je referenční linie genomu Sorghum bicolor [22] a SC155-14E je linie vykazující zvýšenou rezistenci k antraknóze [39]. Patil a kol. [39] uvedli, že SC155-14E vykazoval vysokou úroveň stabilní rezistence (téměř bez onemocnění) vůči antraknóze ve všech testovaných prostředích, zatímco BTx623 je k této houbové chorobě citlivý. Naše RNA-seq analýza identifikovala 5252 a 8085 diferencovaně exprimovaných genů (DEGs) v BTx623 ošetřených flg22 a chitinem, v daném pořadí, a 3849 a 5786 DEGs v flg22 a chitinem ošetřených SC155-14E, v tomto pořadí, ve srovnání s neléčenými falešnými kontrolami těchto dvou genotypů.

Kromě toho srovnání stupňů vybraných pomocí dvou různých bioinformatických potrubí ukázalo velmi podobné výsledky. Profily exprese odlišně exprimovaných genů, analýza obohacení genové ontologie (GO) a analýza obohacení KEGG dráhy ukázaly jasnou genotypovou variaci v genové expresi související s MTI. Výsledky obohacení GO termínu a KEGG dráhy odhalily více DEG souvisejících s imunitou a rezistencí patogenů (geny PR, odpověď genů na chitin, odpověď genů na kyselinu salicylovou, odpověď genů na stres atd.) prezentovaných v SC léčených MAMP{{4} } Vzorky E ve vztahu k BTx623 ošetřenému MAMP. Výsledky poskytují základ pro identifikaci různých složek odpovědi MTI čiroku.

2. Výsledky a diskuse

2.1. Variace oxidačního vzplanutí v různých listech čiroku

Naše předchozí analýza MTI odpovědi různých genotypů čiroku odhalila významnou variaci v oxidativním vzplanutí spouštěném MAMP mezi genotypy BTx623 a SC155-14E [38]. Navíc SC155-14E je linie vykazující vysokou antraknózu, zatímco linie BTx623 je citlivá na antraknózu [39]. Z těchto důvodů byly tyto dva genotypy vybrány pro srovnání pomocí RNA-seq.

Při provádění dřívějších měření ROS jsme našli významné odchylky dokonce i ve stejné továrně, což nás vedlo k pečlivějšímu zkoumání zdroje této odchylky. Konkrétně jsme testovali produkci ROS pomocí tří sad listů, jdoucích zespodu nahoru na patnáct dní starých rostlinách BTx623 a SC155-14E. Listy byly označeny jako #1, #2 a #3, zdola nahoru, jak je znázorněno na obrázku 1A. Výsledky testu ROS (obrázek 1B) odhalily, že: (1) úroveň produkce ROS byla nižší ve starších listech (list č. 1), zatímco nejvyšší úrovně produkce ROS v reakci na flg22 nebo chitin byly z nejmladších listů ( list #3). (2) Jak BTx ošetřené MAMP, tak neošetřené BTx623 2 a nejmladší listy (list #2) produkovaly srovnatelně nízké úrovně produkce ROS.

Naproti tomu 2. nejmladší listy SC155-14E ošetřené MAMP produkovaly významně (na úrovni 0.01) vyšší úrovně produkce ROS než neošetřené falešné, stejně jako ošetřené nebo falešné BTx{ {5}}. nejmladší listy. (3) Oxidační vzplanutí vyvolané aplikacemi flg22 nebo chitinu bylo detekováno v listových terčíkech z nejmladších listů (list #3) obou genotypů, ačkoli, jak bylo dříve pozorováno, hladiny produkce ROS byly vyšší u SC léčených MAMP 155-14E vzhledem k BTx623. Časový průběh produkce ROS spouštěné flg22-a chitinem spouštěné v SC155-14E 2. nejmladší list odhalil, že produkce ROS spouštěná chitinem nastala dříve než produkce ROS spouštěná flg22- (obrázek 1C ). Podobné výsledky uvedli Zhang et al. [17] kde se produkce ROS spouštěná chitinem objevila dříve než produkce ROS spouštěná flg22-u sazenic kukuřice ošetřených flg22 a chitinem. Bylo publikováno [40], že produkce ROS v reakci na flg22 vykazovala nejvyšší produkci ROS kolem 12 minut a byla nejnižší po 30 minutách u Arabidopsis. Výsledky našeho testu ROS v čiroku ukázaly nejvyšší produkci ROS kolem 13 minut a nejnižší po 30 minutách po ošetření flg22, což je velmi podobné výsledkům u Arabidopsis. Protože naším cílem bylo najít optimální podmínky pro srovnání MTI odpovědi obou genotypů, vybrali jsme pro extrakci RNA a následnou transkriptomickou analýzu 2. nejmladší listy 15-den starých rostlin. Rozdíly mezi listy jednotlivých rostlin čiroku jsou připomínkou toho, že výsledky se mohou mezi experimenty lišit v závislosti na zdroji, načasování a dalších vlastnostech daného experimentu, a proto je třeba pečlivě kontrolovat experimentální parametry.

Oxidační vzplanutí, rychlá, přechodná, produkce reaktivních forem kyslíku (ROS), je jedním z prvních pozorovatelných aspektů obranné reakce rostliny [41]. Vzhledem k tomu, že vzplanutí ROS je okamžitá reakce, očekává se mírně pozdější transkripční odpověď genů souvisejících s MTI. Vzorky jsme sklidili 60 minut po ošetření MAMP pro analýzu RNA-Seq.

2.2. Diferenciálně vyjádřené geny (DEGs) BTx623 a SC155-14E v reakci na léčbu MAMP

Pro vyhodnocení úrovně exprese anotovaných genů kódujících protein Sorghum bicolor pro každý vzorek se vypočítal počet čistých čtení RNA-seq, která byla mapována na každý gen, a poté se normalizoval do FPKM (fragmenty na kb exonový model na milion mapovaných fragmentů). Byly zkoumány změny exprese každého genu v terčíkech listů BTx623 a SC155-14E ošetřených MAMP ve srovnání s falešným (vodným) ošetřením. Celkové exprimované geny byly podobné ve všech ošetřeních obou genotypů: 27 171, 27 283, 27 161, 27 182, 27 512 a 27 175 genů exprimovaných v simulovaném BTx623, flg22-ošetřené BT3, BTkx62{2, BTchix62{2 {22}}E, SC22-ošetřené flg155-14E a SC155-14E ošetřené chitinem. Pro mapování čtení v obou liniích jsme použili referenční genom BTx623, protože konkrétní reference pro SC155-14E není k dispozici. Čísla exprimovaných genů získaná z BTx623 a SC{{30}}E se všemi výše uvedenými podmínkami odhalila, že obě linie sdílely podobný počet exprimovaných genů. Celková četnost mapování čtení vzorků SC155- 14E mock (3 replikáty), SC155-14E ošetřených flg22 (3 replikáty), SC155-14E ošetřených chitinem (3 replikáty) , BTx623 simulovaný (3 replikáty), BTx623 ošetřený flg22 (3 replikáty), BTx623 ošetřený chitinem (3 replikáty) byly: 93,6 procenta, 93,9 procenta, 93,9 procenta, 93,8 procenta, 93,9 procenta, 93,55 procenta, 93,9 procenta, 9,55 procenta , 93,1 procent , 96,9 procent , 97.0 procent , 97.0 procent , 97,2 procent , 96,8 procent , 97.0 procent , 96,9 procent , 97.0 procent , 97,0 procent , v uvedeném pořadí. Tyto výsledky naznačují, že různé účinky léčby MAMPs na transkriptomy BTx623 a SC155-14E nebyly způsobeny rozdíly v genomové sekvenci mezi těmito dvěma genotypy

Graf genové exprese PCA poskytuje pohled na asociaci mezi vzorky. Abychom prozkoumali podobnost našich vzorků, provedli jsme analýzu PCA. Ukázkové vynesení na PC1 a PC2 (obrázek 2) ukázalo, že čtyři experimentální podmínky (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_chitin a SC{ {10}}E_chitin) byly široce odděleny. Naproti tomu tři biologické replikáty každé čirokové linie a každé ošetření MAMP, stejně jako falešné ošetření, byly těsně seskupeny, v daném pořadí, což ukazuje na dobrou reprodukovatelnost mezi biologickými replikáty (obrázek 2).

Grafy sopek na obrázku 3 ukazují genovou expresi ve dvou liniích čiroku ošetřených flg22 nebo chitinem. Sopečný graf je typ bodového grafu, který ukazuje statistickou významnost (p-hodnota) versus velikost změny (násobná změna). Umožňuje rychlou vizuální identifikaci genů s velkými změnami, které jsou rovněž statisticky významné. Mohou to být biologicky nejvýznamnější geny. Na obrázku 3 jsou geny s −log10 (p-hodnota) rovnou nebo větší než 3 považovány za stupně. Červené barevné tečky představují stupně a černé barevné tečky představují jiné než stupně. V každém grafu jsou geny s log2 (násobek{10}}změny) větší než 0 up-regulované geny, jinak down-regulované geny. Nejvíce up-regulované geny jsou směrem doprava, nejvíce downregulované geny jsou směrem doleva a statisticky nejvýznamnější geny jsou nahoře.

Odlišně exprimované geny (DEG) byly vybrány z každého ošetření podle jejich významnosti exprese (p-hodnota 0.001). Je třeba poznamenat, že pro výběr stupňů v tomto přehledu jsme použili p-hodnotu 0.001 jako náš práh, ale ne FDR (q-values). FDR (hodnoty q) byly na této úrovni také významné (tabulky S2–S5). Při hodnotě p 0,001 byly FDR 0,0039, 0,0051, 0,0025 a 0,0035 pro BTx623 s ošetřením flg22, SC155-14E s ošetřením flg22, BTx623 s ošetřením a SC{{chitinem 26}}E s ošetřením chitinem, resp. P-hodnoty a q-hodnoty genů BTx623 a SC155-14E za všech podmínek jsou uvedeny v tabulkách S2–S5. Analýzou vzorců exprese těchto genů v listech BTx623 a SC155-14E ošetřených MAMP jsme pozorovali velký počet genů (14–30 procent z celkového počtu exprimovaných genů), které vykazovaly velké rozdíly po flg22 nebo chitinu. ošetření v obou čirokových liniích. Počet celkových DEGs chitinem ošetřených BTx623 (8085) byl velmi blízký počtu uváděnému v předchozí transkriptomové studii u BTx623 infikovaného antraknózovým patogenem C. subline-ola (8078) [37]. Počty DEG byly vyšší u listů BTx623 ošetřených flg22 (19 procent) nebo chitinem (30 procent) ve srovnání s SC155-14E (14 procent a 21 procent, v tomto pořadí).

Ačkoli vyšší počet DEG v BTx623 ošetřeném MAMP ve srovnání s SC155-14E byl opačný než odpověď ROS těchto dvou genotypů, není to možná překvapivé, protože odpověď ROS a odpověď genové exprese na léčbu MAMP se vyskytuje při různé doby, jsou do značné míry nezávislé a jsou zprostředkovány různými mechanismy [42,43]. Termín GO a obohacení dráhy KEGG odhalily více DEG souvisejících s imunitou a rezistencí patogenů přítomných ve vzorcích SC155-14E ošetřených MAMP. Navíc skutečnost, že počty DEG byly vyšší ve vzorcích ošetřených chitinem ve srovnání s těmi, které byly ošetřeny flg22, dobře odpovídala testům ROS reakce (obrázek 1B), kde jsme viděli silnější ROS reakci na ošetření chitinem.

