Isoxazoly na bázi trifluormethylovaných flavonoidů jako antidiabetika a činidla proti obezitě: syntéza, in vitro inhibiční aktivita amylázy, molekulární dokování a analýza vztahu mezi strukturou a aktivitou

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comvědět víc

Faisal K. Algethami 1,*, Ilyes Saidi 2, Hani Nasser Abdelhamid 3, Mohamed R. Elamin 1, Babiker Y. Abdulkhair 1, Amani Chrouda 4 a Hichem Ben Jannet 2,*

Abstraktní:Diabetes mellitus je celosvětově závažným zdravotním problémem. Řízení trávení sacharidů poskytuje alternativní léčbu.Flavonoidytvoří největší skupinupolyfenolickésloučeniny, produkované rostlinami široce konzumovanými jako potrava a/nebo používanými pro terapeutické účely. Isoxazoly jako takové přitahovaly pozornost lékařských chemiků svou značnou bioaktivitou. Hlavním cílem této práce tedy bylo objevit nové hybridní molekuly s vlastnostmi jak flavonoidů, tak isoxazolů za účelem kontroly trávení sacharidů. Kromě toho je trifluormethylová skupina klíčovou entitou ve vývoji léčiv díky své silné lipofilitě a metabolické stabilitě. Proto tato práce popisuje kondenzaci dříve syntetizovaného trifluormethylačního flavonolu s různými arylnitriloxidy, čímž se získá 13 hybridních molekul označovaných jako isoxazoly na bázi trifluormethylovaných flavonoidů. Struktury získaných sloučenin byly odvozeny z1H NMR,13C NMR a HRMS analýzy. 15 nově syntetizovaných sloučenin inhibovalo aktivitu -amylázy s účinností v rozmezí od 64,5 ± 0,7 procenta do 94,7 ± 1,2 procenta při koncentraci 50 µM as hodnotami IC50 12,6 ± 0,2 uM–27,6 ± 1,1 uM. Nejúčinnější sloučeniny z hlediska účinnosti a účinnosti byly 3b, 3h, 3j a 3m. Mezi nové trifluormethylacena bázi flavonoidůisoxazoly, sloučenina 3b byla nejúčinnějším inhibitorem aktivity -amylázy (PI=94,7 ± 1,2 procenta při 50 µM), s účinností (IC50=12,6 ± { {13}},2 uM) podobné pozitivní kontrole akarbózy (IC50=12,4 ± 0,1 uM). Studie vztahu mezi strukturou a aktivitou založená na analýze molekulárního dokování prokázala nízkou vazebnou energii, správný způsob interakce v aktivní kapse cílového enzymu a schopnost interagovat s klíčovými zbytky glykosidického štěpení (GLU{{16 }} a ASP-206), vysvětlující inhibiční účinky -amylázy vytvořené několika deriváty.

klíčová slova:-inhibice amylázy; antidiabetikum; proti obezitě; cykloadice; flavonoidy; isoxazoly na bázi trifluormethylace flavonoidů; molekulární dokování; Analýza SAR

Klikněte sem a dozvíte se více

1. Úvod

Obezitaa diabetes mellitus představují celosvětově hlavní problémy lidského zdraví [1,2]. Diabetes mellitus je totiž primárně charakterizován nekontrolovanou hladinou cukru v krvi. Diabetes mellitus 1. typu je však důsledkem poruchy sekrece inzulínu (závislá na inzulínu), zatímco typ 2 obvykle pochází z inzulínové rezistence (změny struktury receptoru na cílových buňkách, což vede ke snížení afinity hormon-receptor), narušení v sekreci inzulínu, nebo obojí [3,4]. Inhibice degradace polysacharidů na monosacharidy vhodné pro absorpci do buněk nevyhnutelně implementuje základní strategie kontroly diabetu a pomáhá při zvládání obezity [3]. Enzym -amyláza (EC.3.2.1.1) je trávicí enzym hydrolyzující -1,4-glykosidické vazby sacharidů, jako jsou škroby [5]. Proto inhibice -amylázy tak či onak přispívá ke kontrole trávení sacharidů [6,7]; tedy představuje částečnou dráhu pro regulaci enzymatické aktivity -amylázy; je tedy ideální terapií pro regulaci obezity a diabetu, stejně jako s nimi souvisejících komplikací [4]. Většina komerčních inhibitorů amylázy – jako je akarbóza, miglitol, fázolamin a voglibóza – byla spojována s nežádoucími střevními účinky, jako je plynatost, bolesti břicha, průjem, selhání jater, závažné kožní alergie a pneumatóza, cystoidní střevní infekce [6] ]. Nejlepšími inhibitory -amylázy jsou tzv. kompetitivní inhibitory, které enzym nevratně inhibují. Kompetitivní inhibitor se váže na aktivní místo cílového enzymu, a tak zabraňuje navázání substrátu. Při kompetitivní inhibici tedy inhibitor soutěží se substrátem o aktivní místo. Na druhé straně při ireverzibilní inhibici se inhibitor od cílového enzymu velmi pomalu disociuje, protože se na enzym pevně naváže. Obvykle se ireverzibilní inhibitory vážou kovalentně k aktivnímu místu enzymu modifikací zbytků nebo funkčních skupin nezbytných pro enzymatickou aktivitu, takže enzym je nevratně inhibován. Pro dobrou inhibici trávení sacharidů – což může pomoci kontrolovat obezitu a dokonce i diabetes 2. typu – potřebujeme neselektivní látku schopnou inhibovat většinu trávicích enzymů cukrů, jmenovitě slinnou amylázu, pankreatickou -amylázu a -glukosidázu. [8,9]. Předchozí výzkum polosyntetizovaných flavonoidů zjistil, že deriváty flavonoidů na bázi isoxazolu vykazují významné antidiabetické účinky zvýšením vychytávání glukózy v buňkách HepG2 rezistentních na inzulín [10]. Dále jsou flavonoidy největší skupinou polyfenolických sekundárních metabolitů, které se běžně vyskytují v rostlinách. Tyto sekundární metabolity jsou zodpovědné za atraktivní barvy následovníků, plodů a listů [11]. Strukturně mají flavonoidy uhlíkový skelet C15 sestávající ze dvou aromatických kruhů (A) a (B), které jsou spolu spojeny řetězcem C3 tvořícím heterocyklus (C) [12]. Pro tento typ polyfenolických sloučenin bylo popsáno mnoho biologických vlastností, jako je inhibice -amylázy [7,13–15], antidiabetika [16,17], protirakovinná [18,19] aantioxidantúčinky [20] a další biologické aktivity [21–25]. Tento bohatý biologický profil však motivoval několik chemických výzkumných týmů k syntéze flavonoidů se speciálními skupinami a substituenty, aby se zaměřily na konkrétní biologické aktivity [26–30]. Na druhé straně je isoxazol pětičlenný heterocyklus velkého významu v lékařské chemii. Kromě toho přirozeně se vyskytující isoxazoly – jako je kyselina ibotenová (halucinogenní, neurotoxin) a muscimol (halucinogenní, antagonista receptoru GABAA) [31–34] – přitahují rostoucí pozornost chemiků a farmakologů díky svým silným biologickým a farmakologickým vlastnostem. Dále se ukázalo, že deriváty isoxazolu mají široké spektrum biologických vlastností, jako jsou antidiabetické, analgetické, protizánětlivé, anti-HIV a protirakovinné účinky [10,35–40]. Isoxazolový kruh je široce používán jako klíčový stavební blok pro léky, jako je zonisamid (antikonvulziva) [41], valdekoxib, parekoxib (inhibitory COX-2) [42] a leflunomid (antirevmatikum) [43]. V posledních desetiletích je trifluormethylová skupina stále více žádána pro vývoj bioaktivních sloučenin kvůli jejímu silnému charakteru přitahující elektrony, metabolické stabilitě a lipofilní povaze, které jsou považovány za důležité fyzikálně-chemické vlastnosti bioaktivních molekul [44]. Bylo zjištěno, že tato fluorovaná skupina je nepostradatelná v mnoha důležitých lécích, včetně flufenazinu (antipsychotikum, protinádorová léčba) [45], leflunomidu (antirevmatikum) [43], celekoxibu (selektivní inhibitor COX-2) [46], fluoxetinu (antidepresivum) [47] a fluazinam (fungicid) [48]. Jeden přehled literatury uvádí, že trifluormethylace kyseliny 5-amino-nikotinové vykazuje slibnou -amylázovou aktivitu [49]. Kromě toho bylo zjištěno, že chlorované hybridní molekuly pyrazol-thiazol jsou dobrými inhibitory enzymu -amylázy [50], což také ukazuje na důležitost atomu chloru v inhibičních strukturách -amylázy. Výše uvedená literární data uvádějící důležité fyzikálně-chemické vlastnosti trifluormethylové skupiny – a její příspěvek, spolu s flavonoidy a isoxazoly, k inhibici –amylázy a antidiabetickému působení – nás povzbudily k přípravě nové řady hybridních molekul, kde byl trifluormethylovaný flavonoid spojeny se sérií arylisoxazolů prostřednictvím methylenového linkeru a vyhodnotit jejich inhibiční schopnost enzymu -amylázy. Vztah mezi strukturou a aktivitou (SAR) byl studován a schválen pomocí analýzy molekulárního dokování.

Cistanche pro zlepšení imunity

2. Výsledky a diskuse

2.1. Chemie Příprava trifluormethylačního flavonolu (1) – dříve syntetizovaného v naší laboratoři a vykazujícího zajímavý cytotoxický potenciál – byla popsána podle postupu přijatého Znati et al. (2019) [30]. 5-Chlor-2-hydroxyacetofenon byl kondenzován s 4-(trifluormethyl)benzaldehydem pod zpětným chladičem methanolu a v přítomnosti hydroxidu sodného po dobu 3 hodin za vzniku 5-chloru{{10 }}(trifluormethyl)-2-hydroxychalkon; poté byl pyranový kruh (C) cyklizován a uhlík C-3 byl oxidován přidáním (H202, NaOH) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti (schéma 1). Molekula 1 byla získána s dobrým výtěžkem (79 procent) po vysrážení v ledové vodě. Schéma 1. Syntetická dráha trifluormethylačního flavonolu (1). Struktura flavonolu (1) byla potvrzena spektroskopickou analýzou a srovnáním s literárními údaji [30]. 1,3-dipolární cykloadice je chemická reakce mezi 1,3-dipólem a dipolarofilem za vzniku pětičlenného kruhu. Proto je 1,3-dipolární cykloadice považována za nejdůležitější způsob syntézy široké škály isoxazolů. Kromě toho je regiospecifická syntéza isoxazolů katalyzovaná Cu(I) při mikrovlnném ozařování založena na [3 plus 2] cykloadici mezi terminálními alkyny (dipolalofily) a arylnitriloxidy (dipóly), poskytující výhradně 3,5-disubstituované regioizomery [39,51]. Náš přístup k cílení na trifluormethylační flavonoidní isoxazoly (3a–m), nejprve začal přípravou dipolarofilu (2) prostřednictvím propargylace hydroxylové skupiny v poloze C-3 flavonolu (1) v bezvodém DMF pro 2 h při teplotě místnosti, v přítomnosti K2C03, jak je znázorněno ve schématu 2. Dipolarofil (2) byl připraven s vynikajícím výtěžkem (94 procent). Schéma 2. Syntetická dráha dipolarofilu (2).

Struktura sloučeniny 2 byla stanovena podle jejích spektrálních dat. Kromě signálů odpovídajících protonům a uhlíkům zavedeným flavonolem (1) byly v 1H a 13C NMR spektrech detekovány nové signály propargylové skupiny. Navíc 1H NMR spektrum dipolarofilu (2), zaznamenané v CDCI3 při 300 MHz, ukázalo dublet při 5H 5,06 (2H, d, J=2,4 Hz) odpovídající methylenovému protonu H{{13 }}" a triplet při 5H 2,36 (1H, t, J=2,4 Hz) přičitatelný protonu ethynylové skupiny (H-3"). Spektrum 13C NMR potvrdilo zavedení propargylové skupiny pozorováním nových signálů na 5C 78,4, 76,9 a 59,6, které lze připsat C-2", C-3" a C{{29} Hydroxymylchloridy a–m jsou hlavními prekurzory in situ generací arylnitriloxidů – činidel, která se účastní reakce 1,3-dipolární cykloadice pro syntézu isoxazolů. Prekurzory (a –m) byly syntetizovány z vhodných aldehydů podle obecného postupu popsaného Himo a kol. Odpovídající arylnitriloxidy tak vznikly in situ dehydrohalogenací odpovídajících hydroxylchloridů za použití triethylaminu jako báze Tabulka 1. Struktury a výtěžky hydroxylchloridů (a–m) a trifluormethylovaných isoxazolů na bázi flavonoidů (3a –m).

