Mutace UMOD u chronického onemocnění ledvin na Tchaj-wanu

Abstraktní:UMODje prvním identifikovaným a nejčastěji mutovaným genem, který způsobuje autozomálně dominantnítubulointersticiální onemocnění ledvin(ADTKD). Nedávné studie ukázaly, že ADTKD-UMODje poměrně častou příčinouchronické onemocnění ledvin(CKD). Nicméně stav ADTKD-UMODna Tchaj-wanu zůstává neznámá. V této studii jsme identifikovali tři heterozygotyUMODmissense varianty, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp) a c.817G > T (p.Val273Phe), v celkem 221 vybraných rodinách CKD (1,36 %). Dvě z těchto missense variant, p.Cys41Arg a p.Gly60Asp, nebyly dříve hlášeny. Studie in vitro ukázaly, že obě varianty uromodulinu mají defekty v transportu buněčné membrány a vylučování do kultivačního média. Strukturní model předpovídal změněnou tvorbu disulfidových vazeb v obou variantách, ale pouze p.Gly60Asp bylo předpovězeno, že způsobí destabilizaci proteinu. Naše zjištění rozšiřují spektrum mutací a ukazují, že ADTKD-UMODpřispěl k malé, ale významné příčině CKD u tchajwanské populace.

Klíčová slova: uromodulin;chronické onemocnění ledvin(CKD); autozomálně dominantní tubulointersticiálnínemoc ledvin(ADTKD); selhání ledvin (KF).

KLIKNĚTE ZDE A ZÍSKEJTE BYLINNÉ DOPLŇKY CISTANCHE PRO ONEMOCNĚNÍ LEDVIN

1. Úvod

ADTKD je vzácné dominantní dědičné onemocnění způsobené heterozygotními mutacemi v UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] a SEC61A1 [5]. UMOD je první identifikovanou a nejčastější příčinou ADTKD a je předmětem rozsáhlého výzkumu [1,6]. Ačkoli je vzácné, ADTKD je třetí nejčastější monogennínemoc ledvinpo ADPKD a kolagenové nefropatii typu IV, ale prevalence ADTKD-UMOD zůstává nejasná a nedávné studie ukazují, že představuje až 2 % pacientů s KF nebo 0,3 % všech jedinců s CKD [7, 8]. UMOD kóduje uromodulin a je nejhojnějším proteinem v lidské moči [9]. Uromodulin je protein specifický pro ledviny produkovaný epiteliálními buňkami tlusté vzestupné končetiny Henleovy kličky a rané části distálního stočeného tubulu [10] a prostřednictvím své zóny se tvoří jako vysokomolekulární polymer. doména pellucida [11]. Kromě toho je uromodulin vysoce glykosylovaný protein se sedmi N-glykosylačními místy a štěpený na konci C-konce serinovou proteázou hepsinem, než je vylučován do tubulárního lumenu [9,12,13]. Funkce uromodulinu zahrnuje ochranu před krystalizací šťavelanu vápenatého [14], obranu proti infekcím v močových cestách uropatogenními bakteriemi [15–18] a regulaci Ca2+-K+ iontového kanálu [19]. Vlivem mutací UMOD je opožděné zrání, retence v endoplazmatickém retikulu (ER), snížená exprese na plazmatické membráně a snížená exkrece močí, což vede ke stresu ER a rozvinuté proteinové odpovědi [20–22].

Klinické fenotypy ADTKD-UMOD jsou nespecifické a zahrnují CKD, dnu, hyperurikémii, normální až mírnou proteinurii, přítomnost nebo nepřítomnost rodinné anamnézy a nejvíce postižené jedince vstupující do KF ve věku 30 až 50 let [23]. Renální histologie ukazuje tubulární dilataci nebo atrofii, zrušení nebo ztluštění tubulární bazální membrány, intersticiální fibrózu a akumulaci mutovaného uromodulinu jako polymorfní nestrukturované materiály odhalené barvením PAS [24,25].

Nejvyšší incidenci a prevalenci CKD a KF má Tchaj-wan na základě mezinárodního srovnání zprávy USRDS [26]. Žádná studie se však nezaměřila na stav ADTKD-UMOD v populaci CKD na Tchaj-wanu. V této studii jsme zkoumali prevalenci ADTKD-UMOD mutací ve vybrané kohortě CKD v jediném terciárním centru na Tchaj-wanu.