Abychom prozkoumali, do jaké míry jsou geny a biologické procesy sdíleny mezi ošetřením flg22 a chitinem v BTx623 a SC155-14E, porovnali jsme jejich stupně podrobněji. Vennovy diagramy na obrázku 4A ukazují překrytí ve stupních v celkových, up- a down-regulovaných genových sadách při p-hodnotě 0,001. Z celkových 10 535° reagovala základní sada 2272 genů na ošetření flg22 i chitinem v obou liniích čiroku. Podobně z celkového počtu 5410 upregulovaných genů byla základní sada 1778 genů upregulována v obou genotypech, zatímco z celkového počtu 5125 downregulovaných genů byla základní sada 474 genů downregulována v obou genotypech. genotypy.

Zde uvedená data RNA seq byla analyzována pomocí bioinformatického potrubí s nástroji Bowtie{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 a Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) s výchozími parametry (pipeline #1). K dalšímu potvrzení výsledků testu jsme k provedení analýzy použili další potrubí (potrubí #2) s HiSat2, HTSeq a edgeR. HiSat2 je dalším vývojem TopHat2. Porovnali jsme stupně každého stavu (tj. dva genotypy ošetřené flg22 nebo chitinem, všechny, up- nebo down-regulované stupně) vybrané pomocí obou potrubí. Výsledky (obrázek 5) ukázaly, že čísla DEG vybraná pomocí obou potrubí byla velmi blízko.

Celkové stupně vybrané pro potrubí #1 vs. potrubí #2 byly BTx623_flg22: 5241 vs. 5413; SC155-14E_flg22: 3849 vs. 3476; BTx623_chitin: 8085 vs. 8320; SC155-14E_chitin: 5786 vs. 5383. Upregulované stupně vybrané pro potrubí #1 vs. potrubí #2 byly BTx623_flg22: 3074 vs. 3076; SC155-14E_flg22: 2591 vs. 2483; BTx623_chitin: 4156 vs. 4583; SC155-14E_chitin: 3486 vs. 3346. Snížené stupně vybrané pro potrubí #1 vs. potrubí #2 byly BTx623_flg22: 2152 vs. 2237; SC155-14E_flg22: 1257 vs. 993; BTx623_chitin: 3919 vs. 3757; SC155-14E_chitin: 2296 vs. 2037. Kromě toho výsledky na obrázku 5 také odhalily, že vysoké procento stupňů vybraných pomocí dvou potrubí se za všech podmínek překrývalo. Procento překrývajících se DEG čísel/DEG čísel vybraných pomocí potrubí #1 bylo 79,6 procenta a 73,7 procenta. 80,8 procenta a 74,4 procenta celkových stupňů BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitin a SC155-14E{{73} }chitin, respektive; 83 procent , 80,6 procenta , 85,3 procenta a 81,1 procenta upregulovaných stupňů BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitinu a SC{{ 88}}E_chitin, v tomto pořadí; 75,1 procenta, 59,5 procenta, 75,8 procenta a 67,4 procenta downregulovaných stupňů BTx623_flg22, SC{101}}E_flg22, BTx{104}chitinu a SC{{{ 105}}E_chitin, resp. Tyto srovnávací výsledky tedy prokázaly, že prezentovaná data RNA seq jsou správná bez ohledu na to, která ze dvou metod je použita pro analýzu.

Tepelná mapa seskupených expresních profilů DEGs BTx623 a SC155-14E ošetřených flg22 nebo chitinem pro tři biologické replikáty je ukázána na obrázku 6. Hodnoty genové exprese byly normalizovány jako z-skóre. Jak se hodnota zvyšuje, barva se mění z fialové na červenou, což naznačuje expresi genu od nízké k vysoké. Tato teplotní mapa jasně ukazuje rozdílnou regulaci genů u BTx623 a SC155-14E v reakci na léčbu flg22 nebo chitinem. Kromě toho výsledky také ukazují, že tepelné mapy tří biologických replikátů v každém stavu byly velmi blízké, což ukazuje na dobrou reprodukovatelnost mezi biologickými replikáty.

Kromě toho párová srovnání (obrázek 7A) mezi up- a down-regulovanými DEG z ošetření flg22 a chitinem ukázala, že mezi BTx623 a SC155-14E existuje velké překrývání. Mezi 3074 flg22-indukovanými geny v BTx623 bylo 83,8 procenta indukováno také v BTx623 v reakci na léčbu chitinem, zatímco z 2591 flg22-indukovaných genů v SC155-14E, {{ 16}},6 procenta také reagovalo na chitinem ošetřený SC155-14E. To možná není překvapivé, protože předchozí práce v Arabidopsis thaliana ukázaly významné překrývání v genech reagujících na různé odlišné MAMP, které definují obecné dráhy MTI [44–46].

Navíc Zhang a kol. [17] také uvedli významnou korelaci mezi flg22 a chitinovou odpovědí v kukuřici. Menší překrývání bylo pozorováno mezi listovými disky BTx623 a SC155-14E ošetřenými stejným MAMP (obrázek 7A). 64,3 procent flg22-indukovaných genů v BTx623 bylo indukováno v flg22-ošetřeném SC155-14E a 68,3 procenta chitinem indukovaných genů v BTx623 bylo indukováno v chitinem ošetřeném SC155-14 E. Podobně z 2152 genů down-regulovaných po ošetření flg22 BTx623 bylo vysoké procento (75,9 procent) také down-regulováno chitinem v BTx623. Z 1257 genů downregulovaných flg22 v SC155-14E, 70,8 procenta bylo také downregulováno chitinem v SC155-14E. Avšak pouze 29 procent flg22 downregulovaných genů v BTx623 bylo také downregulováno v flg22-léčených SC155-14E a 45 procent chitinem downregulovaných genů v BTx623 bylo downregulováno v SC155-14E ošetřeném chitinem (obrázek 7A). I když tedy došlo k významné konvergenci v MTI drahách k flg22 a chitinu ve dvou srovnávaných genotypech, data také naznačují zajímavou složitost toho, jak tyto dva genotypy reagují na různé MAMP.

