Léčba kamenů v ledvinách: G. Fruticosus
Mar 22, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
ČÁST I.: Hodnocení léčebné účinnosti extraktů z rozpouštědel G. fruticosus u experimentálně indukovaných nefrolititických wistar samců potkanů
Tilahun Alelign, Tesfaye Sisay Tessema, Asfaw Debella a Beyene Petros
Pozadí
Urolitiáza(kamenyv močových cestách) postihuje asi 12% světové populace v určité fázi jejich života [1]. Jiné studie uváděly, že celosvětová prevalenceledvinové kamenyse pohybuje mezi 2 až 20 %[2, 3]. Urolitiáza postihuje všechny věkové kategorie, pohlaví a rasy[4,5], ale vyskytuje se častěji u mužů než u žen ve věku od 20 do 49 let [6]. Patogenezeledvinové kamenyzůstává neúplně pochopen [7] a jeho léčba zůstává výzvou, i když existují moderní způsoby léčby včetně ESWL[8]. Sled událostí, které se aktivujíkámentvorba zahrnuje nukleaci, růst, agregaci a zadržování krystalů v ledvinách [9, 10].
Renální kámentvorba vyžaduje trvalé zadržování krystalů vledvinkypo dokončení krystalizačního procesu[11, 12]. Interakce krystalů COM s povrchem renálních epiteliálních buněk je kritickou iniciační událostí u nefrolitiázy [13]. Vzájemné působení krystalových buněk vede k pohybu krystalů z bazolaterální strany buněk do bazolové membrány [14]. Studie na zvířecích modelech také ukázala, že podávání vysokých koncentrací krystalů CaOx nebo oxalátových iontů se zdá být toxické, což způsobuje poškození renálních tubulárních buněk [7]. Expozice vyšším hladinám oxalátu nebo krystalů CaOx indukuje poškození epiteliálních buněk, což je předisponující faktor pro následnékámenformace [15, 16].
Nerovnováha mezimočovýkámeninhibitory a promotory byly navrženy jako příčinakámenformace [17]. Pořadatelé usnadňujíkámentvorba [18], ale inhibitory snižují iniciaci přesycení, nukleaci, růst krystalů a rychlost agregace [17]. Inhibitory však fungují stejně pro všechny; proto někteří lidé tvoří kameny; zatímco jiní ne [19]. Mezi opakujícími sekámenExkrece šťavelanu močí byla vyšší, zatímco vylučování citrátů bylo nižší Studie také ukázala, že oxalát může usnadnit reabsorpci chloridu, sodíku a vody v proximálních tubulech a aktivovat více signálních cest v renálních epiteliálních buňkách [20].
Navzdory značným zlepšením v lékařské terapii, jako je užitečnost mimotělní litotripsie rázové vlny (ESWL), neexistuje žádný uspokojivý lék k léčbě renálních kamenů [21]. Léčba ESWL je spojena s akutním poškozením ledvin v důsledku traumatického účinku rázové vlny a infekcemi po léčbě [22]. To také vede k neúplnostikámenclearance a neschopnost vyhnout se novýmkámenútvary [23], nebokámenrecidivy často až 60%[24,25]. Po první epizoděkámenje míra recidivy více než 50 % během 10 let [26,27]. Protodruh fazolerecidiva je hlavním rizikem, které je v oblasti urologie považováno za nesplněnou klinickou výzvu [28].Kámenformující se pacienti jsou náchylní k jeho recidivám po první chirurgické terapii [29]. I když chemické složeníkámenovlivnit volbu intervence [30], otevřená chirurgie zůstává základem léčby [31]. Některé léčivé rostliny, které byly dosud studovány proti urolitiáze, jsou uvedeny v tabulce 1
V Etiopii se většina pacientů spoléhá na tradiční léčivé rostliny jako alternativní terapii různých onemocnění včetně urolitiázy. Léčivé rostliny jsou cenově dostupné, přístupné, účinné, s menším počtem vedlejších účinků a jsou lépe kompatibilní s lidským tělem [41] ve srovnání s konvenčními léky [42]. V této studiiG. fruticosus(L.) byly vybrány, aby zkoumaly jejich účinky na experimentálně indukovanou urolitiázu. Byl proveden důkladný průzkum literatury, aby se zjistilo, že žádná z vybraných částí léčivých rostlin nebyla dosud studována na antiurolititických aktivitách. K dnešnímu dni také nejsou k dispozici dostatečné vědecké důkazy o antihrolititické aktivitě této léčivé rostliny. Cílem studie proto bylo zhodnotit léčebnou účinnost léčivých rostlin u experimentálně indukovaných nefrolitiátických samců potkanů.
Tabulka 1 Léčivé rostliny s antiurolititickými účinky v předchozích studiích
Materiály a metody
Identifikace a sběr léčivého rostlinného materiáluGomphocarpusfruticosus(G. fruticosus)listy byly sbírány během kvetení nebo plodů. TenG.fruticosus(L) Ait.f, známý jako Tifriena (místní název), byl shromážděn v Bole Bulbula kolem"93 Mazoria"Addis Abeba během Octo-ber 2018.G. fruticosusL.Ait.f(Asclepiadaceae)(hlášené klíčovým informátorem) bylo hlášeno pro léčbu urolitiázy. Vzorky rostlin byly předloženy Národnímu herbáři, Katedře biologie rostlin a řízení biologické rozmanitosti, Addis Ababa University (AAU) pro taxonomickou autentizaci (TA238) a bylo uvedeno odpovídající číslo sbírky. Exempláře byly uloženy v Národním herbáři AAU pro budoucí použití.
Příprava surového extraktu
Rostlinné materiály byly důkladně vyčištěny vodou z vodovodu, aby se odstranily nečistoty, a sušeny v kůlně při pokojové teplotě od 2 do 3 týdnů v laboratoři biomedicínských věd AAU. Sušené části rostlin byly jemně práškovány pomocí kuchyňské brusky (malta a palička o velikosti asi 9 in.in průměru). Prášky byly podrobeny sítu o velikosti 3 ok, aby se filtrovala hrubá pevná hmota.
Extrakty byly připraveny postupem podobným tomu, který často používají tradiční léčitelé nebo pacienti, s některými drobnými úpravami. Rostlinné prášky byly namočeny v destilované vodě, která byla umístěna na šejkru po dobu 72 hodin. Směs byla filtrována přes bavlnu / gázu, poté přes whatmanový filtrační papír číslo 1 (velikost pórů: 1l μm), aby se odstranily jemné pevné částice rostlin nebo nerozpustné složky. Celé extrakty byly koncentrovány do sucha pomocí lyofilizačního stroje odstraněním neobdělávané vody pod sníženým tlakem. Poté se polotuhé koncentráty nalijí do skleněných Petriho desek a nechají se zcela vyschnout ve vodní lázni nastavené na 45 °C. Konečné sušené extrakty byly shromážděny a skladovány v označených sterilních lahvích pokrytých těsnou zátkou a uchovávány v mrazáku při teplotě 20 °C až do použití v experimentech.
Přípravky po sobě jdoucích extrakcí rozpouštědlem
Gomphocarpus fruticosusmateřský extrakt (vodný) byl rozdělen s rozpouštědly se zvyšující se polaritou z nepolárních na polární rozpouštědla, což zajistilo, že mohl být extrahován širší rozsah polaritních sloučenin. Následná extrakce byla postupně zahájena petroletherem, následoval chloroform, ethylacetát, butanol a voda, ve kterých byla tato rozpouštědla odstraněna a koncentrována pod rotační vakuovou výparnicí. Rostlinné materiály macerované v destilované vodě byly lyofilizovány pod lyofilizovanou sušičkou, aby se získaly práškové zbytky. Sušené extrakty byly pevně uzavřeny zátkou a skladovány ve skleněných lahvích a uchovávány v chladničce při teplotě -20 ° CC, dokud nebyly použity pro experiment.
cistanche deserticola přínos: léčba onemocnění ledvin
Chemické látky a činidla/standardní léky
Použité chemikálie a činidla nebo soupravy byly analytické třídy zakoupené z různých zdrojů. Nákup ropného etheru, chloroformu, ethylacetátu, butanolu a ethanolu byl získán společností Wisteam PLC (Addis Abeba, Etiopie), dihydrogenfosforečnan draselný (bezvodý), fosforečnan sodný (bezvodý extra čistý), pufr Tris-HCl (CaHuNO) a chlorid sodný (NaCl) byly zakoupeny od společnosti Micron International Trading House PLC (Addis Abeba Etiopie). Podobně isofluran a formaldehyd byly zakoupeny od společnosti Neway Chemicals PLC (Addis Abeba, Etiopie). Ethylenglykol (EG) a chlorid amonný (NH, Cl) byly zakoupeny od společnosti Pharma PLC (Addis Abeba, Etiopie). EDTA trubice, sérové separátorové trubice, kapilární trubice a chirurgické čepele byly zakoupeny od společnosti Micro Pharma PLC (Addis Abeba, Etiopie). Kromě toho byly soupravy pro jaterní a ledvinové funkční testy zakoupeny od společnosti Roshi PLC (Londýn, Anglie). Soupravy pro kolorimet-ric šťavelan (kyselina šťavelová) a kolorimetrický/fluorometrický test citrátu zakoupené od souprav BioVision Incorporated byly (Milpitas, USA). Prášek citrátu draselného byl získán z nemocnice Black Lion Referral Hospital (Addis Abeba, Etiopie). Cyston (polyherbální formulace) byl zakoupen od Mumbi, Indie. Kyselina askorbová, která byla zakoupena od společnosti Micron International Trading House PLC (Addis Abeba, Etiopie).
Solubilizace rostlinného extraktu a standardních léčiv Testované extrakty / léky různých koncentrací byly rozpuštěny pomocí vhodných vozidel, které byly destilovanou vodou a 3% Tween 80.Všechny rostlinné extrakty a citronan draselný byly rozpuštěny v destilované vodě v různých koncentracích. Postup použitý k rozpuštění Cystone byl podobný metodám Pha-tak a Hendre [43] a Garimella et al. [44] s některými modifikacemi. Tablety cystonu byly práškovány pomocí malty a paličky (velikost: 0,23 m) a rozpuštěny (suspendovány) v destilované vodě (900 μl) a 100 μl 3% Tween 80 (tj. 750 mg / ml). Poté byly uchovávány po dobu 3 hodin, aby se rozpustily, odstřeďovány při 1000 ot / min po dobu 5 minut a filtrovány přes filtrační papír o velikosti pórů 0,22 mm. Čirý supernatant byl odebrán a použit pro nukleaci šťavelanu vápenatého a agregační testy. Extrakty byly shromažďovány pomocí zkumavek Falcon (45 ml), vzduch utahován a skladován v chladničce až do experimentálního použití. Testovací extrakty a standardní léky byly připravovány denně a krátce před testovacím podáním v dávce 200 mg / kg extraktů, 750 mg / kg cystonu a 2,5 g / kg citronanu draselného. Dávkovací objem testované látky byl 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Deionizovaná voda byla použita k přípravě všech ex-traktů / léků a ty byly připraveny denně před testovacím podáním.
In vivo urolitiátní farmakologická vyšetření
Cílová zvířata: Byli použiti zdraví dospělí samci albínů Wistar potkanů stejné věkové skupiny od 8 do 10 týdnů a s hmotností (220-280 g), zakoupeni od Etiopského institutu veřejného zdraví (EPHI) a chováni v Biomed-ical Sciences animal laboratory, AAU. Experiment byl proveden v Laboratoři biomedicínských věd AAU a EPHI v souladu s mezinárodně uznávanými standardními pokyny pro použití zvířat ve vědeckém výzkumu. Před zahájením experimentu byly potkany aklimatizovány na standardní laboratorní podmínky (6 potkanů na polypropylenové klece) po dobu 7 dnů. Byly udržovány v kontrolovaném prostředí teploty (27±2 °C), relativní vlhkosti (55±5 %) a světla (12hodinový cyklus světlo/tma). Tyto krysy byly krmeny pravidelnými peletami (standardní strava) a po dobu 28 dnů jim byla povolena volná pitná voda (ad libitum).
cistanche deserticola přínos: léčba onemocnění ledvin
Indukce urolitiázy
Ledvinové kamenybyly indukovány pomocí ethylenglykolu (EG) spolu s chloridem amonným (NHCl) podávaným v pitné vodě potkana. V tomto hyperoxaluriálním modelu bylo 1% (w / v) NHACl podáváno s 0,75% (v / v) EG po dobu prvních 5 dnů k urychlení litiázy, poté byl přívod vody přepnut na 0,75% EG sám pro následujících 25 dní [45-47]. Expozice těchto úrovní dávek byla ve studiích na zvířatech dostatečně tolerovatelná [48]. Podávání EG vede k hyperoxalurii, která vede k ukládání CaOx v ledvinách [49]. Pokusné krysy přiřazené jakokámenléčebné skupiny dostávalykámenindukční léčba po dobu 28 dnů.
Léčebné účinky urolitiázy
V léčebné léčbě (rozpuštění) bylo celkem 54 samců potkanů al-bino Wistar náhodně rozděleno do 9 skupin zahrnujících 6 jedinců na skupinu se shodnou tělesnou hmotností. V léčebné léčbě bylo onemocnění vyvoláno převorstvím od 1. do 14. dne. Poté byl každý z bývalých traktátů /léků podáván perorálně od 15. do 28. dne současně s protokoly indukce onemocnění (EG) k určení léčebných účinků [50, 51]. Na konci 28. dne byly krysy obětovány pro biochemické a histopatologické studie. Experimentální návrh byl přiřazen jako skupina I (normální kontrola), skupina II (lithia-tiková kontrola), skupina I (K-Cit), skupina IV (cyston), skupina V(G. fruticosusPET extrakt), Skupina VI (G.fruti-náklady Chl. extrakt), Skupina VI(G. fruticosusEtOAc ex-trakt), skupina VIII (G.fruticosus BuOH extrakt) a skupina IX(G. fruticosusaq. zlomek). Jiní výzkumníci také použili citrát draselný (2,5 g / kg) jako pozitivní kontrolu [52, 53]. Dávkovací objem byl 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Kontrolní skupina dostávala destilovanou vodu jednou denně po celou dobu experimentu. Na konci 28. dne byly krysy obětovány pro biochemické a histopatologické studie.
Sběr moči a mikroskopická analýza
Moč, sérum a histologické profily jsou indikátorykámenformace i recidivy. Četnost a morfologie krystalů šťavelanu vápenatého vytvořených in vivokámenindukce byly zkoumány pomocí světelného mikroskopu (Wagtech Thatcham Berkshire RG194QD, Velká Británie, zvětšení 40x). Potkani byli umístěni do oddělených metabolických klecí a podrobeni 24hodinovému odběru moči v den 28. pro léčebný test [50]. Při analýze krystalurie byly asi 3 ml čerstvých odebraných vzorků moči vloženy do skleněné trubice a odstřeďovány při 3000 ot / min po dobu 10 minut, aby se odstranily nečistoty, a supernatanty byly vyřazeny. Tyto močové sedimenty byly použity k určení tvorby krystalů CaOx. Asi 10 μl vírových sedimentů bylo umístěno na skleněné podložní sklíčko mikroskopu (pokryté krycím skluzem) a zkoumáno na krystaly CaOx s ohledem na jejich počet a velikost pod světelným mikroskopem (40x). Krystaly vytvořené z chemikálií v moči byly pečlivě zkoumány z jiných artefaktů moči. Fotografie mikroskopických pozorování byly pořízeny digitálním fotoaparátem (Sony Cyber-shot DSC-W180 10.1MP s 3x optickým zoomem, New Jersey, USA) ručně namontovaným na něm.
Biochemická analýza moči
Na konci příslušných léčebných období byla zvířata jednotlivě ustájena v metabolických klecích a byly odebrány 24hodinové vzorky moči (okyselené a neokyselené). Moč byla okyselena 1 ml 6N HCL (kyselina chlorovodíková) a skladována při teplotě 4 °C po dobu 5 dnů. Poté byly odstředěny při 3000 ot / min po dobu 10 minut (REMI, R24) a supernatant okyselené moči byl použit k odhadu exkrecí, jako je obsah oxalátu, vápníku, hořčíku a fosfátů. V neokyseleném obsahu vzorku moči, jako je citrát, kreatinin a kyselina močová, a celkové koncentrace bílkovin byly analyzovány pomocí komerčně dostupných diagnostických souprav automatizovaným analyzátorem klinické chemie. Koncentrace oxalátu i citrátu byly analyzovány pomocí spektrofotometru s více jamkami (čtečka ELISA) podle příručky dodávané se soupravami. Pro účely kvantifikace byla standardně připravena kalibrační křivka s použitím souprav Oxalátu a Citrátu.
Sběr a analýza séra
Po skončení experimentálního období (den 28.) byly krysy anestetizovány pomocí Isofluranu a 3 ml krve sam-ples byly odebrány z retro-orbitální žíly propíchnutím kapil-lary. Sérum bylo odděleno po odstřeďování při 3000 ot./min, 20 °C°C po dobu 15 minut. Odebrané sérum bylo zkoumáno na biochemické parametry, jako je kreatinin, dusík močoviny v krvi, kyselina močová, močovina, vápník, hořčík a fosfát, automatickým analyzátorem klinické chemie (analyzátor Cobas 6000, Německo) s příslušnými diagnostickými soupravami. Koncentrace oxalátu a citrátu v mnoha jamkách stanovené pomocí 1 byly spektrofotometry (čtečka ELISA) podle příručky dodávané se soupravami. Pro účely kvantifikace byla standardně připravena kalibrační křivka s použitím souprav Oxalátu a Citrátu.
cistanche deserticola přínos: proti zánětu
Analýza homogenátu ledvin
Na konci experimentálního období (28. den) byly krysy obětovány v isofluranové anestezii, po níž následovala cervikální dislokace. Pak se břicho otevřelo a obě ledviny se odebraly z každé krysy. Izolované ledviny byly pečlivě odstraněny a vyčištěny (promyty/opláchnuty) z cizích tkání ledově studeným fyziologickým roztokem (0,15 mol/l NaCl). Levé ledviny každého zvířete byly zachovány v 10% pufrovaném neutrálním formalinu a použity pro histologické studie. Pravé ledviny byly nakrájeny na dvě stejné poloviny pomocí čepele a jedna polovina byla sušena při teplotě 80 ° C v horkovzdušné troubě. Použitá metoda byla podobná metodě Ashok et al. [35] s některými modifikacemi, kdy pevná hmotnost 200 mg (29%) celkové průměrné hmotnosti ledvin (0,67 g) byla dále zahřívána odděleně v 10 ml kyseliny chlorovodíkové (1% HCl), která byla umístěna do vroucí vodní lázně 100 ° CC po dobu 30 minut. Poté byl jemně nakrájen na kousky pomocí čepele, havarován paličkou a maltou a dále homogenizován po dobu 10 minut pomocí Ultra-Sonicator. Homogenát byl odstřeďován při 3000 ot / min po dobu 15 minut a supernatant byl odebrán pomocí označených kryotubes. Nakonec byly supernatanty použity pro odhady obsahu vápníku, oxalátu a fosfátů s komerčně dostupnými biochemickými soupravami (BioVision PLC, USA) podle protokolu výrobce [54,55].
Histopatologická vyšetření
Histopatologická vyšetření byla provedena pro ledvinové tkáně experimentálních potkanů. Všechny potkany byly obětovány humánním způsobem pomocí isofluranové anestezie na konci 28. dne (léčebné studie urolitiázy). Kousky tkáně byly odebrány z ledvin a analyzovány na urolitiární léčebný potenciál rostlinných extraktů. Tkáně byly fixovány 10% pufrovaným neutrálním roztokem formalinu a následně vloženy do parafínového vosku. Řezy (tloušťka 5 μm) byly vyříznuty pomocí rotačního mikrotomu 4060E (Německo), namontovány na skleněné sklíčko a obarveny hematoxylinem a eosinem pro studium histopatologických změn[34]. Všechna pole morfologie tkáně byla zkoumána pod světelným mikroskopem (100x zvětšení) (Wagtech Thatcham, Berkshire, RG19 4QD, Velká Británie) a fotomi-krografy byly zachyceny pomocí digitálního fotoaparátu ručně namontovaného (Sony Cyber-shot DSC-W180 10.1MP s 3x optickým zoomem, New Jersey, USA) pro další reference.
Depozice krystalů šťavelanu vápenatého
V ledvinách byly krystalové depozice stanoveny pomocí semikvantitativních testů, což je mikroskopická bodovací metoda [46,56]. Byl použit mikroskopický filarový mikromek (0,1 mm) okulár (10x, široké pole 23,3 mm, Olympus Optics OSM 212422, vyrobený v Japonsku). To znamená, že krystalové usazeniny v ledvinových tkáních byly počítány pomocí světelného mikroskopu. Stupně závažnosti krystalových usazenin byly přiřazeny jako 0 =<1 crystal(no="" crystal="" deposition),1="1-10,2=11-30," 3="31-50," 4="51-75" and="" 5="">Počítá se 75 krystalů při středních hodnotách [46].
Při počítání krystalových usazenin CaOx byla sagitální část každého renálního vzorku rozdělena do čtyř stejně velkých oblastí dvěma virtuálními čarami a byly hlášeny hodnoty v průměru 4 mikroskopických polí [57,58]. Z každé oblasti bylo poté náhodně vybráno pole 100x a byla spočítána ložiska CaOx. Snímek jedné ze čtyř oblastí pod světelným mikroskopem byl náhodně pořízen [58] pomocí digitální kamery ručně namontované na vrcholu mikroskopu.
Statistická analýza
Data byla analyzována pomocí softwaru Graph Pad Prism verze 6 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA) následovaná post-hoc Dunnettovým testem byla provedena, pokud to bylo nutné k porovnání mezi léčenými a neléčenými skupinami. Hodnoty údajů byly vyjádřeny jako střední± standardní odchylka (SD). Hodnoty P<0.05 was="" considered="" statistically="">
cistanche deserticola přínos: léčba onemocnění ledvin