2. Materiály a metody

2.1. Jednotlivci CKD a příprava DNA

Tato studie rekrutovala 221 rodin s CKD (228 jedinců) z programu péče o CKD v Kaohsiung Medical University Hospital. Kritéria pro zařazení zahrnovala epizody dny nebo hyperurikémii s eGFR nižší než 90 ml/min/1,73 m2 před dosažením věku 40 let. Vzorky krve, informace o původu a přístup k výsledkům laboratorní práce byly získány od jednotlivců po udělení informovaného souhlasu. Studie byla provedena na základě Helsinské deklarace a schválena Institutional Review Board KMUH (KMUHIRB-G(II)-20160024). DNA ze vzorků periferní krve byla extrahována standardní metodou.

2.2. Exome sekvenování a bioinformatická analýza

Pro vytvoření knihovny exome byl použit Nextera Flex for Enrichment and Exome panel (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, USA). Výběr velikosti, zachycení sekvence, obohacení a eluce byly provedeny podle pokynů výrobce. Distribuce velikosti DNA knihoven byla poté měřena pomocí TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, CA, USA), následovalo sekvenování na Illumina NovaSeq 6000 se 150 bp čtením párového konce. Výsledná data fastq byla porovnána s referenční sekvencí lidského genomu (GRCh37/hg19) a provedli jsme volání nukleotidových variant pomocí platformy DRAGEN Bio-IT (Illumina). Soubor VCF byl analyzován v CLC Genomics Workbench (Qiagen, Germantown, MD, USA). Identifikované varianty byly označeny jako patogenní/pravděpodobně patogenní, varianta nejistého významu (VUS) nebo benigní podle klasifikace American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) pomocí softwaru VarSome a porovnávali jsme varianty, které existovaly v ClinVar , HGMD a dbSNP. Zjištěné patogenní, pravděpodobně patogenní a VUS varianty byly potvrzeny Sangerovým sekvenováním. Pro Sangerovo sekvenování byly produkty PCR purifikovány ošetřením krevetovou alkalickou fosfatázou/exonukleázou I (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) a poté podrobeny sekvenování z obou konců termocyklerovým sekvenováním za použití BigDye® terminátoru 3.1 sekvenování. kit (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) po analýze na ABI 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Segregační analýza byla provedena, pokud byla DNA dostupná od rodinných příslušníků. Exony 2, 3, 4 a 5 UMOD byly testovány Sangerovým sekvenováním u probandů 221 rodin CKD kromě rodiny DY5, která obdržela sekvenování exomů. Pro UMOD se používá NCBI Ref sekvence NM_003361.4. K očíslování nukleotidů a pojmenování mutací nebo variant byla použita standardní nomenklatura doporučená Human Genome Variation Society (http//www.hgvs.org/; přístupná 18. července 2022).

2.3. Buněčná kultura a přechodná transfekce

Buňky HEK293 (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, USA) byly kultivovány v Kaighnově modifikaci Hamova F-12 média (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlington , MA, USA) doplněné 10% tepelně inaktivovaným fetálním hovězím sérem (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 jednotek/ml penicilinu, 100 ug/ml streptomycinu (10378016, Thermo Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific, a 10 jednotek/ml interferonu (IF002, Merck/Millipore Sigma). Buňky byly udržovány při 37 °C ve zvlhčené atmosféře 5% CO2.

Přechodná transfekce buněk HEK293 byla provedena pomocí Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Stručně, 2,5 ul Lipofectamine 2000 bylo přidáno přímo do 100 ul média Optimum (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) a inkubováno po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Do směsi Lipofectamine 2000–Optimum bylo přidáno celkem 1 µg DNA a inkubováno dalších 20 minut. Směs DNA byla přidána na destičky pro kultivaci buněk s médiem bez séra po kapkách na konci inkubace. Pro zdravotní stav buněk po přechodné transfekci jsme použili LUNA-II™ Automated Cell Counter (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Korea) k detekci životaschopnosti buněk barvených trypanovou modří v jiném časovém bodě. transfekované buňky zůstaly naživu po různé nadměrné expresi uromodulinu (data nejsou uvedena).

2.4. Místně řízená mutageneze

Vektor uromodulinu divokého typu značený HA byl získán od Dr. Rampoldiho [27]. Mutační konstrukty p.Cys41Arg a p.Gly60Asp byly vytvořeny pomocí QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (200523, Agilent) podle pokynů výrobce. Mutace byly potvrzeny Sangerovým sekvenováním

