Ultrazvuková extrakce fenolových kyselin, flavonolů a flavanových-3-olů ze slupek a semen muskadinových hroznů pomocí přírodních hloubkových eutektických rozpouštědel a prediktivní modelování pomocí umělé neuronové sítě
Feb 23, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
AbstraktníCílem této studie bylo prozkoumat účinnost extrakce 9 přirozených hluboce eutektických rozpouštědel (NDES) za pomoci ultrazvuku.fenolové kyseliny, flavonolya flavanové-3-oly ve slupkách a semenech hroznů muskadinových (Carlos) ve srovnání se 75 procenty etanolu. Umělé neuronové sítě (ANN) byly použity k optimalizaci obsahu vody NDES, doby ultrazvuku, poměru pevných látek k rozpouštědlu a extrakční teploty, aby se dosáhlo nejvyšších výtěžků extrakce pro kyselinu ellagovou, katechin a epikatechin. Nově formulovaný NDES (#1) se skládá z cholinchloridu:kyselina levulová: etylenglykol 1:1:2 a 20 procenta vody extrahovaly nejvyšší množství kyseliny ellagové v kůži 22,1 mg/g. Tento výtěžek byl 1{7}}násobek toho, který činil 75 procent ethanolu. Modifikovaný NDES (#3) skládající se z cholinchloridu:prolinu:kyseliny jablečné 1:1:1 a 30 procent vody extrahoval nejvyšší množství katechinu (0,61 mg/g) a epikatechinu (0,89 mg/g) ve slupce a 2,77 mg/g a 0,37 mg/g v semenech. Optimální výtěžek kyseliny ellagové v kůži při použití NDES #1 byl 25,3 mg/g (pozorovaný) a 25,3 mg/g (předpokládaný). Optimální výtěžek (katechinu plus epikatechinu) v semenech s použitím NDES č. 3 byl 9,8 mg/g (pozorovaný) a 9,6 mg/g (předpokládaný). Tato studie prokázala vysokou účinnost extrakce vybraných NDES pro polyfenoly za optimalizovaných podmínek.
Úvod
Přírodní hluboce eutektická rozpouštědla (NDES) se připravují smícháním donorů vodíkových vazeb s akceptory vodíkových vazeb ve vhodném molárním poměru [1]. Teplota tání jedné složky by měla být nižší než teplota tání druhé složky [1]. Po zahřátí a promíchání se toto médium při pokojové teplotě stává kapalinou. Ke stabilizaci a polarizaci směsi se přidá voda. Výzkum v oblasti fytochemické extrakce pomocí NDES se rozšířil díky jejich efektivní extrahovatelnosti a rozpustnosti. Nicméně při porovnávání NDES s organickými rozpouštědly hraje významnou roli více faktorů, včetně výtěžku, nákladů, výtěžnosti a toxicity. Předchozí výzkum zkoumal NDES na extrakci různých polyfenolů z různých potravinových matric. Například Bubalo et al. (2016) porovnávali 5 NDES, vodu, 70 procent metanolu (v/v) a okyseleného 70 procent methanolu (v/v), aby extrahovali antokyaniny, katechin a kvercetin-3--O-glukosid ze slupek červených hroznů. Bylo zjištěno, že nejúčinnějším extrakčním rozpouštědlem je NDES sestávající z cholinchloridu:kyseliny šťavelové (1:1) s 25 procenty vody (v/v) [2]. V jiné studii Pani´c et al. (2019) testovali 8 NDES a okyselili 70 procent etanolu a pozorovali cholin chlorid: kyselinu citrónovou (2:1) s 30 procenty vody (v/v) jako nejlepší NDES pro extrakci anthokyanů z hroznových výlisků [3]. Muškátové hrozny (Vitis rotundifolia) pocházejí z jihovýchodních států a jsou prvními pěstovanými divokými hrozny ve Spojených státech [4]. Muscadine hrozny jsou produkovány ve 12 státech a celkem asi 5000 akrů [5]. Existuje 100 odrůd muscadine hroznů a každá se liší ve fyzikálních, senzorických nebo chemických vlastnostech [4]. Mezi nimi je Carlos hojně vysazovaný muskadinový hrozen kvůli vysokým výnosům plodin a rostoucí konzistenci [4]. Hrozny Carlos muscadine jsou středně velké, bronzové barvy, silnější ve slupce a obsahují v průměru čtyři semena [6]. Hrozny Muscadine obsahují významné množstvípolyfenolyo kterých je známo, že snižují zánět [7], inhibují růst nádoru prostaty [8] a zlepšují metabolické odpovědi diabetiků [9]. Muscadine hroznové výlisky, vedlejší produkt muskadinového odšťavňování nebo výroby vína, sestávají ze slupek a semen. Předchozí výzkumná studie používala směs aceton:voda:kyselina octová (70:29,7:0,3, obj./obj.) k extrakci fenolických sloučenin ze semen, slupky a dužiny osmi kultivarů muskadinových hroznů vypěstovaných na Floridě, včetně Carlose [10]. Praktickému využití však bránilo použití hořlavých organických rozpouštědel a jejich nízká extrakční účinnost. Většina muskadinových výlisků z hroznů se stále vyhazuje jako odpad. Umělé neuronové sítě (ANN) je nelineární mapovací systém složený z různých základních procesních jednotek spojených váženými asociacemi. Tyto procesní jednotky se nazývají „neurony“ [11]. Umělé neuronové sítě je přístup strojového učení k předpovídání nebo předpovídání odezvy na základě více vstupů [11]. Předchozí výzkum aplikoval metody povrchu odezvy (RSM) pro optimalizaci a predikci extrakce. Jen málo studií však použilo ANN ke stejnému účelu. Například Sinha a kol. (2013) navrhli, že ANN má lepší předpovědní výkon než RSM při extrakci přírodního barviva ze semen Bixa Orellana (Annatto) [12]. V podobné studii Ciric et al. (2020) uvedli, že model ANN byl lepší než RSM pro predikci extrakce fenolických sloučenin z česneku [13]. Cílem tohoto výzkumu bylo prozkoumat účinnost extrakce 9 NDES pro fenolové kyseliny, flavonoly a flavan-3-oly ve srovnání se 75% etanolem za pomoci ultrazvuku. ANN byl použit k predikci a optimalizaci podmínek extrakce na fenolickém výtěžku. Hypotéza byla, že NDES se specifickým složením extrahuje vyšší množství fenolových kyselin, flavonolů a flavan{19}}olů než 75 procent ethanolu a nejvyšší účinnosti extrakce lze dosáhnout prediktivním modelováním na základě ANN.
2. Materiály a metody 2.1. Chemikálie a činidla Cholinchlorid, kyselina levulová, 1,{4}}propandiol, kyselina DL-jablečná, kyselina šťavelová, kyselina chlorovodíková a kyselina mravenčí byly získány od společnosti Acros Organics (Morris Plains, NJ, USA). Kyselina mléčná, ethylenglykol, glycin, acetonitril pro HPLC, methanol a ethanol byly zakoupeny od Fishers Scientific (Waltham, Massachusetts, USA). L-prolin a betain hydrochlorid byly zakoupeny od Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). Standardy HPLC-grade kyseliny ellagové, kyseliny galové, kyseliny ferulové, (plus)-katechinu, (-)-epikatechinu, myricetinu, kvercetinu a kempferolu byly získány od Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).
2.2. Design NDESNDES #1–2 v tabulce 1 byly navrženy v naší předchozí studii [14]. Cholinchlorid v NDES #1–2 byl vybrán jako akceptor vodíku, zatímco pro každý nový NDES byly vybrány dva různé donory vodíku. V předběžných experimentech byly stanoveny molární poměry mezi donorem vodíku a akceptorem a obsahem vody. NDES #3–9 v tabulce 1 byly vybrány z literatury, protože předchozí studie je označily za účinné NDES při extrakci polyfenolů. Obsah vody v NDES #3 byl upraven z citované literatury. K přípravě NDES byla použita metoda ohřevu [15]. Stručně, akceptor vodíkové vazby byl smíchán s každou z donorových složek vodíkové vazby v Erlenmeyerových baňkách pomocí míchací tyčinky. Směs v baňce byla uzavřena a zahřívána při 50 ◦C po dobu asi 30 min nebo dokud se nevytvořila čirá kapalina a zůstala stabilní při teplotě místnosti. Obsahy vody v tabulce 1 byly vypočteny podle konečného objemu směsí NDES. pH NDES uvedené v tabulce 1 bylo měřeno pomocí pH metru (AB15, Accumet, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 2.3. Příprava vzorku / Extrakce za pomoci ultrazvuku Zmrazené slupky a semena