1,3-dipolární cykloadiční reakce byla aplikována v regiospecifickém přístupu s použitím terminálního alkynu (2) a různých hydroxylchloridů (a–m) různě substituovaných (schéma 3). Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 1. Schéma 3. Syntetická cesta trifluormethylačních flavonoidů isoxazolů 3a–m. Všechny reakce byly prováděny za mikrovlnného ozařování (250}W) v DMF v přítomnosti triethylaminu a jodidu měďného (Cul) po dobu 5 minut. Produkty byly izolovány z reakční směsi jednoduchým čištěním na sloupci silikagelu. Nově připravené 3,{{10}}disubstituované isoxazoly (3a–m) byly získány ve výtěžcích v rozmezí od 73 do 96 procent (tabulka 1). Struktury syntetizovaných trifluormethylačních isoxazolů na bázi flavonoidů (3a–m) (tabulka 1) byly stanoveny pomocí 1H, 13C NMR a DEPT 135. 1H NMR spektra těchto sloučenin ukázala singlet rezonující při δH 6,3{{68 }}–6,60 přičitatelné methinovému protonu H-4“ isoxazolového kruhu, dalšímu singletu na δH 5,35–5,45 přisuzovanému methylenovému protonu H-6} a dalším signálům v aromatická protonová zóna týkající se protonů zavedených arylovou skupinou. Tyto struktury byly navíc potvrzeny jejich 13C NMR a DEPT 135 spektry, ukazujícími všechny očekávané uhlíkové signály – zejména ty aromatické zavedené použitými hydroxylchloridy, stejně jako uhlík methinu C-4 z isoxazolový kruh rezonující na δC 1{{9{{1{{1{112}}5}}0}}}}2,5–103.{142}} a ten, jehož signál je invertován ve spektru DEPT 135, rezonující na δC 63,5–63,9, což lze připsat methylenu C-6“. 2.2. Hodnocení inhibice -amylázy Pro kontrolu enzymové aktivity je inhibice jedním z nejúspěšnějších terapeutických prostředků. Proto inhibice enzymu -amylázy představuje částečnou cestu ke zvládnutí diabetu a kontroly hmotnosti tím, že brání trávení sacharidů. Dosud tvořily léky jako akarbóza součást arzenálu léků používaných k léčbě DM a obezity. Nicméně akarbóza se nepoužívá jako monoterapie kvůli její účinnosti a vedlejším účinkům; místo toho se akarbóza používá jako doplňková terapie a velmi často se používá v kombinaci s jinými hypoglykemickými léky. Spolu s tím se tento lék běžně používá jako standardní sloučenina při studiu inhibice -amylázy. V této studii bylo u 15 syntetizovaných sloučenin (1, 2 a 3a–m) hodnocena jejich inhibiční aktivita na amylázu. Výsledky byly vyjádřeny v parametrech potence (IC50 ± SEM µM) a účinnosti (PI při 50 µM) a jsou uvedeny v tabulce 2. Podle výsledků byly syntetizované molekuly (1, 2 a 3a–m) vykazují významnou anti- -amylázovou aktivitu (p menší nebo rovno 0.05), s účinností v rozmezí 64,5 ± {{177} },7 až 94,7 ± 1,2 procenta při koncentraci 50 µM a potence hodnot IC5{{2{{207}}2}} v rozmezí 12,6 ± {{219} },2 až 27,6 ± 1,1 uM. Mezi nově připravenými isoxazoly na bázi trifluormethylace flavonoidů bylo zjištěno, že 3b (R1 =F, R2 =H) je nejúčinnější (IC50=12,6 ± 0,2 µM) a nejúčinnější (PI=94,7 ± 1,2 procenta při 50 uM) sloučenina k inhibici aktivity enzymu -amylázy. Bylo zjištěno, že tyto významné hodnoty jsou srovnatelné s hodnotami akarbózy (PI=97,8 ± 0,5 procenta při 50 uM; IC50=12,4 ± 0,1 uM), použité jako standardní látka. Podobně lze sloučeniny 3h, 3j a 3m považovat za bioaktivní z hlediska účinnosti a účinnosti (PI= 93.1 ± 0,9 procenta –93,5 ± 1,1 procenta při 50 µM; IC{119}},3 ± 0,2 µM–13,8 ± 0,1 µM) ve srovnání s jejich analogem 3b a akarbózou. U zbytku sloučenin (1, 2, 3a, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 3i, 3k a 3l) bylo také zjištěno, že jsou schopny inhibovat enzym -amylázu, ale zůstávají méně účinné (PI{{ 140}},5 ± 0,7 procenta –87,1 ± 0,7 procenta při 50 uM; IC50=14,4 ± 0,2 uM až 27,6 ± 1,1 uM) než u výše uvedených analogů. Anti- -amylázová aktivita dosažená syntetizovanými sloučeninami je v souladu s předchozími zprávami, mezi nimiž Nie et al. (2020) [10] uvedli, že isoxazoly na bázi flavonoidů by mohly představovat cenné lešení pro objevování antidiabetik. Porovnáním struktur a aktivit syntetizovaných molekul vykazovaly sloučeniny 3bd, halogenované v para poloze fenylové skupiny připojené k isoxazolovému kruhu, významnou účinnost (PI= 85,4 ± 0,9 procenta –94,7 ± 1,2 procenta při 50 µM) a účinnost (IC50=12,6 ± 0,2 µM–14,6 ± 0,3 µM) při inhibici enzymu -amylázy. Toto zjištění je v dobré shodě s literaturou, která ukazuje, že přítomnost atomů halogenu (F, Cl nebo Br) ve struktuře byla nezbytná pro silnou inhibici -amylázy [49,50]. Studie vztahu mezi strukturou a aktivitou nám navíc umožnila dospět k závěru, že více induktivních účinků atraktoru (-I) a mezomerního donoru (plus M) zvyšuje inhibiční účinnost a potenci -amylázy (aktivita fluorovaného derivátu 3b (R{{186} } F, R2 =H; PI=94,7 ± 1,2 procenta při 50 uM; IC50=12,6 ± 0,2 uM) je vyšší než u chlorovaného derivátu 3c (R{ {198}} Cl, R2=H; PI=87,1 ± 0,7 procenta při 50 µM; IC 50=14,4 ± 0,2 µM), následovaný bromovaným derivátem 3d (R 1=Br, R2=H; PI=85,4 ± 0,9 procenta při 50 µM; IC 50=14,6 ± 0,3 µM)), v souladu s předchozími studiemi [ 4,49]. Je zřejmé, že inhibice -amylázy se zvyšuje s indukčním atraktorovým (-I) a mezomerním donorovým (plus M) efektem atomů halogenu.

2.3. Molekulární dokovací studieEnzym -amyláza (EC 3.2.1.1) – glykosylhydroláza – hydrolyzuje -1,4-glykosidické vazby ve škrobech, jako je amylóza. Krystalová struktura enzymu -amylázy (PDB: 7TAA) je složena z řetězce A o délce sekvence 478 aminokyselin [52]. -Amyláza je jedním z nejdůležitějších klíčových enzymů odpovědných za trávení sacharidů [5]; blokování enzymu -amylázy tedy nabízí strategii kontroly diabetu a pomoc při zvládání obezity [6,7]. Byla provedena rozsáhlá analýza molekulárního dokování, aby se prozkoumal vazebný režim, určily se pravděpodobné interakce syntetizovaných molekul (1, 2 a 3a–m) v hydrofobní vazebné kapse ABC (modifikovaný hexasacharid akarbózy) struktury proteinového krystalu Aspergillus oryzae - amylázový enzym (PDB: 7TAA) [52] pomocí softwaru AutoDock Vina a racionalizovali pozorovanou in vitro inhibiční aktivitu na amylázu u nově syntetizovaných sloučenin. Všechny syntetizované molekuly (1, 2 a 3a–m) – a akarbóza, používaná jako standardní látka – byly studovány in silico. Vazebné energie a detaily interakcí (počet interakcí, počet interagujících aminokyselin, interagujících aminokyselin a vodíkových vazeb) ligandů s cílovým enzymem jsou uvedeny v tabulce 2. Z výsledků in silico dokování (tabulka 2) bylo pozorováno že sloučeniny 1 a 2 vykazovaly dobré vazebné energie (-7,7 a -7,8 kcal/mol, v tomto pořadí) ve vazebném místě enzymu -amylázy (PDB: 7TAA). Tyto hodnoty jsou srovnatelné s hodnotami standardní látky (akarbóza, -7,9 kcal/mol), což jim umožňuje příznivě zapadnout do aktivního místa cílového enzymu. Je zajímavé, že nově syntetizované isoxazoly na bázi trifluormethylačních flavonoidů (3a–m) poskytly očekávané výsledky; byly správně ve vazebné pozici a vykazovaly nádherné vazebné energie v rozmezí od -9,6 do -8,2 kcal/mol (tabulka 2). To by jim všem umožnilo vhodně zapadnout do aktivního místa enzymu -amylázy, lépe než akarbóza. Způsob vazby tří nejaktivnějších sloučenin (3b, 3h a 3j) s cílovým enzymem je diskutován níže. Sloučenina 3b – nejúčinnější a nejúčinnější inhibitor enzymu -amylázy v testované sérii isoxazolů na bázi trifluormethylačních flavonoidů – vykazovala vynikající vazebnou energii −9,6 kcal/mol. Kromě toho způsob vazby 3b naznačuje, že se podílí na 16 nekovalentních interakcích s 10 aminokyselinami (tabulka 2). Důkladně 3-(3-(4-fluorfenyl)isoxazol-5-yl)methoxylová část tvoří dvě halogenové (fluorové) vazby s ASP-206, Pi –Pí vazba ve tvaru T s TYR-82, Pi–kationtová vazba s HIS-80, Molekuly 2021, 26, 5214 8 18 dvou konvenčních vodíkových vazeb s ARG{{71 }} a Pi–anion a vazba uhlík-vodík se zbytkem ASP-340. Kromě toho se trifluormethylová skupina navázaná na C-40 flavonoidového skeletu podílí na konvenční vodíkové vazbě s GLY-167 a dvou alkylových vazbách s LEU-166 a LEU-173 amino kyseliny. Na druhou stranu flavonoidový skelet interaguje prostřednictvím Pi–aniontové vazby s ASP-340, konvenční vodíkové vazby s GLN-35 a Pi–alkylové a dvou Pi–Pi vrstvených vazeb s TYR{ {80}} (obrázek 1).

