Tubulosid B z Cistanche Salsa zachraňuje neuronové buňky PC12 před apoptózou a oxidačním stresem indukovanou 1-methyl-4-fenylpyridiniovými ionty

Úvod

Patologicky je sporadická Parkinsonova nemoc (PD) typicky charakterizována ztrátou katecholaminergních neuronů, zejména dopaminergních neuronů substantia nigra pars compacta (SNc), a přítomností charakteristických intraneuron| inkluze zvané Lewyho tělíska v postižených oblastech mozku. Navzdory řadě faktorů, které se podílejí na patogenezi PD, zůstávají mechanismy podílející se na iniciaci a progresi PD nejisté. Přestože příčina PD zůstává zodpovězena, několik linií důkazů silně naznačuje účast oxidativního stresu, což nakonec vede k neuronální smrti nebo apoptóze nadměrnou tvorbou volných radikálů. Tuto hypotézu dále podporuje skutečnost, že nigrální dopaminergní systém může produkovat vysoké hladiny volných radikálů a má relativně nízké hladiny oxidačního obranného systému. Studie in vivo i in vitro prokázaly neurotoxicitu zprostředkovanou oxidativním stresem MPP＋, aktivního metabolitu l-methyl-4-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridinu (MPTP) na dopaminergních neuronech. Zapojení volných radikálů nadměrně produkovaných oxidačním stresem jako bezprostřední příčina neurodegenerativních poruch, jako je PD, naznačuje klíčovou roli antioxidantů. Tubulosid B (obr. 1) byl jednou z fenyletanoidových sloučenin izolovaných ze stonků Cistanche salsa. Předchozí studie zjistily, že mnoho fenylethanoidů včetně tubulosidu B vykazovalo silnou aktivitu pohlcující volné radikály.

S ohledem na tato zjištění jsme v této studii zkoumali účinek tubu]nsidu B na MPP+-indukovanou neurotoxicitu in vitro pomocí feochromocytomové buněčné linie sympatického nervu PC12, která byla v průběhu let úspěšně používána ke studiu neuronální funkce.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO PREVENCI PARKINSONOVY NEMOCI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiály a metody

Materiály

Tubuloside B od Cistanche Salsa laskavě dodal Dr. Li Lei (Department of Natural Products, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Peking, Čína). Čistota sloučeniny byla podle analýzy HPLC více než 98 %. Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM), koňské sérum a fetální telecí sérum byly zakoupeny od GIBCO BRL, 1-methyl~-fenylpyridionium ion (MPP+ ), poly-L-lysin, 3-(4,{ {8}}dimethylthiazol-2 -yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), propidiumjodid (PI), RNáza A, proteináza K a 2; 7'-dichlorfluorescein diacetát (DCFH-DA) byly zakoupeny od Sigma.

Buněčná kultura

PCI2 buňky byly udržovány v DMEM doplněném 10% koňským sérem, 5% fetálním telecím sérem, 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu. Buňky byly kultivovány ve zvlhčeném inkubátoru provzdušňovaném 95% vzduchem a 5% CO2 při 37 stupních. Všechny experimenty byly provedeny 24-48 h po naočkování buněk. Buňky byly rutinně sklizeny trypsinizací 0,25 %, když se buňky přiblížily subkonfluentnímu stádiu, a umístěny do 25 cm kultivačních lahví rozdělených v poměru 1:8.

Analýza životaschopnosti buněk

Životaschopnost buněk byla stanovena pomocí modifikovaného testu MTT, jak bylo popsáno dříve [10]. Stručně řečeno, buňky PC12 byly nasazeny na 96-jamkové destičky v hustotě 1 x 104 buněk na jamku. Kultury byly pěstovány po dobu 48 hodin a poté bylo médium vyměněno za médium obsahující různé koncentrace burnside B nebo MPP＋. Po inkubaci po dobu až 48 hodin a 72 hodin byl do 96-jamkových destiček přidán roztok MTr (5 mg/ml v DMEM) a buňky byly ponechány inkubovat 4 hodiny při 37 stupních. Poté, co bylo médium odstraněno, byly buňky a krystaly barviva rozpustné přidáním 200 ul DMSO a absorpce byla měřena při 570 nm (540 nm jako reference) pomocí modelu 550 čtečky mikrodestiček (Bio-Rad). Životaschopnost buněk byla také analyzována za použití vylučovací metody trypanové modři. Buňky byly shromážděny, jemně peletovány a obarveny 0,6% roztokem trypanové modři po dobu 3 dešťů. Procento nezabarvených buněk bylo následně hodnoceno v deseti náhodně vybraných mikroskopických polích. Jako pozitivní lék bylo použito 100 ng／ml epidermálního růstového faktoru (EGF).

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO AKTIVITU VOLNÉ ODSTRAŇOVÁNÍ RADIKÁLŮ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Detekce apoptózy průtokovou cytometrií

Apoptotické buňky byly detekovány průtokovou cytometrií pomocí propidium jodidu (PI) [11••]. Stručně řečeno, přibližně 1 x 1{7}}6 buněk inkubovaných s testovanými látkami bylo sklizeno centrifugací a jednou promyto PBS. Buňky byly fixovány 70 % ethanolem po dobu 24 hodin při - 20 stupni a jednou promyty PBS. Buňky byly poté resuspendovány ve 300 ul PBS obsahujícím 0,5 mg/ml RNázyA a 0,5 mg/ml PI. Po další inkubaci po dobu 30 minut ve tmě byla provedena průtoková cytometrie pomocí FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Německo).

Analýza fragmentace DNA elektroforézou

Použili jsme Moorův protokol [12], který izoloval pouze fragmentovanou DNA a experimenty byly normalizovány použitím stejného počtu kultur z každé testovací skupiny. Stručně řečeno, 3 × 106 neuronů z každého z ošetřených vzorků bylo promyto v Hankově vyváženém solném roztoku (1000g po dobu 10 minut) a pelety vytvořené na dně zkumavky byly homogenizovány s 1 ml lyzačního pufru (10 mM Tris při pH 7,4, 5 mM EDTA, 1 % Triton X-100) po dobu 20 minut na ledu. Po centrifugaci při 11,000 g po dobu 20 deště při 4 stupních byly supernatanty obsahující fragmentovanou DNA odstraněny a štěpeny 20 mg/ml RNázy A při 37 stupních po dobu 1 hodiny a 0,1 mg/ml proteinázy K při 56 stupních na další 1 h. Fragmentovaná DNA byla extrahována pomocí fenolu a chloroformu a centrifugována při 10,000g po dobu 1 deště při teplotě 4 C. Vodná fáze byla přenesena do nové Eppendorfovy zkumavky, smíchána se 2 objemy ledově vychlazeného ethanolu a poté umístěn při 20 stupních po dobu alespoň 1 hodiny, aby se vysrážela DNA. Po centrifugaci při 15,000g po dobu 20 minut při 4 stupních byly odstraněny supernatanty a pelety DNA byly jednou promyty 80% ethanolem (15 000 g po dobu 15 minut při 4 stupních), vysušeny na vzduchu a rozpuštěny ve 20 μl TE pufr při pH 7,6. Celý vzorek byl poté podroben elektroforéze na 1,5% agarózovém gelu po dobu 1 hodiny při 85 V. Gel byl zkoumán a fotografován systémem Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Měření intracelulární tvorby ROS

Tvorba intracelulárních peroxidů byla detekována konfokálním skenovacím laserovým mikroskopem s použitím nefluorescenční sloučeniny, 2"7"-dichlorofluorescein diacetátu (DCFH-DA) [13], který je v buňkách deesterifikován endogenními esterázami na ionizované volné látky. kyselina, 2;7"-dichlorfluorescein. 2",7-dichlorfluorescein je možné oxidovat na fluorescenční 2"7"-dichlorfluorescein (DCF) hydroantioxidanty. Buňky byly inkubovány s 10 uM DCFH-DA po dobu 30 minut při 37 stupních. Kultury byly dvakrát promyty Hankovým vyváženým solným roztokem a zobrazeny ve stejném médiu. Zobrazování bylo provedeno pomocí konfokálního skenovacího laserového mikroskopu, DCF byl excitován při 488 nm a emisním filtrem byl bariérový filtr 510 nm. Aby bylo zajištěno platné srovnání, byly pro všechna pozorování použity stejné parametry akvizice. Byla nastavena optimální vertikální poloha uprostřed buněk a poté bylo pole rychle skenováno. Protože osvětlení při excitační vlnové délce 488 nm způsobilo zvýšenou fluorescenci v důsledku oxidace tohoto barviva, bylo každé pole vystaveno světlu na stejnou dobu. Výchozí hodnoty z nestimulovaných buněk byly použity jako kontrolní hodnoty pro srovnání s MPP＋ ošetřenými buňkami v přítomnosti nebo nepřítomnostitubulosid B. Po skenování byla kvantifikována průměrná relativní intenzita fluorescence v 15-20 tělech neuronových buněk na pole mikroskopu ve čtyřech samostatných kulturách na podmínky ošetření.

Statistická analýza

Všechny získané hodnoty byly vyjádřeny jako průměr ± SD. Statistická významnost rozdílů mezi skupinami byla stanovena Studentovým t-testem; Vypočítané hodnoty p menší než 0,05 byly považovány za statisticky významné.

Výsledek

Jak je znázorněno na obr. 2, MPP+ vyvolalo na dávce závislé snížení životaschopnosti buněk PCI2. Naproti tomu EGF, dobře známý neurotrofický faktor, produkoval významnou ochranu buněčné životaschopnosti při 100 ng/ml MPP＋-indukované cytotoxické účinky byly také oslabeny v přítomnosti tubulosidu B (5, 10, 50 nebo 100 ug-ml{{12} }), i když s menší účinností než referenční

lék (obr. 3). Tubulosid B v těchto koncentracích vykazoval cytoprotektivní účinky v závislosti na dávce a samotná sloučenina nezpůsobovala žádnou zjevnou cytotoxicitu (data nejsou uvedena). Gelová elektroforéza DNA extraktu z PCI 2 buněk ošetřených 200 uM MPP+ po dobu 48 hodin ukázala DNA laddering. klasickým charakteristickým znakem apoptózy, tubulosid B, v dávkách 10 a 100 μg·ml-1upravená tvorba DNA žebříčku (obr.4) ．. Obr.5 ukazuje typické histogramy průtokové cytometrické analýzy apoptotické buněčné smrti indukované MPP＋ v buňkách PC12 v přítomnosti nebo nepřítomnosti tubulosidu B．Kvantifikace profilu buněčného cyklu pomocí PI odhalila počet buněk se subdiploidními charakteristikami (oblast M1) svědčící o fragmentaci apoptotické DNA. V neošetřených buňkách byla apoptotická subdiploidní frakce minimální až do 5 94 z celkových 10 000 buněk (obr. 5 A). Po 48 hodinách expozice MPP＋ se procento apoptózy zvýšilo na 43．02;j;(obr.．5 B)！. Když se přidá do buněčné kultury, tubulosid Binhiboval MPP+-indukovanou apoptózuzpůsobem závislým na dávce. Při koncentraci 10 ug·ml-1 nebyla ochrana tubulosidem B statisticky významná, ale při 50 a 1 00ug·ml-1 došlo k poklesu o 45 ％a 63％v tomto pořadí, bylo pozorováno. zvýšení procenta buněk přežití (obr. 5D, E).

Akumulace intracelulárních ROS může být detekována použitím DCFH-DA．Buňky PC12 ošetřené 200 uM MPP＋ po dobu 48 hodin vykazovaly intenzivní fluorescenci uvnitř buňky po obarvení DCFH-DA barvivem (obr. 6). Simultánní léčba tubulosidem B (v dávkách 10 a 100 ug·ml.) inhibovala produkci ROS indukovanou MPP＋一 (snížené procento bylo 24．52％a 55．63％, v tomto pořadí).

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO LÉČBU PARKINSONOVY NEMOCI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskuse

Patogeneze PD zahrnuje silný oxidační stres, snížené hladiny antioxidantů a mitochondriální defekty. o všech je známo, že indukují apoptózu v několika buněčných systémech. Zejména bylo prokázáno, že volné radikály spouštějí aktivní buněčnou smrt v neuronech[14]. MPTP způsobuje ireverzibilní a závažný syndrom podobný Parkinsonově nemoci, který způsobuje selektivní degeneraci nigrostriatálních dopaminergních neuronů u lidí. Tento neurotoxin byl použit k vytvoření. jedli zvířecí modely PD[15].MPTP je konvertován monoaminooxidázou B na Mpp＋, který se akumuluje v mitochondriích. kde inhibuje mitochondriální komplex I a mitochondriální dysfunkci. funkce způsobuje apoptózu[16]. Proto byla neurotoxicita indukovaná MPP+ v dopaminergních neuronech široce používána jako etiologický model PD pro screening neuroprotektivních látek.

V této studii jsme prokázali, že MPP+-indukovaná buněčná smrt prostřednictvím oxidačního stresu v buňkách PC12 byla snížena tubulosidem B. Dále jsme prokázali, že tubulosid B také chránil v závislosti na dávce proti MPP{{ 3}} indukoval DNA laddering a apoptózu, jak bylo měřeno pomocí DNA gelové elektroforézy a průtokové cytometrické analýzy. Kromě toho současné ošetření vyššími koncentracemi tubulosidu B inhibovalo produkci ROS indukovanou MPP. Tubulosid B tedy prokázal multifunkční neuroprotektivní účinky. Na působení tubulosidu B se může podílet několik mechanismů, samostatně nebo ve spojení. Antioxidační účinek je možným mechanismem neuroprotekce zprostředkované tubulosidem B. Xiong Q zjistil, že tubulosid B vykazuje silnou aktivitu vychytávání volných radikálů na 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylovém radikálu a xanthin]xanthinoxidázou generovaný superoxidový aniontový radikál.

Nedávno bylo publikováno, že několik fenylethanoidů má vlastnosti zachycující volné radikály a chrání toxická poškození vyvolaná oxidačním stresem. ROS produkované MPP+, jako je peroxid vodíku, superoxidový aniont a hydroxylový radikál, snadno poškozují biologické molekuly, což může nakonec vést k apoptické nebo nekrotické buněčné smrti. Tubulosid B tedy může mít přímé vychytávací účinky proti ROS. I když naše data nestanoví přesné místo, kde tubulosid B působí k potlačení akumulace ROS, naznačují, že neuroprotektivní mechanismus zahrnuje stimulaci antioxidačních drah. Studie molekulární struktury tubulosidu B také ukazuje, že má silnou schopnostvychytávání volných radikálů(osobní komunikace).

Další mechanismy mohou být také relevantní. Tubulosid B může mít například schopnost působit proti toxicitě MPP＋ inhibicí otevírání přechodových pórů mitochondriální permeability a dysfunkcí. Kromě toho je třeba zvážit, zda má tubulosid B přímý účinek na podporu růstu na neuronální buňky. Přesný mechanismus neuroprotektivního působení tubulosidu B zůstává nejasný. K objasnění úplného obrazu jeho neuroprotektivního účinku jsou zapotřebí další studie.

Nesporně tubulosid B zExtrakt z cistanche salsymá evidentní ochranné účinky na apoptózu vyvolanou MPP+-a oxidační stres. Jeho neuroprotektivní účinky proti MPP ＋ toxicita mohou být důležité a naznačují, že může mít terapeutický potenciál v prevenci a léčbě PD.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO LÉČBU PARKINSONOVY NEMOCI PHGS75% ECH 30% ACT 12%