muskadinových hroznů (Vitis rotundifolia) (kultivar: Carlos) poskytla společnost Paulk Vineyards (Wray, Georgia, USA). Po odstranění slupek, listů nebo řapíků byly výlisky rozděleny na semena a slupky. Vzorky byly poté vysušeny pomocí vakuové sušárny (Isotemp, Model 285A, Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) při 60 ◦C a vakuovém tlaku nižším než -30 in.Hg. Dále byly vzorky homogenizovány na jemný prášek pomocí chimérického mlýnku (A1{{10}5}}00, RRH Inc., 2800 W, Zhejiang, Čína). S použitím počátečního poměru pevné látky k rozpouštědlu 1:20 (g:ml) bylo 0,50 g buď slupky muskadinových hroznů nebo semen smícháno v 10 ml NDES nebo 75% ethanolu v triplikátech. Vzorky byly poté umístěny do vodní lázně (60 ◦C) a sonikovány (VCX 1500, Sonics & Materials Inc., 1500-Watt, 50/60 Hz, Newtown, CT, USA) po dobu 30 minut při 100 procentech amplituda pro dvě kola (15 min/kolo). Dále byly vzorky okamžitě centrifugovány (Sorvall ST 8, Fisher Scientific, Suzhou, Čína) při 3260 g, dokud nebyl získán čirý supernatant. Nakonec byly supernatanty shromážděny a skladovány v mrazáku při −20 ◦C pro HPLC analýzu fenolových kyselin (kyselina ellagová, kyselina galová, kyselina ferulová), flavonolů (myricetin, kvercetin a kaempferol) a flavan{45}}olů (katechin a epikatechin). 2.4. HPLC analýzy fenolových kyselin, flavonolů a flavan-3-olů Fenolové kyseliny, flavonoly a flavan-3-oly byly analyzovány na systému HPLC (Agilent Technologies 1200, Waldbronn, Německo) podle metody popsané v Sandhu a Gu (2013) [16]. HPLC systém se skládá z binárního čerpadla, autosampleru, termostatovaného oddílu kolony, detektoru diodového pole a fluorescenčního detektoru. Extrakty z hroznových slupek nebo semen byly hydrolyzovány před analýzami fenolových kyselin a flavonolů. Hydrolýza byla provedena smícháním 1 ml extraktu se 4 ml hydrolyzačního roztoku (1,2 M HC1 obsahující 50 procent methanolu) a umístěním do vodní lázně (Precision, Model 2837, 400 W, 50/60 Hz, Thermo Scientific, Marietta , OH, USA) při 90 ◦C po dobu 80 min. Poté byly vzorky ochlazeny na 25 ◦C s následnou sonikací po dobu 5 minut. Hydrolýza extraktu nebyla pro analýzu katechinu a epikatechinu nutná. Hydrolyzované a nehydrolyzované extrakty byly před HPLC analýzami filtrovány přes 0,45 μm polytetrafluorethylenovou (PTFE) membránu. Pro analýzu kyseliny ellagové, kyseliny gallové, kyseliny ferulové, myricetinu, kvercetinu, kaempferolu, katechinu a epikatechinu bylo 10 ul nastříknuto do kolony SB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 um, Zorbax, Agilent, Santa Clara, CA USA). Mobilní fáze byly (A) 0,5% kyselina mravenčí a (B) 100% acetonitril. Průtok byl 1 ml/min s 25minutovým modifikovaným gradientem takto: 0–5 min, 10–30 procent B; 5–10 min, 30–40 procent B; 10–20 min, 40–50 procent B; 20–25 min, 50–10 procent B; následuje 5 minut ekvilibrace. Teplota kolony byla nastavena na 30 ◦C. Detekční vlnová délka byla 260 nm pro kyselinu ellagovou, kyselinu galovou a kyselinu ferulovou a 360 nm pro myricetin, kvercetin a kaempferol na detektoru s fotodiodovým polem. Excitace a emise pro katechin a epikatechin byly 230 nm, respektive 321 nm, za použití fluorescenčního detektoru. Polyfenolové sloučeniny byly kvantifikovány pomocí standardních křivek kyseliny ellagové, kyseliny galové, kyseliny ferulové, myricetinu, kvercetinu, kaempferolu, katechinu a epikatechinu. Všechny standardní křivky měly 7 bodů a R2 > 0,99. 2.5. Přizpůsobený design pro umělé neuronové sítě Čtyři nezávislé proměnné extrakce se čtyřmi úrovněmi: obsah vody (15–60 procent), doba působení ultrazvuku (5–35 minut), poměr pevných látek k rozpouštědlu (1:5–1:20) a extrakce teploty (30–60 ◦C) (tabulka S1) byly použity k optimalizaci výtěžku extrakce fenolových kyselin, flavonolů a flavan{122}}olů. Na rozdíl od klasických návrhů, jako je návrh povrchu odezvy, design založený na ANN nevyžaduje opakované běhy a preferuje jinou datovou strukturu. V naší předchozí studii [14] byla ANN spolehlivější metodou pro predikci výtěžku těžby než RSM. Proto byl v této studii vybrán ANN k předpovědi výtěžku extrakce kyseliny ellagové, katechinu a epikatechinu. Upravený návrh se 40 běhy (tabulka S2) byl vytvořen na JMP Pro (verze 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), aby poskytl data specificky pro prediktivní modelování ANN. Pro eliminaci jakéhokoli zkreslení byla použita randomizace 40 běhů. Hlavní rovnice ANN je zobrazena takto:=∑jj=1 wh jpg plus bhk, k=1toK (1) kde h je počet neuronů ve skryté vrstvě, j ak jsou počty vstupních proměnných a skrytých neuronů, p je vstupní proměnná, bh je zkreslení skryté vrstvy a wh je váha ve skryté vrstvě. Výtěžky extrakce kyseliny ellagové, katechinu a epikatechinu ve vztahu ke čtyřem nezávislým proměnným byly analyzovány pomocí ANN nejprve natrénováním dat a poté výběrem nejlepšího typu aktivace a počtu neuronů, což vede k adekvátnímu přizpůsobení dat. K vyhodnocení úspěšnosti predikčních modelů byly posouzeny tři hodnoty: R-kvadrát, druhá odmocnina střední kvadratické chyby predikce (RASE) (rovnice (2)) a průměrná absolutní chyba (AAE). RASE je RASE=̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ SSE/n √ (2) Kde SSE daruje pro druhou mocninu a součet chyby predikce (rozdíly mezi skutečnými odpověďmi a předpokládanými odpověďmi) an pro řadu pozorování. R-čtverec blízko 1 s RASE a AAE blízko nule znamená vyšší fitování dat do modelu. 2.6. Statistika Výtěžky extrakce fenolových kyselin, flavonolů a flavanolů byly porovnány s jednocestnou analýzou ANOVA následovanou Studentovým t-testem při p menším než nebo rovném 0,05 pomocí JMP Pro (verze 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Každý nde a 75 procent ethanolu byly porovnány pomocí Dunnettových testů při p menším nebo rovném 0,05. Analýza principiálních složek (PCA) byla provedena na JMP Pro (verze 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) pro fenolické sloučeniny extrahované ze slupky a semen muskadinových hroznů. 3. Výsledky a diskuse 3.1. Polyfenoly extrahované NDES ze slupek muskadinových hroznů Devět NDES a 75 procent etanolu bylo použito pro extrakci polyfenolů ze slupek muskadinových hroznů. Tabulka 2 ukazuje výtěžek extrakce kyseliny ellagové, kyseliny galové, kyseliny ferulové, myricetinu, kvercetinu, kaempferolu, katechinu a epikatechinu. Kyselina ellagová byla nejhojněji extrahovatelným polyfenolem ve slupce hroznů, následovala kyselina gallová a kyselina ferulová. Toto zjištění bylo v souladu s předchozími studiemi [17,18]. NDES #1, #8, #7, #3, #2 a #9 extrahovaly výrazně vyšší množství kyseliny ellagové ve slupce hroznů než 75 procent etanolu. Nejvyššího extrakčního výtěžku kyseliny ellagové bylo dosaženo pomocí NDES #1 následovaného NDES #8 při 22,1 ± 2,2 mg/g a 21,3 ± 2,5 mg/g, v daném pořadí (tabulka 2). Nebyl však žádný významný rozdíl mezi NDES #1 a NDES #8 podle Studentova t-testu. Je zajímavé, že bylo zjištěno, že NDES #1 je nejméně účinným NDES pro extrakci anthokyanů