Obrázek 1. Sloučenina 3b zapadá do hydrofobní vazebné kapsy ABC v PDB: 7TAA.

Dále sloučenina 3h vykazovala zajímavou vazebnou energii -9,3 kcal/mol. Jeho vazebný režim ukazuje, že se účastní 15 nekovalentních interakcí s 10 zbytky (tabulka 2). Molekulární pohled z dokovací analýzy tedy naznačuje, že 3-(3-(4- methoxyfenyl)isoxazol-5-yl)methoxylová část tvoří dvě vazby uhlík-vodík s GLU{{12 }}, Pi–Pi vazba ve tvaru T s TYR-82, dvě konvenční vodíkové vazby s ARG-344, vazba uhlík-vodík s HIS-80 a Pi–aniontová vazba se zbytkem ASP{18}}. Kromě toho je trifluormethylová skupina zapojena do konvenční vodíkové vazby s GLY-167 a dvou alkylových interakcí s aminokyselinami LEU-166 a LEU-173. Kromě toho je flflavonoidový skelet zapojen do konvenční vodíkové vazby s GLN-35, Pi–aniontové vazby s ASP-340, dvou vrstvených vazeb Pi–Pi a Pi–alkylové vazby s TYR{ {24}} (obrázek 2)

Na druhé straně sloučenina 3j vykazovala významnou vazebnou energii -9,2 kcal/mol. Jeho vazebný režim ukazuje, že se podílí na 16 nekovalentních interakcích s 13 aminokyselinami (tabulka 2). Hloubková analýza molekulárního dokování proto naznačuje, že 3-(3-(4-butoxy-3-chlorfenyl)isoxazol-5-yl)methoxylová část tvoří dvě konvenční vodíkové vazby s ARG-344, tři Pi-alkylové vazby s TYR-82, HIS-210 a HIS-296, alkylová interakce s LEU-232, a vazba uhlík-vodík se zbytkem GLU-230, vazba Pi–anion s ASP-340 a vazba Pi–kationt s HIS-80. Kromě toho je trifluormethylová skupina vázaná na aromatický kruh B flavonoidního skeletu zapojena do konvenční vodíkové vazby s GLY-167 a dvou alkylových interakcí se zbytky LEU-166 a LEU-173. Kromě toho je flflavonoidový skelet zapojen do konvenční vodíkové vazby s GLN-35 a Pi-alkyl a dvou Pi-Pi vrstvených vazeb s aminokyselinou TYR-75 (obrázek 3). V enzymu Aspergillus oryzae -amyláza (PDB: 7TAA) jsou nukleofil a katalytické zbytky kyseliny/báze, které jsou zodpovědné za štěpení glykosidických vazeb, aminokyseliny ASP-206 a GLU-230 , respektive [5]. Interakce mezi proteinem a ligandem, primárně prostřednictvím zbytků GLU-230 a ASP-206, jsou proto nejlepším způsobem, jak blokovat štěpení glykosidických vazeb. Ve skutečnosti nízká vazebná energie, správná vazebná pozice, schopnost interagovat s klíčovými zbytky glykosidického štěpení (GLU-230 a ASP-206) a velký počet interakcí v aktivní kapse cílový enzym (tabulka 2) může vysvětlit silnou inhibiční -amylázovou účinnost, kterou zavedla většina sloučenin.