2.5. ELISA a frakcionace

Prázdný vektor, uromodulin divokého typu, expresní konstrukty uromodulinu p.Cys41Arg a uromodulinu p.Gly60Asp byly přechodně transfekovány do buněk HEK293. Po přechodné transfekci bylo kultivační médium shromážděno v 8, 24 a 32 h, poté uloženo při -80 °C před měřením. Pro imunoblotování bylo kultivační médium kondenzováno pomocí Centri con (YM3, ikona, Merck/Millipore Sigma) před elektroforézou SDS-PAGE. ELISA byla použita k provedení měření uromodulinu v kultivačním médiu podle pokynů výrobce (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Stručně, kultivační médium a standardy byly zředěny v testovacím ředidle dodávaném v soupravě a přidány do jamek v duplikátech. Po 2,5 h inkubace při teplotě místnosti byly jamky promyty PBS a byla přidána biotinylovaná uromodulinová protilátka. Po 1 hodině inkubace při teplotě místnosti byly jamky znovu promyty a byla přidána sekundární protilátka streptavidin-křenová peroxidáza. Po 45 minutách inkubace při teplotě místnosti byly jamky znovu promyty a barva byla vyvinuta přidáním roztoku substrátu TMB a inkubací ve tmě při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Reakce byla zastavena přidáním zastavovacího roztoku dodaného v soupravě, následovaným okamžitým odečtením při OD450 a OD550. Koncentrace uromodulinu v kultivačním médiu byla stanovena interpolací na standardní křivce.

Poté, co bylo kultivační médium odebráno, buňky připojené ke kultivační misce pokračovaly k frakcionaci s použitím soupravy pro frakcionaci subcelulárních proteinů (78840, Thermo Fisher Scientific) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, shromáždili jsme stejná množství tří různých typů buněčného lyzátu uromodulinu a odstranili veškerý supernatant, dokud nebyl co nejsušší. Do buněčné pelety jsme přidali ledově vychlazený cytoplazmatický extrakční pufr obsahující inhibitory proteáz, inkubovali jsme 10 min při 4 ◦C za mírného míchání a poté 5 min centrifugovali při 500× g. Okamžitě jsme odstranili supernatant (cytoplazmatický extrakt) do čisté předem vychlazené zkumavky na ledu a do pelety jsme přidali ledově chladný membránový extrakční pufr obsahující inhibitory proteázy. Membránová část byla vortexována po dobu 5 s na nejvyšší nastavení a inkubována při 4 °C po dobu 10 minut za mírného míchání. Supernatant (membránový extrakt) jsme přenesli do čisté předem vychlazené zkumavky na ledu po centrifugaci při 3000× g po dobu 5 minut. Subcelulární membrána a cytoplazmatický protein byly analyzovány westernovým přenosem.

2.6. Imunoblotovací analýza

Vzorky proteinů byly odebrány z buněk pufrem RIPA (R0278, Merck/ Millipore Sigma) nebo frakcionačním krokem. Následně byla stanovena koncentrace proteinu pomocí barviva pro test proteinů (5000}006, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) a přístupu ke stejnému množství proteinu, poté separována elektroforézou na SDS-PAGE. Poté, co byly proteiny přeneseny na polyvinylidendifluoridové (PVDF) membrány (1620177, BIO-RAD), byla PVDF membrána ponořena do 5% odstředěného mléka při 1X TBST, blokována po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a třikrát promyta 1X TBST po dobu 5 minut. Dále jsme inkubovali membránu PVDF s primární protilátkou přes noc při 4 °C, promyli jsme ji třikrát 1X TBST po dobu 5 minut a inkubovali jsme ji se sekundární protilátkou po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Po inkubaci sekundární protilátky byl třikrát promyt 1X TBST po dobu 5 minut, poté jsme přidali substrátovou sadu pro zesílenou chemiluminiscenci (ECL) (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma) a detekovali proteinový signál pomocí rentgenového procesoru (MXP{{{ 19}}, KODAK, Rochester, NY, USA) na rentgenovém filmu (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Primární a sekundární protilátky byly zředěny 5% odstředěným mlékem v 1X TBST a podrobné informace jsou následující 1:2000 pro uromodulin (sc-20631, Santa Cruz, Dallas, TX, USA) a 1:20 000 pro králíka HRP 2nd protilátka (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, USA).

2.7. Predikce struktury proteinu

Dynamit byl použit pro predikci 3D struktury uromodulinu divokého typu a mutantního uromodulinu (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; přístup k datu 15. června 2022.) s použitím struktury nativního lidského uromodulinu v plné délce (Protein Databanka: 7PFP) [28]. DiANNA byla použita pro predikci disulfidické vazby (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/; přístup 16. června 2022.) divokého typu a mutantního uromodulinu [29–31].

2.8. Statistická analýza

Analytický software ImageJ analyzoval a kvantifikoval pásy western blotu. Statistické analýzy a grafy byly provedeny a připraveny pomocí softwaru GraphPad Prism8 (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, USA) a byl uveden průměr ± SEM. Pro srovnání dvou skupin byl použit nepárový t-test. Statistické výsledky byly označeny následovně: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001. Každý experiment byl opakován alespoň třikrát.

Podpůrná služba:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Prodejna:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop