Celkové glykosidy Cistanche Deserticola podporují obnovu neurologických funkcí indukcí neurovaskulární regenerace cestou Nrf- 2/Keap{1}} u potkanů ​​MCAO/R

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Fujiang Wang, Ruiyan Li, Pengfei Tu, Jianping Chen, Kewu Zeng a Yong Jiang

Pozadí:Tradiční čínská medicína Cistanche deserticola je údajně platná pro kardiovaskulární a cerebrovaskulární onemocnění. Jeho aktivní složky pro ochranu před ischemickou cévní mozkovou příhodou však nejsou jasné. Naším cílem bylo prozkoumat aktivní složkyC. deserticolaproti ischemické cévní mozkové příhodě i jejím potenciálním mechanismům.Metody:Zkoumali jsme mozkové ochranné účinky extraktů zC. deserticolacelkové glykosidy (TG), polysacharidy (PS) a oligosacharidy (OS) na potkaním modelu okluze-reperfuze střední cerebrální arterie (MCAO/R). 2, 3, 5-K vyhodnocení objemu mozkového infarktu bylo použito barvení trifenyltetrazoliumchloridem (TTC) a pro hodnocení permeability hematoencefalické bariéry (BBB) ​​byl použit test Evansovy modři. Poté výrazy CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin, Keap-1 a Nrf{{ 12}} byly analyzovány pomocí western blotu nebo imunofluorescence a aktivity MDA, SOD, CAT a GSH-Px byly analyzovány pomocí souprav.Výsledek:Léčba TG výrazně snížila skóre neurologického deficitu a objemy infarktů, podpořila angiogenezi a neurální remodelaci a účinně udržovala integritu hematoencefalické bariéry ve srovnání s modelovou skupinou. Kromě toho TG významně snížily hladiny MDA a zvýšily antioxidační aktivity (SOD, CAT a GSH-Px) v mozcích. Mezitím TG pozoruhodně snížily expresi Keap-1 a usnadnily jadernou translokaci Nrf-2. Naopak u skupin PS a OS nebyly pozorovány žádné ochranné účinky.Závěr:TG jsou hlavními aktivními složkamiC. deserticolaproti poranění mozku vyvolanému MCAO/R a ochrana je zajištěna především cestou Nrf-2/Keap-1.

Klíčová slova: Cistanche deserticola, cerebrální poranění, celkové glykosidy, polysacharidy, oligosacharidy, dráha Nrf-2/Keap- 1

ÚVOD

Cévní mozkové příhody jsou ve světě považovány za hlavní příčinu úmrtí a invalidity (Donnan et al., 2008). Téměř 87 procent všech případů mrtvice je vyvoláno ischemickou mrtvicí (Ovbiagele a Nguyen-Huynh, 2011). V současné době je nejúčinnějším prostředkem a jediným lékem schváleným FDA používaným k léčbě ischemické mozkové příhody rekombinantní tkáňový aktivátor plasminogenu. Velký počet pacientů s cévní mozkovou příhodou však na tento lék nereaguje kvůli jeho úzkému terapeutickému časovému oknu a vážnému riziku hemoragických komplikací (Lee et al., 2012; Schellinger a Kohrmann, 2014). Hlavní výzvou trombolytické léčby je ischemicko/reperfuzní (I/R) poškození, které je považováno za hlavní příčinu poškození mozku a destrukce funkce. Reperfuze po cerebrální ischemii zvyšuje riziko krvácení do mozku a zároveň vede k neurovaskulárnímu poškození a produkci nadměrného množství reaktivních forem kyslíku (ROS), které poškozují hematoencefalickou bariéru (Alluri et al., 2015). Několik studií potvrdilo, že narušení BBB je hlavní příčinou patogeneze ischemické cévní mozkové příhody (Cao et al., 2016b).

BBB se skládá hlavně z endoteliálních buněk, pericytů, astrocytů, neuronů a bazálních membrán. Jádrem BBB jsou cerebrální mikrovaskulární endoteliální buňky, které jsou spojeny těsnými spoji, a tak omezují exogenní molekuly do mozku. Patologické změny těsných spojení – zejména occludin, claudin{0}} a zonula occludens-1 (ZO-1) – významně ovlivňují funkci BBB během ischemické mozkové příhody, zejména propustnost bariéry (Liu et al., 2014; Hu et al., 2018; Liu a kol., 2019). Během I/R období je nadměrné ROS jedním z hlavních faktorů vedoucích k přímému poškození mozkových neuronů (Ding et al., 2014). Nadprodukce ROS vede k degradaci určitých spojení a narušení BBB, což má za následek vstup exogenních molekul do mozku přes BBB, což vede ke zhoršení poškození mozku (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Proto byla ochrana BBB antioxidanty považována za potenciální způsob, jak zabránit reperfuznímu poškození.

Kromě rozpadu BBB může I/R vést k neurovaskulárnímu poškození a smrti neuronů (Jung et al., 2010). Během mrtvice může být důsledkem oxidativního stresu zvýšená smrt neuronových buněk (Chi et al., 2018) a četné studie prokázaly, že ROS zhoršuje závažnost mrtvice a neurologické poškození (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack a kol., 2006). Přestože klinické studie nepřinesly uspokojivé výsledky, neuroprotekce je stále slibnou strategií léčby akutní ischemické cévní mozkové příhody (Moretti et al., 2015). Nalezení účinných neuroprotektivních léků k léčbě mrtvice je tedy přínosem pro pacienty s mrtvicí.

Tradiční čínská medicína (TCM) přijímá opatření k zásahu proti vnitřní nerovnováze organismu (Gaire, 2018). Vzhledem ke komplexní patogenezi ischemických cévních mozkových příhod hraje multifaktoriální účinek TCM a jejích aktivních složek kritickou roli v léčbě cévních mozkových příhod. Cistanche deserticola YC Ma, rozšířená v aridních nebo polosuchých oblastech Mongolska a severozápadní Číny, je v Číně více než 1,{3}} rok široce používaná bylina TCM k léčbě různých nemocí, jako je zapomnětlivost a deprese. . Modernífarmakologické studie ukázaly, že surové extrakty zC. deserticolavykazovaly četné farmakologické aktivity, jako je posílení funkce učení a paměti, neuroprotekce, posílení imunity, antioxidační účinky, účinky proti stárnutí a proti únavě (Ko a Leung, 2007; Wang a kol., 2012; Li a kol., 2015). Chemická analýza C. deserticola ukázala, že mezi její hlavní složky patří fenylethanoidní glykosidy, iridoidní glykosidy, polysacharidy a oligosacharidy (Jiang a Tu, 2009). Aktivní složky C. deserticola pro ochranu mozku však nejsou příliš jasné.Neuroprotektivní vlastnost C. deserticola naznačuje její terapeutický potenciál u kognitivních onemocnění, jako je mrtvice a deprese, stejně jako Alzheimerova choroba (Wang et al., 2017). Nicméně, výzkum o dopaduC. deserticolana mrtvici, včetně jejích aktivních složek a mechanismů působení, je velmi omezený. V této práci jsme zkoumali ochranný účinek tří extraktů z C. deserticola, celkových glykosidů (TG, fenylethanoidní glykosidy a další glykosidy), polysacharidů (PS) a oligosacharidů (OS) na mozková I/R poranění. Naše zjištění mohou přispět k přesné klinické aplikaciC. deserticolaa poskytují kandidátní činidlo pro terapii ischemické mrtvice.

MATERIÁLY A METODY

Chemikálie a činidla

Stonky Cistanche deserticola byly zakoupeny z Alashanu ve Vnitřním Mongolsku a identifikovány jedním z autorů (P.-F. Tu). TG, PS a OS byly připraveny podle naší dříve popsané metody (Gao et al., 2015). Kvantitativní analýza TG byla provedena pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), jak bylo popsáno dříve (Li et al, 2019), a její chromatogram je znázorněn na obrázku 1. Hlavními složkami TG jsou echinakosid, tubulosid A, akteosid, iso- akteosid a 2'-acetylakteosid; jejich obsahy jsou 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g, respektive 12,045 mg/g. Obsah PS je 69,42 procenta a OS 65,24 procenta, jak bylo stanoveno pomocí HPLC a analýzy fenol-kyselina sírová (Zhang A. et al., 2018; Shi et al., 2019).

Standardní reference echinakosidu (A0282), tubulosidu A (A0942), akteosidu (A0280), iso-akteosidu (A0281) a 2'-acetylakteosidu (A0943) byly zakoupeny od Chengdu Must Biotechnology (Sichuan, Čína). Čistoty všech standardů jsou více než 98 procent. Soupravy Nissl Stain H&E byly zakoupeny od společnosti Boster (Wuhan, Čína). Edaravone (T0407-1) byl zakoupen od společnosti Target Mol (Shanghai, Čína). Králičí anti-krysí MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap{16}} (ab66620) a myší anti-krysí CD31 (ab24590) byly zakoupeny od Abcam Inc (Cambridge, MA, USA). Králičí anti-krysí Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) a Occludin (BS72035) byly zakoupeny od Bioworld Technology (Nanjing, Čína). Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) byl zdrojem králičího anti-krysího synapsinu-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-aktinu hladkého svalstva (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) byl zakoupen od Proteintech Group, Inc. (Chicago, USA). Sekundární protilátky byly dodány společností Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, Čína). Hoechst 33258 byl získán od Beyotime (Jiangsu, Čína).

Zvířata

Potkani Sprague-Dawley (samci, vážící 250–300 g) byli získáni od Vital River Laboratory Animal Technology (Peking, Čína) a umístěni v klimatizované místnosti udržované v cyklu světlo/tma 12 hodin. Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny podle pokynů ARRIVE pro výzkum na zvířatech (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) a schváleny Institutional Animal Care and Use Committee of Peking University Health Science Center (LA2019123).

Experimentální protokoly na zvířatech

Krysy byly podrobeny MCAO/R, jak bylo popsáno dříve (Wang et al., 2018). Stručně řečeno, levá společná krční tepna (CCA), vnější krční tepna (ECA) a vnitřní krkavice (ICA) byly obnaženy a z ECA byla do ICA zavedena 3-0 nylonová monofilní sutura, dokud nedosáhla středu cerebrální arterie (MCA). Po 1,5 h okluze MCA byla simulována reperfuze odstraněním vlákna. Během chirurgického zákroku byla tělesná teplota všech krys udržována na 37,0 °C.

Správa léčiv

Krysy byly náhodně rozděleny do šesti skupin pomocí softwaru SPSS verze 22.0 jak je popsáno (Jiang et al., 2014): normální skupina (NOR); modelová skupina (MOD); skupina edaravonu (pozitivní lék, 6 ml/kg, EDI); skupina TG (280 mg/kg, TG); Skupina PSs (280 mg/kg, PSs) a skupina OSs (280 mg/kg, OSs). TG, PS a OS byly podávány jednou denně po MCAO/R po dobu 14 dnů. Skupiny NOR a MOD byly ošetřeny normálním fyziologickým roztokem. Počty zvířat jsou uvedeny v tabulce 1.

Měření hmotnosti a skóre modifikovaného neurologického deficitu (mNSS)

Tělesná hmotnost byla monitorována 14. den pomocí ADVENTURE™ Digital Scale (OHAUS, New Jersey, USA). mNSS byla hodnocena podle metody popsané FJ Wangem (Wang et al., 2018), s menšími revizemi.

2, 3, 5-Barvení trifenyltetrazoliumchloridem (TTC).

Objem infarktu byl měřen, jak bylo popsáno dříve (Wang et al., 2015). Stručně řečeno, mozky byly rozděleny do sedmi stejně rozmístěných koronálních bloků (2 mm). Tyto řezy byly obarveny 2% TTC (Coolaber, Peking, Čína) při 37 stupních po dobu 15 minut. Objem infarktu ( procenta )=(objem ipsilaterální ischemické hemisféry – objem kontralaterální ischemické hemisféry)/objem kontralaterální ischemické hemisféry × 100.

Barvení Nissl a H&E

Krysy byly hluboce anestetizovány a celý mozek byl poté rychle odstraněn z lebky a fixován pomocí 4% paraformaldehydu a zalit do parafinového vosku a nakrájen na plátky o tloušťce 7 um. Řezy byly obarveny Nissl a H&E. V této studii bylo v každém vzorku tkáně pomocí světelného mikroskopu zachyceno šest náhodných polí 200 × 200 µm. Počet Nisslových těl byl počítán pomocí softwaru IPP verze 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, USA).

Evans Blue Assay

Krysám byla po MCAO/R injikována 2% EB (Coolaber Science & Technology Co., LTD). O dvě hodiny později byly krysy anestetizovány a celý mozek byl poté rychle vyjmut a homogenizován v acetonu. Supernatanty byly analyzovány při 620 nm čtečkou absorbance 800 TS (BioTek, USA).

Měření aktivity katalázy (CAT), superoxiddismutázy (SOD), malondialdehydu (MDA) a glutathionperoxidázy (GSH-Px)

Všechny vzorky séra byly centrifugovány při 4, 000 × ot./min po dobu 15 minut při 4 stupních a poté analyzovány k detekci aktivit MDA, CAT, SOD a GSH-Px podle pokynů výrobce (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Čína).