brusinkové výlisky [14]. To naznačuje, že NDES #1 může selektivně extrahovat kyselinu ellagovou nebo ellagitaniny z potravinové matrice, která také obsahuje anthokyanidiny. Takovou selektivitu lze přičíst rozdílům v molekulárních interakcích mezi NDES a specifickými fenolickými třídami. Obrázek S1 (panel A) ukazuje HPLC chromatogram kyseliny gallové, kyseliny elagové a kyseliny ferulové extrahované ze slupky hroznů pomocí NDES #1 a detekované při 260 nm. 75% ethanol extrahoval 12,7 ± 1,2 mg kyseliny ellagové na gram slupky hroznů. Nejnižší extrakční výtěžek kyseliny ellagové byl pozorován u NDES #4 při 7,44 ± 0,6 mg/g. Výtěžek extrakce kyseliny gallové pomocí NDES #9, #8, #1, #4, #7 a #3 byl srovnatelný a významně vyšší než u 75 procent ethanolu. Nejvyšší množství kyseliny gallové bylo extrahováno pomocí NDES #9 při 10,4 ± 0,5 mg/g, zatímco nejnižší množství 5,55 ± 0}} 0,1 mg/g bylo extrahováno pomocí NDES #5. Nejvyšší množství kyseliny ferulové bylo extrahováno pomocí NDES #1 při 6,32 ± 0,7 mg/g a nejnižší množství bylo extrahováno pomocí NDES #5 při 3,11 ± 0.{{5{{52} }}}} mg/g. Kromě toho nebyl žádný významný rozdíl mezi NDES #1 a 75% ethanolem při extrakci kyseliny ferulové (tabulka 2). Nejvyšší množství katechinu a epikatechinu bylo extrahováno pomocí NDES #3 při 0,61 ± 0,1 mg/g a 0,89 ± 0,1 mg/ g, respektive (tabulka 2). Mezitím NDES #3 a #6 extrahovaly výrazně větší množství epikatechinu než 75 procent etanolu. Obrázek S2 (panel A) ukazuje HPLC chromatogram katechinu a epikatechinu extrahovaných pomocí NDES #3 ze slupky hroznů. V 75% ethanolovém extraktu však katechin detekován nebyl. Nejnižší množství katechinu (0.02 mg/g) a epikatechinu ({{90}},14 mg/g) byly extrahovány pomocí NDES #2 a NDES # 5, resp. Nejhojnějším flavonolem byl myricetin a nejméně kaempferol. Dunnettův test odhalil, že NDE a 75% ethanol byly srovnatelné při extrakci myricetinu, kvercetinu a kempferolu (tabulka 2). Nejvyšší množství myricetinu bylo extrahováno pomocí NDES #1 (1,84 mg/g), následoval 75% ethanol (1,73 mg/g) a poté NDES #8 (1,67 mg/g). Nejvyšší množství kvercetinu bylo extrahováno 75% ethanolem (0,41 mg/g), NDES #1 (0,40 mg/g) a NDES #8 ({ {143}},38 mg/g). Naproti tomu nejnižší množství myricetinu a kvercetinu bylo extrahováno pomocí NDES #5 při 0,87 mg/g a 0,27 mg/g, v daném pořadí. Toto zjištění dále zdůrazňuje celkově slabou schopnost NDES #5 extrahovat polyfenoly ze slupky hroznů. Nejvyšší množství kempferolu bylo extrahováno 75% ethanolem (0.05 mg/g) a nejnižší bylo extrahováno NDES #5 a NDES#6 (0,03 mg/g). Obrázek S1 (panel B) ukazuje HPLC chromatogram myricetinu, kvercetinu a kempferolu extrahovaného ze slupky hroznů pomocí NDES #1 detekované při 360 nm. Nejvyšší součet množství fenolových kyselin, flavonolů a flavanolů bylo 40,7 mg/g extrahovaných pomocí NDES #1 a následně 39,8 mg/g extrahovaných pomocí NDES #8, zatímco nejnižší součet byl 18,4 mg/g extrahovaných podle NDES #5 (tabulka 2). pH NDES se pohybovalo mezi 0,3 a 3,3 (tabulka 1). Korelace Rsquared mezi pH NDE a výtěžky fenolových kyselin, flavonolů a flavanolů je uvedena v tabulce 2. Absence korelace mezi pH a výtěžky extrakce naznačovala, že pH nemá vliv na účinnost extrakce. 3.2. Polyfenoly extrahované pomocí NDES z muskadinových hroznových semen Celkové výtěžky extrakce fenolových kyselin, flavonolů a flavan{123}}olů z hroznových semínek byly znatelně nižší než ty ze slupek (tabulka 3). Nejhojnějšími extrahovatelnými polyfenoly v semenech byly katechin a epikatechin, zatímco kaempferol nebyl detekován. Komplexní matrice semen obsahující olej (13 procent hmotnostních sušiny) je možným vysvětlením nízké extrahovatelnosti fenolických sloučenin z hroznových semen [19]. Nejvyšší množství katechinu bylo extrahováno pomocí NDES #3 při 2,77 mg/g (tabulka 3). Tento výtěžek byl významně vyšší než u všech ostatních NDES a 75 procent ethanolu. Obrázek S2 (panel B) ukazuje HPLC chromatogram katechinu a epikatechinu extrahovaných pomocí NDES #3 z hroznových jader. Nejnižší množství katechinu bylo extrahováno pomocí NDES #5 při 0,30 mg/g. Všechny NDES kromě NDES #1, #2 a #9 extrahovaly významně vyšší množství epikatechinu než 75 procent etanolu (tabulka 3). Nejvyšší koncentrace epikatechinu byly extrahovány NDES #4 (0,71 mg/g) a NDES #5 (0,68 mg/g), zatímco nejnižší byly extrahovány 75% ethanolem (0,11 mg/g). Kyselina gallová byla nejhojněji extrahovatelnou fenolovou kyselinou v hroznových semenech, následovala kyselina ferulová a kyselina ellagová. Nejvyšší množství kyseliny gallové bylo extrahováno pomocí NDES #4 při 0,45 mg/g, následované NDES #9 a NDES #8. Tyto NDE extrahovaly výrazně vyšší množství kyseliny gallové než 75 procent etanolu. Nejnižší množství kyseliny gallové (0,2 mg/g) bylo extrahováno pomocí NDES #3. Nejvyšší těžba
výtěžek kyseliny ellagové byl získán pomocí NDES #9 (0,26 mg/g) následovaný NDES #6 (0,17 mg/g), které byly významně vyšší než 75% ethanol. Podobně NDE č. 3 extrahovalo nejnižší množství kyseliny ellagové při 0.05 mg/g. Kromě toho NDES #6, #7 a #3 extrahovaly výrazně vyšší množství kyseliny ferulové než 75 procent etanolu. Nejnižší výtěžek extrakce kyseliny ferulové byl 0,5 mg/g podle NDES #5. Kromě toho nebyla v extraktu NDES #9 detekována kyselina ferulová. Bylo to pravděpodobně proto, že rozpustnost kyseliny ferulové byla nižší v NDES #9 než v jiných NDE. Nejvyšší myricetinový extrakt byl získán pomocí 75% ethanolu a NDES #7 při 0,18 mg/g, což bylo více než u všech NDE. Nejvyšší výtěžek extrakce kvercetinu byl u NDES #6 (0,14 mg/g) a NDES #3 (0,13 mg/g) a oba NDES byly lepší než 75% ethanol. Podobně pH NDES neovlivnilo výtěžek extrakce, jak naznačuje nízká korelace (R-squared) mezi pH NDE a výtěžky fenolových kyselin, flavonolů a flavan-3-olů uvedených v tabulce 3. 3.3 . Byla provedena analýza hlavních složek (PCA), aby se spojil výtěžek extrakce různých fenolických sloučenin ve slupce a semenech hroznů s NDE a 75% ethanolem (obr. 1). PCA byla provedena na korelační matici pro detekci možné selektivity některých NDE vůči extrakci specifických fenolických sloučenin nebo skupin. Asi 85 procent rozptylu kožních dat bylo vysvětleno hlavními složkami 1 a 2. Graf zatížení (obr. 1B) ukazuje vysokou korelaci mezi fenolovými kyselinami (kyselina ellagová, kyselina galová, kyselina ferulová) a flavonoly (myricetin, kvercetin, a kempferol). Pro extrakci těchto skupin jsou nejlepšími rozpouštědly NDES #1, #8, #7 a 75% ethanol, jak je znázorněno na grafu skóre (obr. 1A). Mezitím se zdálo, že katechin a epikatechin jsou segregovány od zbytku fenolických skupin. Jak je znázorněno na obr. 1A, NDES #3 byl selektivní pro extrakci katechinu a epikatechinu ze slupek hroznů. Bylo to zajímavé pozorování, protože NDES#3 patřil k nejméně účinným NDES pro extrakci proanthokyanidinů, což jsou oligomery a polymery katechinu a epikatechinu [14]. To naznačuje, že NDES #3 může být selektivní k proanthokyanidinům o menších molekulových velikostech. Shlukování fenolických sloučenin na zatěžovacím grafu slupky (obr. 1B) bylo odlišné od semen (obr. 1D) bez ohledu na nízké výnosy těchto sloučenin v semenech hroznů. První a druhá hlavní složka vysvětlily asi 73 procent rozptylu údajů o semenech. Kvercetin, myricetin a kyselina ferulová byly extrahovány účinněji pomocí NDES #6, #7 a 75% ethanolu, jak je znázorněno na grafu skóre (obr. 1C). Kyselina ellagová a kyselina gallová byly extrahovány efektivněji pomocí NDES #9. Opět byl katechin extrahován s nejvyšší účinností pomocí NDES #3, což bylo podobné jako u hroznových slupek. Epikatechin byl extrahován s vyšší účinností pomocí NDES #5, #4 a NDES #8.
3.4. Optimalizace extrakce fenolových kyselin a flavonolů ze slupek muskadinových hroznů a modelování predikce ANN Cholinchlorid: kyselina levulová: ethylenglykol 1:1:2 (NDES #1) vykázaly nejvyšší extrakční výtěžek pro kyselinu ellagovou, a proto byl vybrán pro další optimalizaci a předpověď. Pro extrakci fenolových kyselin a flavonolů byly hodnoceny dopady čtyř faktorů, včetně obsahu vody, doby působení ultrazvuku, poměru pevných látek k rozpouštědlu a extrakční teploty. Kromě toho byly použity čtyři úrovně pro každý extrakční faktor v celkem 4{121}} náhodných běhech. Experimentální výtěžek extrakce kyseliny ellagové, kyseliny galové, kyseliny ferulové, myricetinu a kvercetinu spolu se součtem těchto pěti jsou uvedeny v tabulce 4. Celkově byl rozdíl mezi výtěžkem extrakce mezi nejnižším a nejvyšším poměrně velký pro fenolové kyseliny. Například nejnižší výtěžek pro kyselinu ellagovou byl 9.{123}}3 mg/g (pokus #17) a nejvyšší byl 25,3 mg/g (pokus #15), což vedlo k rozdílu 16,2 mg/g (běh #17). Navíc nejnižší součet výtěžku byl 20},7 mg/g a nejvyšší byl 71,5 mg/g. To ilustruje významný dopad různých úrovní každého extrakčního faktoru na výtěžnost těžby. Běh č. 15 extrahoval nejvyšší množství kyseliny ellagové. Podmínky extrakce v běhu č. 15 byly 45 ml / 10{{130}} ml obsah vody, 25 minut ultrazvuku, poměr pevné látky k rozpouštědlu 1:10 (g: ml) a extrakční teplotou 60 ◦C. Obrázek S3 ukazuje HPLC chromatogram optimalizovaných fenolových kyselin extrahovaných ze slupky hroznů pomocí NDES #1 (běh #15 v tabulce 4). Nejvyšší kyseliny gallové (18,7 mg/g) bylo dosaženo za podmínek extrakce v běhu č. 24 a nejnižší bylo 6,63 mg/g při běhu č. 40. V případě kyseliny ferulové se v běhu č. 22 extrahovalo nejvyšší množství 19,2 mg/g, zatímco v běhu č. 14, #17, #29 a #34 nebyla detekována žádná kyselina ferulová. Pokus č. 22 byl extrahován 60 ml/100 ml obsahu vody, 5 minut ultrazvuku, poměr pevné látky k rozpouštědlu 1:5 a extrakční teplota 60 °C. Pokus č. 2 extrahoval nejvyšší myricetin (10,1 mg/g) a kvercetin (1,87 mg/g). Podmínky extrakce v běhu č. 2 byly 60 ml/100 ml obsahu vody, 35 minut ultrazvuku, poměr pevné látky k rozpouštědlu 1:20 a teplota extrakce 60 °C. Nejnižší můj jistý výtěžek (3,79 mg/g) byl extrahován během č. 40. Obr. Předpokládané výtěžky kyseliny ellagové v tabulce 4 byly použity pro konstrukci těchto grafů počtu. Každý panel ilustruje vliv 2 parametrů extrakce. Vrstevnice jsou označeny výtěžkem kyseliny ellagové (mg/g). Optimální předpokládaný obsah vody byl asi 35–45 ml/100 ml NDES, jak je znázorněno na obr. 2B a 2C. Delší doba působení ultrazvuku zvýšila výtěžek kyseliny ellagové (obr. 2D a 2E), což ukazuje na kritickou roli sonikace při extrakci NDES. Během extrakce, míchání hroznových slupek nebo semen s NDES zavedlo částice a plyn, což přidalo místa pro akustickou kavitaci pro ultrazvuk, aby se v NDES vytvořily četné malé bubliny. Implodování těchto bublin vedlo k extrémní teplotě, tlakovému rozdílu, vysoké smykové síle, makroturbulencím a mikromísení, což účinně promíchávalo NDES, aby urychlilo difúzi a přenos hmoty. Když kavitační bubliny implodovaly na povrchu hroznových jader nebo částic slupky, výsledné mikrotrysky a srážky mezi částicemi vedly k odlupování povrchu, erozi, rozpadu částic, sonoporaci a narušení buněk [20]. Všechny tyto mechanické účinky ultrazvukem indukované kavitace zesílily pronikání NDE do nitra buňky, takže mezibuněčné fenoly z potravinové matrice byly převedeny do rozpouštědel. Optimální poměr pevné látky k rozpouštědlu byl 1:10, jak je naznačeno na obr. 2B, 2D a 2F. Konečně se zdá, že vyšší extrakční teploty až do 60 ◦C mají pozitivní vliv na extrahovatelnost kyseliny ellagové, jak je znázorněno na obr. 2C, 2E a 2F. To naznačuje přímý vztah mezi extrakční teplotou a výtěžkem kyseliny ellagové extrahované ze slupky hroznů. Výtěžky extrakce kyseliny ellagové (tabulka 4) byly analyzovány pro predikční modelování pomocí umělé neuronové sítě. Experimentální data byla náhodně rozdělena do trénovací sady a ověřovací sady. Důvodem pro zahrnutí validační sady statistickým softwarem je potlačení nadměrného vybavení. Pro predikci výtěžku kyseliny ellagové (Y) byly hodnoceny stejné čtyři nezávislé extrakční faktory (X1, X2, X3 a X4), 1–2 skryté vrstvy s různým počtem neuronů a tři aktivační funkce. Použité aktivační funkce byly hyperbolická tečná, lineární a gaussovská. Dále byly datové soubory trénovány, dokud nebylo dosaženo vysoké hodnoty R-squared jak pro trénování, tak pro validaci. Byla vytvořena predikční data a model. Nejlepší struktura ANN byla vybrána analýzou čtyř vstupů (X1, X2, X3 a X4) s jednou skrytou vrstvou pomocí Gaussovy funkce s deseti neurony (obrázek S5). R-kvadrát trénovacích a validačních sad byl 0,99, zatímco RASE a AAE modelu byly 0,062 a 0,044. R-kvadrát ANN validace kyseliny ellagové v této studii (0,99) byl vyšší než ANN validace prokyanidinů (0,95) a antokyanů (0,91) v předchozí studii [14]. Toto zvýšení R2 však může být připsáno lépe vygenerovanému modelu přizpůsobení dat v této studii, což by mohlo být způsobeno menšími experimentálními chybami. Prediktivní modely ANN pro extrakci kyseliny ellagové pomocí NDES #1 byly ukázány jako rovnice 3–13:
Cistanche pro zlepšení imunity
Závěr
Současná zjištění přinesla další důkazy o účinnosti schopností NDES extrahovat polyfenoly z vedlejších produktů potravinářského průmyslu. Výsledky podpořily hypotézu o vynikající extrakci NDES za pomoci ultrazvuku nad 75 procenty etanolu. NDES účinně extrahoval tři fenolové kyseliny, dva flavonoly a tři flavan-3-oly z hroznových slupek a semen. NDES #1 byl nejúčinnějším NDES pro extrakci kyseliny ellagové, zatímco NDES #3 byl zvláště selektivní vůči extrakci katechinu a epikatechinu. Značnou nevýhodou NDES je jejich vysoká viskozita, která představuje problémy při manipulaci a regeneraci. V této studii umělá neuronová síť, bez ohledu na její výsledná omezení, demonstrovala praktický přístup k prediktivnímu modelování. NDE jsou robustní média pro obnovu fytochemikálií z potravinových systémů. Některé NDE také představují méně toxické rozpouštědlo pro studium těchto fytochemikálií v živých buňkách [21,22]. Konečně, přírodní hluboce eutektická rozpouštědla jsou účinnými alternativními extrakčními médii k organickým rozpouštědlům.
Reference
[1] W. Bi, M. Tian, KH Row, Hodnocení hluboce eutektického rozpouštědla na bázi alkoholu při extrakci a stanoveníflavonoidys optimalizací metodologie povrchu odezvy, J. Chromatogr. A 1285 (2013) 22–30, https://doi.org/10.1016/j. chroma.2013.02.041.
[2] M. Cvjetko Bubalo, N. ´Curko, M. Tomaˇsevi´c, K. Kovaˇcevi´c Ghani´s, I. Radojc´c Redovnikovi´c, Zelená extrakce fenolických látek z hroznové slupky pomocí hluboce eutektických rozpouštědel, Food Chem. 200 (2016) 159–166, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2016.01.040.
[3] M. Panic, V. Gunjevi´c, G. Cravotto, I. Radojc´c Redovnikovi´c, Umožňující technologie pro extrakci anthokyanů z hroznových výlisků za použití přírodních hluboce eutektických rozpouštědel v až půllitrových dávkách extrakce anthokyanů z hroznových výlisků pomocí NADES, Food Chem. 300 (2019) 125185, https://doi.org/ 10.1016/j.foodchem.2019.125185.
[4] M. Hoffmann a kol., Muscadine Grape Production Guide for the Southeast, North Carolina State University, NC State Extension Publications, 2020 https://content. ces.ncsu.edu/muscadine-grape-production-guide (přístup 18. ledna 2021). [5] Cline, B. a C. Fisk, Přehled výměry muscadine hroznů, kultivarů a produkčních oblastí na jihovýchodě USA. Muscadine Grape Workshop pro kooperativní rozšiřující agenty, v jižním regionu Small Fruit Consortium. 2006: Jižní region Small Fruit Consortium.
[6] PC Andersen A. Sarkhosh D. Huff J. Breman 2020 6 10.32473/edis-hs100-2020.
[7] P. Greenspan a kol., Protizánětlivé vlastnosti hroznů muskadinových (Vitis rotundifolia), J. Agric. Jídlo. Chem. 53 (22) (2005) 8481–8484, https://doi.org/ 10.1021/jf058015.
[8] DN Ignacio, KD Mason, EC Hackett-Morton, C. Albanese, L. Ringer, WD Wagner, PC Wang, MA Carducci, SK Kachhap, CJ Paller, J. Mendonca, L. Li Ying Chan, Bo Lin, DK Hartle, JE Green, CA Brown, TS Hudson, extrakt z hroznové kůže Muscadine inhibuje buňky rakoviny prostaty tím, že indukuje zastavení buněčného cyklu a snižuje migraci prostřednictvím proteinu tepelného šoku 40, Heliyon 5 (1) (2019) e01128, https://doi .org/10.1016/j.heliyon.2019.e01128.