2.3. Analýza funkčního obohacení genu porovnání MTI odezvy BTx623 a SC155-14E

Abychom určili funkční kategorie genů regulovaných v reakci na flg22 nebo chitin a rozdílnou odezvu dvou testovaných linií čiroku, použili jsme platformu PlantRegMap [47,48] k provedení analýzy obohacení genové sady na základě detekovaných stupňů v biologickém kategorie procesu. Obrázek 8A a B ukazuje nejvyšší GO termíny genů obohacených biologickými procesy s up-regulovanými DEG a down-regulovanými DEG z BTx623 a SC155-14E. Úplný seznam stupňů je uveden v tabulkách S6–S13. Mnoho z těchto genů je spojeno s procesy včetně stresové reakce, obranných reakcí rostlin, reakce na stimul, reakce na biotický stimul, reakce na bakterii, reakce na jiný organismus, buněčné komunikace, metabolického procesu fosforu a fosforylace proteinů.

Výsledky na obrázku 8A a B ukazují jasné rozdíly v expresi genů normálně spojených s vrozenou imunitou mezi dvěma genotypy čiroku. V těchto obohacených termínech GO byly v každé podmínce nalezeny některé jedinečné stupně s překrýváním. Například obranná reakce GO term (GO 0006952): 91 a 84 up-regulovaných stupňů bylo obohaceno o BTx623 nebo SC155-14E ošetřené flg22, v daném pořadí. V rámci těchto stupňů bylo 24 stupňů jedinečných v BTx623 a 15 stupňů bylo nalezeno pouze v SC155-14}E a ostatní byly přítomny v obou genotypech čiroku. Podobně bylo 102 a 93 up-regulovaných DEG obohaceno o BTx623 nebo SC155-14E ošetřené chitinem, v daném pořadí. V rámci těchto stupňů bylo 20 stupňů jedinečných u BTx623 a 14 stupňů bylo jedinečných u SC155-14E a ostatní byly prezentovány v obou genotypech čiroku.

V termínu GO „odpověď na chitin (GO: 0010200)“ jsme pozorovali 18 up-regulovaných DEG z celkového počtu 779 genů v této kategorii obohacených o vzorky SC155-14E ošetřené chitinem (obrázek 8 ), zatímco ve vzorcích BTx623 ošetřených chitinem nebyl obohacen žádný gen. Kromě toho bylo 16 upregulovaných stupňů obohaceno ve vzorcích SC155-14E ošetřených flg22-a 12 upregulovaných stupňů bylo obohaceno ve vzorcích BTx623 ošetřených flg22-(obrázek 8). Porovnání seznamů DEG výrazu GO "odpověď na chitin" v flg22 a chitinem ošetřených BTX623 a SC155-14E (tabulka S9) odhalilo, že DEGs obohacené o flg22 nebo chitinem ošetřené SC155- 14 E byly stejné, až na to, že chitin indukoval o dva stupně více než flg22. Naproti tomu všech 12 stupňů obohacených o flg22-ošetřené BTX623 se lišilo od stupňů indukovaných MAMPs u SC155-14E. Tyto DEGs indukované MAMPs mohou přispívat k rezistentní odpovědi antraknózy u SC155-14E, protože chitin je typická molekula MAMP z buněčných stěn hub, která vyvolává imunitní reakce rostlin. Stringlis a kol. [49] také uvedli, že sada up-regulovaných DEG byla obohacena o termín GO o „odpověď na chitin“ z chitinu, flg22 a rostlin Arabidopsis ošetřených rostlinou prospěšnou rhizobakterií Pseudomonas simiae WCS417. Matic a kol. [33] uvedli, že 21° bylo obohaceno v GO termínu "odpověď na chitin" z analýzy RNA-seq listu rýže rezistentního kultivaru, ale ne z citlivého kultivaru po infekci houbovým patogenem Fusarium fujikuroi.

Geny PR (Pathogenesis-related) se podílejí na imunitní odpovědi rostlin [50] a mají antifungální aktivitu proti mnoha fytopatogenním houbám [51]. PR-10 proteiny jsou malé, primárně kyselé, intracelulární proteiny s antifungálními vlastnostmi, které jsou spojovány s obrannými reakcemi rostlinných druhů včetně čiroku [52]. Členové genové rodiny PR-10 byli indukováni útoky patogenů u široké škály rostlinných druhů [53]. V čiroku Lo a kol. [26] uvedli, že exprese PR-10 byla indukována jako součást aktivní obrany hostitele čiroku proti listovým houbovým patogenům C. heterostrophus a C. sublineolum. Katie a kol. [54] uvedli, že několik kultivarů čiroku prokázalo významnou indukci normalizovaných relativních množství PR-10 po inokulaci houbovými sporami C. lunata a F. capsicum v polních testech. Ve skleníkových podmínkách pluchy inokulovaných rostlin vykazovaly indukci PR-10 mRNA a odpověď byla větší u dvou testovaných rezistentních kultivarů ve srovnání se dvěma vnímavými kultivary.