Obrázek 3. Sloučenina 3j zapadá do hydrofobní vazebné kapsy ABC v PDB: 7TAA

3. Materiály a metody

3.1. Obecné experimentálníPostupy Všechna použitá rozpouštědla byla před použitím čerstvě destilována. Všechny chemické reakce byly monitorovány pomocí komerčních TLC destiček (Silikagel 60, F254, SDS). Ke stanovení bodů tání byl použit přístroj Büchi 510. Všechna1H NMR (300 MHz), DEPT 135 a13C NMR (75 MHz) spektra byla zaznamenána v deuterovaném chloroformu a dimethylsulfoxidu-d6 pomocí spektrometru Bruker AC{10}}. Všechny chemické posuny (5) byly uvedeny v částech na milion (ppm), vazebné konstanty (J) byly uvedeny v Hertzech (Hz) a rezonance rezonance nedeuterovaného rozpouštědla byla použita jako vnitřní reference. DCI-HRMS spektra byla měřena v aWaters GCT 1er v režimu kladných iontů. Spektra ESI-HRMS byla zaznamenána pomocí ESI-TOF (Waters LCT, Markham, Ontario, Kanada) v pozitivním iontovém módu s použitím reflektronového módu.

4. závěr

15 nově syntetizovaných isoxazolů na bázi trifluormethylačních flavonoidů (3a–m) bylo hodnoceno in vitro na jejich inhibiční aktivitu na amylázu a byly zaznamenány významné výsledky. Cykloadukty 3b, 3h, 3j a 3m vykazovaly srovnatelnou účinnost a sílu jako akarbóza použitá jako standardní látka k inhibici enzymu -amylázy. Kromě toho analýza vztahu struktura-aktivita odhalila, že halogenované a alkoxylované deriváty byly nejaktivnějšími sloučeninami. Podle analýzy silicodocking vykazovaly trifluormethylační isoxazoly na bázi flavonoidů nízkou vazebnou energii, velký počet interakcí a správnou vazebnou polohu v aktivní kapse cílového enzymu. Většina z nich interagovala s nukleofilem a katalytickými zbytky kyseliny/báze (GLU-230 a ASP-206), což může vysvětlit jejich účinnost a sílu při inhibici enzymatické aktivity -amylázy. Slibné aktivity vykazované syntetizovanými hybridními sloučeninami podporují jejich zapojení jako kandidátů na objev nových antidiabetik a činidel proti obezitě. Velmi hloubkové studie a bezpečnostní faktory však musí vzít v úvahu rizika spojená s novostí účinné látky, toxicitou, stabilitou a rozpustností ve vodném prostředí a farmakodynamickými charakteristikami, včetně spolehlivosti, s jakou lze sledovat vedlejší účinky. u lidí dříve, než se rozvinou potenciálně závažné/nevratné účinky. Doplňkové materiály: Následující jsou k dispozici online, NMR spektra syntetizovaných sloučenin (1, 2 a 3a–m), Tabulka S1: Křivky koncentrace-odezva použité k výpočtu hodnot IC50. Příspěvky autora: Konceptualizace FKA a IS; metodika, HBJ; software, IS a H.NA; validace, FKA a AC; formální analýza, MRE; vyšetřování, FKA a IS; zdroje, BYA; správa dat, FKA a IS; psaní – příprava původního návrhu, FKA a IS; psaní — recenze a editace, HBJ; vizualizace, FKA a BYA; supervize, HBJ; administrace projektů, FKA a HBJ; získání finančních prostředků, FKA Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasili s ní. Financování: Tento výzkum nezískal žádné externí financování. Prohlášení institucionální kontrolní komise: Neuplatňuje se. Prohlášení o informovaném souhlasu: Neuplatňuje se. Prohlášení o dostupnosti dat: Neuplatňuje se. Poděkování: Autoři děkují děkanství pro vědecký výzkum u imáma Mohammada Ibn Sauda Islamic Univerzitě za financování této práce prostřednictvím Výzkumné skupiny. RG-21-09-69.Konflikty zájmů: Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.Dostupnost vzorku: Vzorky sloučenin nejsou u autorů k dispozici.