Naše výsledky ukázaly, že mezi identifikovanými DEG byly nalezeny čtyři geny PR-10 (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). V SC155-14E byly všechny čtyři PR-10 DEG zvýšeny působením flg22 nebo chitinem, naproti tomu v BTx623 nebyl SORBI_3001G401000 v DEGs nalezen a SORBI{{15} }G401300 (up-regulovaný) byl prezentován pouze v BTx623 s léčbou chitinem, ale ne s léčbou flg22. To naznačuje, že exprese PR genů by mohla být použita v reakci na vyšší hladiny produktu ROS po léčbě MAMPs a rezistenci proti antraknóze u SC155-14E.

Kyselina salicylová (SA) je rostlinný imunitní signál nezbytný jak pro lokální obrannou odpověď, tak pro systémovou získanou rezistenci. Hraje důležitou roli v odolnosti a obraně rostlin proti útokům patogenů [55]. U čiroku Tugizimana et al. [56] popsali kvantitativní změny v hladinách kyseliny jasmonové, konjugátů kyseliny salicylové a kyseliny abscisové v čiroku infikovaném C. subline-ola. C. subline-ola je původcem antraknózy. Genotypy čiroku se zvýšenými hladinami aminokyselin (tryptofan a tyrosin), kyseliny jasmonové a salicylových konjugátů a zeatinu byly odolnější vůči antraknóze. V této studii byl termín GO „odpověď na kyselinu salicylovou“ (GO:0009751) včetně 19 up-regulovaných DEG specificky obohacen pouze u SC155-14}E ošetřených chitinem (tabulka S9). Salicylová signální dráha by tedy mohla hrát důležitou roli v reakci na vyšší hladiny produkce ROS po léčbě MAMP a rezistenci proti antraknóze u SC155-14E.

Navíc 169 up-regulovaných stupňů bylo obohaceno v GO termické odpovědi na stres pouze u SC155-14}E léčených chitinem (tabulka S9). Další termíny GO nalezené pouze v SC155-14E ošetřeném MAMP, ale nikoli v BTx623 se stejnou léčbou, jsou sekundární metabolické procesy (GO:0019748), proces biosyntézy fosfatidylcholinu (GO:0006656) a proces biosyntézy lipidů ( GO:0008610).

Navíc 169 up-regulovaných stupňů bylo obohaceno v GO termické odpovědi na stres pouze u SC155-14}E léčených chitinem (tabulka S9). Další termíny GO nalezené pouze v SC155-14E ošetřeném MAMP, ale nikoli v BTx623 se stejnou léčbou, jsou sekundární metabolické procesy (GO:0019748), proces biosyntézy fosfatidylcholinu (GO:0006656) a proces biosyntézy lipidů ( GO:0008610).

Zkoumali jsme také složení genů, které jsou koregulovány mezi dvěma genotypy po ošetření flg22 nebo chitinem, stejně jako základní sady DEG ve všech ošetřeních a dva genotypy analýzou obohacení GO (obrázky 4B a 7B). Úplný seznam stupňů je uveden v tabulkách S14 a S15. Obrázek 4B ukazuje obohacené GO termíny základních souborů celkových, up- a down-regulovaných DEG v BTx623 a SC155-14}E se všemi ošetřeními. GO termíny související s MAMPs odpovědí a obranou rostlin (např. chitinová vazba, obranná odpověď, proteinkinázová aktivita, proteinová fosforylace, proteinová serin/threoninkinázová aktivita) byly významně obohaceny o up-regulované DEG, zatímco GO termíny biosyntetického procesu sekundárních metabolitů, vazba na ionty železa, aktivita oxidoreduktázy byla obohacena pouze o down-regulované stupně. Tento výsledek byl podobný výsledkům u Arabidopsis, kde termíny GO související s odpovědí na elicitory (flg22 peptidy z P. simile WCS417 a P. aeruginosa PAO1, chitin a bakteriální buňky P. simile WCS417) byly nejvýrazněji obohaceny o up-regulované základní sada stupňů [49].

Obrázek 7B ukazuje významně obohacené GO termíny koregulovaných (tj. up-nebo down-regulovaných v obou genotypech) sad DEG mezi BTx623 a SC155-14}E po léčbě flg22 nebo chitinem. Výsledky odhalily, že GO termíny související s MAMPs odpovědí a obranou rostlin (např. obranná odpověď, proteinkinázová aktivita, proteinová fosforylace, proteinová serin/threoninkinázová aktivita) byly obohaceny pouze o flg22 nebo chitinem upregulované DEG v obou genotypech, zatímco GO termíny Proces biosyntézy sekundárních metabolitů, vazba hemu, vazba iontů železa, aktivita oxidoreduktázy jednoho atomu kyslíku a proces biosyntézy fosfatidylcholinu byly obohaceny pouze o down-regulované sady stupňů.

2.4. Analýza KEGG Pathway Enrichment MTI odezvy BTx623 a SC155-14E

Obrázek 9 ukazuje analýzu obohacení dráhy KEGG up-regulovaných DEG nalezených ve vzorcích BTx623 a SC155-14E ošetřených MAMP pomocí online nástroje DAVID [57]. Úplný seznam stupňů je uveden v tabulkách S16–S20. Výsledky identifikují ty specifické top KEGG dráhy obohacené v důsledku aktivace MTI ve dvou genotypech čiroku. V KEGG dráze „interakce rostlina-patogen“ jsme pozorovali, že 24 upregulovaných DEG bylo obohaceno ve vzorcích SC155-14E ošetřených chitinem, zatímco žádný z DEGs nebyl obohacen ve vzorcích BTx623 ošetřených chitinem. Silnější chitinová odpověď genotypu SC155-14E koreluje s větší rezistencí tohoto genotypu vůči houbovému onemocnění antraknóza [39]. Navíc obohacení KEGG dráhy odhalilo 28 genů zapojených do biosyntézy fenylpropanoidů v SC155-14}E ošetřených flg22. Cesta biosyntézy fenylpropanoidů začíná fenylalaninem, který může být přeměněn na aromatické sloučeniny, jako jsou flavonoidy, benzenoidy, kumarin, hydroxycinnamáty a lignin [58,59]. Mnoho fenylpropanoidů a flavonoidů se podílelo na reakci rezistence na onemocnění [28,60]. Produkce fytoalexinů je hlavní obrannou reakcí proti antraknózovému patogenu C. subline-ola [28] v čiroku. 3- deoxyanthokyanidiny jsou neobvyklou skupinou flavonoidů, které jsou v čiroku známé jako fytoalexiny. Fytoalexiny jsou malé molekuly s antimikrobiální aktivitou produkované po infekci patogenem [61]. Wang a kol. [37] také zjistili, že biosyntéza fenylpropanoidů termínu KEGG byla významně obohacena o stupně C. subline-ola-infikovaných rostlin v jejich transkriptomické studii čiroku. Měli bychom poznamenat, že výsledky obohacení dráhy KEGG (obrázek 9) také ukázaly vyšší odpověď BTx623 po léčbě MAMPs v některých drahách, které by mohly hrát roli v interakcích rostlina-patogen (např. v drahách biosyntézy fenylalaninu a tryptofanu, biosyntézy antibiotik).

Kromě toho výsledky analýzy obohacení dráhy KEGG down-regulovaných DEG odhalily, že deset downregulovaných DEG bylo označeno jako „proteiny fotosyntézy-antény“ a 84 stupňů bylo označeno jako účastnící se „biosyntézy sekundárních metabolitů“ bylo obohaceno působením flg22. BTx623. Takové studie genové exprese však mohou identifikovat geny odlišně exprimované v reakci na léčbu MAMP nebo infekci patogenem, ale nezbytně neprokazují, že tyto geny jsou kritické pro rezistenci vůči specifickému patogenu. K pochopení příčinných vztahů mezi rezistencí na houby a aktivací těchto KEGG drah u obou genotypů by tedy byl zapotřebí další výzkum, jak odhalila analýza RNA-Seq.

Provedli jsme také analýzu obohacení KEGG dráhy pro základní sady DEG za všech podmínek (obrázek 4C), stejně jako společně regulované DEG mezi dvěma genotypy po ošetření flg22 nebo chitinem (obrázek 7C). Výsledky odhalily, že šest významných drah, včetně cesty interakce rostlina-patogen, bylo obohaceno pouze o up-regulované jádrové sady DEG, ale ne o down-regulované jádrové sady DEG. Podobně sedm a tři dráhy, včetně dráhy interakce rostlina-patogen, byly významně obohaceny o chitinem upregulované DEG a flg22 upregulované DEG u BTx623 a SC155-14E, v daném pořadí. Naproti tomu pouze biogeneze ribozomů v eukaryotní dráze byla obohacena o DEG regulované chitinem v obou genotypech.

2.5. Validace dat RNA-Seq pomocí kvantitativní RT-PCR vybraných genů

Abychom potvrdili data profilování genové exprese získaná pomocí RNA-seq, provedli jsme analýzu qRT-PCR, abychom vyhodnotili expresi devíti vybraných kandidátních genů. Těchto devět genů bylo vybráno na základě exprese pozorované pomocí RNA-seq ve třech kategoriích: (a) exprimované podobně v BTx623 a SC155-14E s ošetřením flg22 nebo chitinem; (b) exprimován pouze v SC155-14E léčených MAMPs, ale s extrémně nízkou expresí v léčeném BTx623 a (c) exprimován 2–21-krát vyšší v SC155-14E léčených MAMPs ve srovnání s BTx623 . Výsledky analýzy qRT-PCR (tabulka 1) odhalily úplnou shodu s úrovněmi exprese stanovenými analýzou RNA-seq pro každý z devíti hodnocených genů. Tyto výsledky nám dávají jistotu, že měření provedená pomocí RNA-seq odrážejí transkripční odpověď linií čiroku na léčbu MAMP

2.6. Závěry

V této studii jsme nejprve našli optimální podmínky pro srovnání MTI odpovědi obou genotypů testováním produkce ROS pomocí tří sad listů a vybrali jsme druhé nejmladší listy patnáctidenních rostlin pro extrakci RNA a následnou transkriptomickou analýzu. Časový průběh produkce ROS spouštěné flg22-a chitinem v čiroku linie SC155-14E (obrázek 1C) odhalil, že produkce ROS spouštěná chitinem se objevila dříve než produkce vyvolaná léčbou flg22. Získali jsme profily exprese plísňového onemocnění anthracnose-rezistentního Sorghum bicolor genotypu SC155-14E s vysokou odpovědí na léčbu MAMPs na produkci ROS a citlivého genotypu BTx623 s nízkou odpovědí na produkt ROS na léčbu MAMP během raných stádií reakce vrozené imunity.

Výsledky ukazují jasnou variaci genové exprese v čiroku genotypu BTx623 a SC155-14E v reakci na léčbu MAMP. Zatímco odpovědi na dva MAMP vykazovaly značné překrývání v každém řádku (86,6–70,8 procenta), byly odlišné. Mezi odpověďmi dvou linií na stejný MAMP byl také pozorován určitý, i když nižší, překryv (68,3–29 procent). Značný počet stupňů, 2272 z 10 535 stupňů, byl identifikován ve všech čtyřech stavech a předběžně definoval hlavní odpověď MAMP. Tento seznam genů by měl být užitečný pro ty laboratoře, které chtějí profilovat odpověď genové exprese na léčbu MAMP. Analýza RNA-seq identifikovala velké soubory odlišně exprimovaných genů v BTx623 a SC{14}}E ošetřených flg22 nebo chitinem ve srovnání s neošetřenými falešnými kontrolami těchto dvou linií. Kromě toho srovnání stupňů vybraných pomocí dvou různých bioinformatických potrubí ukázalo velmi podobné výsledky. Podrobná analýza expresního profilu těchto DEG, analýza obohacení GO a analýza KEGG dráhy odhalily jasné rozdíly v odpovědi genové exprese těchto dvou genotypů. Termín GO a obohacení dráhy KEGG objevily více DEG souvisejících s imunitou a rezistencí patogenů (geny PR, odpověď genů na chitin, odpověď genů na kyselinu salicylovou, odpověď na stres, biosyntéza fenylpropanoidů atd.) u SC léčených MAMP{{18} } Vzorky E vzhledem k BTx623 se stejným ošetřením. Tyto informace poskytují důležité základní informace o tom, jak vrozený imunitní systém této klíčové plodiny reaguje na vyvolání MAMP. Vzhledem k obecnému nedostatku informací o vrozené imunitní reakci plodin ve srovnání s modelem Arabidopsis poskytují seznamy genů a popsané metody zdroj pro další zkoumání reakce čiroku na patogeny a měly by usnadnit úsilí o konečné zlepšení odolnosti vůči chorobám u rostlin. tuto důležitou plodinu pro potraviny a biomasu.

3. Materiály a metody

3.1. Rostlinné materiály

V této studii byly použity dvě čirokové linie poskytnuté Dr. Williamem Rooneym (Texas A&M University, College Station, USA) a Dr. Stephenem Kresovichem (Clemson University, Clemson, USA). BTx623 je standardní čiroková linie s dostupnou sekvencí celého genomu [22] a SC155-14E je linie vyvinutá pro rezistenci na antraknózu [39].

3.2. ROS testy

Semena čiroku BTx623 a SC155-14E byla povrchově sterilizována (70 procent etanolu po dobu 1 minuty a poté 10 procent bělidla po dobu 10 minut, opláchnuta autoklávovanou ddH2O) a zasazena do autoklávované zalévací směsi Sunshine a naklíčena v růstových komorách ( 16 h/8 h světlo/tma, 28/26 ◦C, 60–70 procent vlhkosti). K pokusům byly použity rostliny staré patnáct dní.

V této studii byly použity dva MAMP, flg22 (Genscript katalog # RP19986) a chitin z krabího krunýře (Sigma-Aldrich, katalog # C3641). Flg22 je peptid odvozený od N-konce flagelinu rostlinných patogenních bakterií a je dobře známo, že vyvolává specifickou vrozenou imunitní odpověď u rostlin [62]. Chitin je typická molekula MAMP odvozená z buněčných stěn hub, která vyvolává imunitní reakce rostlin [3]. ROS testy byly provedeny podle Kimball et al. [38]. Pro posouzení variace v MAMP odpovědi v rámci jednotlivých genotypů, stejně jako polohy listů, byly všechny tři plně expandované listy rostlin každého genotypu hodnoceny individuálně. Listy od spodu k vrcholu patnáctidenních rostlin čiroku každého genotypu byly označeny jako list #1, #2 a #3. Pro měření produkce ROS jsme pro odběr vzorků použili pouze střední část listu. Bezprostředně po ošetření byl chemiluminiscenční signál každého vzorku zaznamenáván po dobu 30 minut pomocí Photek CCD kamery (Photek Ltd., East Sussex UK). Osm jamek sestávalo z falešného ošetření (bez MAMP) a osm jamek sestávalo z ošetření (s MAMP). V každém případě byly pro každé ošetření porovnány tři biologické replikáty s celkem 8 vzorky.

3.3. Vzorová léčba pomocí MAMP

K pokusům byly použity rostliny staré patnáct dní. Ošetření MAMP bylo provedeno tak, jak je popsáno ve Valdes-Lopez et al. [12] s drobnými úpravami. Stručně řečeno, druhý list (odshora, tj. druhý nejmladší list) z pěti rostlin pro každou linii čiroku byl oddělen a poté vakuově infiltrován autoklávovanou ddH20 po dobu 2 minut. Z vodou infiltrovaných listů každého genotypu bylo vyříznuto asi padesát listových disků o průměru 1 cm a sloučeny. Čtyřicet pět listových disků z každého genotypu bylo přeneseno do tří různých Petriho misek (15 listových disků v každé Petriho misce) a poté plaveno přes noc při teplotě místnosti na autoklávované ddH20 s deskami pokrytými hliníkovou fólií. Následující den byla voda odstraněna ze všech Petriho misek a nahrazena 10 ml ddH2O (falešná), 10 ml 1 uM flg22 nebo 10 ml 20 mg/ml roztoku chitinu. Po 60-minutovém ošetření byly falešně a MAMP ošetřené plátky listů sklizeny do různých zkumavek a okamžitě zmrazeny v kapalném dusíku. Vzorky plátků listů (pro 101 quencované "ies ied-11272) imunity BTx623 a SC155-14E s imitací, flg22 nebo chitinem, tři biologické replikáty) byly skladovány při -80 ◦C pro extrakci RNA. Všechny postupy popsané výše byly provedeny za tmavých podmínek, aby se eliminoval jakýkoli možný efekt fotosyntézy.