Reference
1. Boutayeb, A.; Boutayeb, S. Zátěž nepřenosných nemocí v rozvojových zemích. Int. J. Equity Health 2005, 4, 1–8. [CrossRef]
2. Wagner, KH; Brath, H. Globální pohled na vývoj nepřenosných nemocí. Předchozí Med. 2012, 54, S38–S41. [CrossRef]
3. Tseng, CH Potenciální biologické mechanismy arsenem indukovaného diabetes mellitus. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2004, 197, 67–83. [CrossRef]
4. Sala, D.; Zorzano, A. Diferenciální kontrola svalové hmoty u diabetes mellitus 1. a 2. typu. Buňka. Mol. Life Sci. 2015, 72, 3803–3817. [CrossRef]
5. Brzozowski, AM; Davies, GJ Struktura aspergillus oryzae -amyláza v komplexu s inhibitorem akarbózou při rozlišení 2.0 Å. Biochemistry 1997, 36, 10837–10845. [CrossRef]
6. Jayaraj, S.; Suresh, S.; Kadeppagari, inhibitory RK amylázy a jejich biomedicínské aplikace. Starch-Stärke 2013, 65, 535–542. [CrossRef]
7. Khan, S.; Nazir, M.; Raiz, N.; Saleem, M.; Zengin, G.; Fazal, G.; Saleem, H.; Mukhtar, M.; Tousif, MI; Tareen, RB; a kol. Fytochemické profilování, biologické vlastnosti in vitro a studie in silico na populacích Caragana ambigua (Fabaceae): komplexní přístup. Ind. Crops Prod. 2019, 131, 117–124. [CrossRef]
8. Berg, JM; Tymoczko, JL; Stryer, L. Enzymy mohou být inhibovány specifickými molekulami. In Biochemistry, 5. vydání; WH Freeman: New York, NY, USA, 2002.
9. Kam, A.; Li, KM; Razmovski-Naumovski, V.; Nammi, S.; Shi, J.; Chan, K.; Li, GQ Srovnávací studie o inhibičních účincích různých částí a chemických složek granátového jablka na -amylázu a -glukosidázu. Phytother. Res. 2013, 27, 1614–1620. [CrossRef]
10. Nie, JP; Qu, ZN; Chen, Y.; Chen, JH; Jiang, Y.; Jin, MN; Yu, Y.; Niu, WY; Duan, velitelství; Qin, N. Objev a antidiabetické účinky nových derivátů flavonoidů na bázi isoxazolu. Fitoterapie 2020, 142, 104499. [CrossRef]
11. Malešev, D.; Kunti´c, V. Zkoumání chelátů kov-flavonoid a stanovení flavonoidů prostřednictvím reakcí komplexace kov-flavonoid. J. Srb. Chem. Soc. 2007, 72, 921–939. [CrossRef]
12. Pinheiro, PF; Goncalon, CJ Strukturální analýza flavonoidů a příbuzných sloučenin — Přehled spektroskopických aplikací. In Fytochemikálie — Globální perspektiva jejich role ve výživě a zdraví; InTech: Londýn, Velká Británie, 2012.
13. Lo Piparo, E.; Scheib, H.; Frei, N.; Williamson, G.; Grigorov, M.; Chou, CJFlavonoidy prokontrola trávení škrobu: Strukturní požadavky na inhibici lidské -amylázy. J. Med. Chem. 2008, 51, 3555–3561. [CrossRef]
14. Xiao, J.; Ni, X.; Kai, G.; Chen, X. Přehled o vztahu mezi strukturou a aktivitou stravyinhibující polyfenoly-amyláza. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2013, 53, 497–506. [CrossRef] [PubMed]
15. Hua, F.; Zhou, P.; Wu, HY; Chu, GX; Xie, ZW; Bao, GH Inhibice -glukosidázy a -amylázy flavonoidními glykosidy z čaje Lu'an GuaPian: Molekulární dokování a mechanismus interakce. Funkce jídla. 2018, 9, 4173–4183. [CrossRef] [PubMed]
16. Vinayagam, R.; Xu, B. Antidiabetické vlastnosti dietních flavonoidů: Přehled buněčného mechanismu. Nutr. Metab. 2015, 12, 1–20. [CrossRef] [PubMed] 17. Ghorbani, A. Mechanismy antidiabetických účinků flavonoidu rutinu. Biomed. Pharmacother. 2017, 96, 305–312. [CrossRef] [PubMed]