3.4. Extrakce RNA, sekvenování a konstrukce knihovny

Extrakce RNA byla provedena pomocí sady Direct-zol RNA Miniprep Plus od Zymoresearch (katalogové č. R2071) podle pokynů výrobce

Vysoce výkonné sekvenování bylo provedeno na University of Missouri DNA Core Facility. Osmnáct knihoven bylo zkonstruováno podle protokolu výrobce s činidly dodanými v soupravě pro přípravu vzorků s vlákny mRNA TruSeq společnosti Illumina. Koncentrace vzorku byla stanovena fluorometrem Qubit (Invitrogen) za použití testovací soupravy Qubit HS RNA a integrita RNA byla zkontrolována pomocí automatizovaného systému elektroforézy Fragment Analyzer. Stručně, mRNA obsahující poly-A byla purifikována z celkové RNA (1 ug), RNA byla fragmentována, dvouvláknová cDNA byla vytvořena z fragmentované RNA a adaptéry obsahující index se ligovaly na konce. Amplifikované cDNA konstrukty byly purifikovány přidáním kuliček Axyprep Mag PCR Clean-up. Konečný konstrukt každé purifikované knihovny byl vyhodnocen pomocí systému pro automatickou elektroforézu Fragment Analyzer, kvantifikován pomocí fluorometru Qubit za použití testovací soupravy Qubit HS dsDNA a naředěn podle standardního sekvenačního protokolu společnosti Illumina pro sekvenování na NextSeq 500. Délka sekvenování byla jednoduchá čteno na 75 bázích.

3.5. Mapování a zpracování čtení RNA-Seq

Sekvenční data představovala šest různých stavů: BTx623 s imitací, flg22 nebo chitinem a SC155-14E s imitací, flg22 nebo chitinem. Každý stav byl reprezentován třemi biologickými replikáty, výsledkem bylo celkem 18 vzorků. Nejprve byly 30 konce čtení „oříznuty“ pro adaptéry Illumina, pro nejednoznačné nukleotidy (N) a (kvůli technologii NextSeq) pro umělé poly-G (reprezentované jako G{100}) pomocí cutadapt verze 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, přístupná 21. srpna 2019) pro čtení, jejichž 30 konců se překrývá s adaptérem pro minimálně 3 báze s 90procentní identitou. Pokud po tomto oříznutí čtení obsahovalo méně než deset bází, bylo vyřazeno (spolu s jeho párovým čtením, pokud je to vhodné). Skóre kvality pro RNA seq data po oříznutí byla zkoumána pomocí FASTQC (verze 0.11.9) [63]. Pro všechny pozice ve čtení je střední skóre kvality kolem 34, což znamená, že základní přesnost volání je vyšší než 99,9 procenta. Hodnoty pro každý vzorek byly porovnány s referenčním genomem (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) s Tophat 2.1.1. Výsledné zarovnávací soubory byly poskytnuty společnosti Cufflinks 2.2.1 pro sestavení přepisů pro každý vzorek. Verze anotace použitá v tomto výzkumu byla Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. Vzorky ze stejného stavu byly sloučeny pomocí Cuffmerge. Účelem bylo poskytnout jednotný základ pro výpočet exprese genu a transkriptu v každém stavu.

3.6. Bioinformatická analýza dat RNA-Seq

Data RNA seq byla analyzována pomocí bioinformatických nástrojů Bowtie{{0}}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 a Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) s výchozími parametry. S těmito nástroji jsme použili stejné potrubí, jak je popsáno v Trapnell et al. [64]. K dalšímu potvrzení výsledků testu jsme k provedení analýzy použili další potrubí s HiSat2 (verze 2.1.0), HTSeq (verze 0.12.4) a edgeR (verze 3.26.8). HiSat2 je dalším vývojem TopHat2. Nejprve jsme použili HiSat2 k provedení zarovnání pomocí referenčního genomu Sorghum. Potom jsme pomocí HTSeq provedli počítání, kolik čtení bylo mapováno na každý gen. K tomu jsme potřebovali soubory bam vygenerované z předchozího kroku a anotaci genomu (soubor gif). Všimněte si, že referenční genom a soubory anotací jsou stejné, jaké jsme použili v původním potrubí. Nakonec jsme použili R balíček edgeR k určení odlišně exprimovaných genů v každém stavu

3.7. Identifikace diferencovaně vyjádřených genů
Sloučená sestava byla podávána Cuffdiffovi, který vypočítává hladiny exprese a testuje statistickou významnost pozorovaných změn mezi dvěma podmínkami. Porovnali jsme podmínky mezi mock vs. flg22 a mock vs. chitin pro BTx623, respektive SC155-14E. Rozdílně exprimované geny byly extrahovány pomocí 0.001 prahových hodnot p-hodnoty. Grafy vulkánů byly vytvořeny pomocí R balíčku (ggplot2 V3.3.0), aby se ukázal význam změny genové exprese u stavů BTx623 léčených flg22 nebo chitinem a SC155- 14}E léčených flg22 nebo chitinem, v daném pořadí. Genové tečky s -log10 (p-hodnota) rovnou nebo větší než tři byly považovány za DEG. V každém grafu byly genové tečky s log2 (násobek_změny) větší než nula up-regulované geny, jinak down-regulované geny.

3.8. Plot PCA

Pro prozkoumání vztahu mezi hodnotami genové exprese tří biologických replikátů každé čirokové linie a každého ošetření MAMP byly pomocí R balíčků vytvořeny grafy analýzy hlavních komponent (PCA) (ggfortify V{{0}}.4.10, ggplot2 V3 .3.0). Každá tečka představuje stav po mapování z původního prostoru rysů (genové exprese) do prvních dvou hlavních komponent. Tečky patřící ke stejnému stavu mají tendenci se shlukovat

3.9. Tepelná mapa stupňů

1 Division of Plant Science and Technology and Biochemistry, CS Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)

2 Katedra elektrotechniky a informatiky, CS Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Plant Science Research Unit, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, USA

* Correspondence: staceyg@missouri.edu