Western blotting analýza

Mozkové tkáně (100 mg) odebrané od každé krysy byly homogenizovány a lyžovány v RIPA lyzačním pufru a poté analyzovány pro detekci koncentrace proteinu pomocí BCA kitu (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.). Tkáňové celkové proteiny byly naneseny na 10% SDS-PAGE gely a přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Membrána byla blokována pomocí 5% odstředěného mléka, poté inkubována přes noc s primárními protilátkami při 4 stupních. Membrána byla poté inkubována se sekundární protilátkou. Analýza Western blot byla analyzována pomocí Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, Čína).

Imunofluorescenční analýza

Bylo provedeno imunofluorescenční barvení pro CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 a Keap-1. Primární protilátky proti Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludinu, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 a Keap-1 byly naředěny na 1:200 a 1:100. Sekundární protilátka Alexa Flur 488 myší anti-králičí IgG a rhodamin (TRITC) kozí anti-králičí IgG byly obě naředěny na 1:200. Jádra byla obarvena pomocí Hoechst 33258. Obrázky byly zachyceny pomocí Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA). Exprese proteinu byla analyzována pomocí softwaru IPP verze 6.0.

Statistická analýza

Všechna data byla popsána jako průměr ± SD. Pro statistickou analýzu byl proveden software SPSS verze 22.0. Při porovnávání různých skupin byla použita jednocestná ANOVA. P < 0.05="" bylo="" považováno="" za="" statistický="">

VÝSLEDEK

TG zvyšují tělesnou hmotnost a snižují poškození mozku u potkanů ​​MCAO/R

Po 14 dnech léčby pomocí TG, PS, Oss a EDI byly vyhodnoceny tělesné hmotnosti, neurologické deficity a infarktové objemy I/R potkanů. Výsledky ukázaly, že tělesné hmotnosti ve skupině MOD byly výrazně sníženy, zatímco snížené hmotnosti ve skupinách TG, PS a EDI byly zvýšeny (obrázek 2A). Skóre neurologického deficitu bylo podstatně sníženo pomocí EDI a TG (obrázek 2B). Mozkové řezy u krys skupiny NOR byly tmavě červené a nebyly tam žádné infarkty, zatímco krysy ze skupiny MOD vykazovaly velký ipsilaterální cerebrální infarkt. Po léčbě TG byly objemy infarktu významně sníženy (obrázky 2C, D). Léčba PS a OS nevykázala žádný zjevný účinek na výše uvedené indexy. Výše uvedená data ukázala, že TG mohly výrazně zmírnit I/R-indukované cerebrální poranění, ale PS a OS ne.

TG zlepšují histopatologické poškození u MCAO/R potkanů

K určení některých účinků léčby TG, PS a OS na histopatologická poškození bylo provedeno barvení H&E, aby se odhalilo patologické poškození. Histomorfologické struktury mozků ve skupině NOR byly uspořádány pravidelně. Morfologické změny ve skupinách TGs byly mírnější než ve skupině MOD. Avšak léčebné skupiny s PS a OS nevykazovaly žádné významné zlepšení morfologických změn (obrázek 3).

TG zmírňují neuronální poranění po I/R-indukovaných krysách

Nissl barvení ukázalo histopatologické změny neuronů v polostínu ischemické oblasti. Jak je znázorněno na obrázku 4, normální neurony měly jasné jadérko a neporušenou strukturu. Ve skupině MOD měly neurony zvětšené mezibuněčné prostory. Těla nisslů zmizela, byla scvrklá a hluboce zašpiněná. Tyto změny však byly zřídka pozorovány ve skupinách EDI, TG a PS. Tyto výsledky ukázaly, že TG a PS by mohly významně zmírnit poškození neuronů vyvolané ischemií/reperfuzí.

TG zmírňují narušení BBB po krysách ošetřených I/R

Evansova modř je klasická metoda pro výzkum změny permeability BBB. Výsledky experimentu ukázaly, že zvýšené množství Evansovy modři bylo pozorováno ve skupině MOD, zatímco u krys ošetřených TG a EDI bylo významně snížené množství Evansovy modři. Navíc nebyl žádný významný rozdíl mezi terapeutickými skupinami PS a OS (obrázek 5). Tyto výsledky naznačují, že TG mohou významně zmírnit narušení BBB.

TG podporují angiogenezi u I/R zraněných krys

Novější studie ukazují, že angiogeneze hraje kritickou roli v neurologickém funkčním zotavení a prognostickém výsledku po akutní ischemické mrtvici (Yuen et al., 2015). K vyhodnocení účinků TG, PS a OS na angiogenezi byly CD31 a a-SMA použity ke kvantifikaci počtu kapilár. Imunofluorescenční barvení ukázalo, že skupina MOD způsobila významný pokles exprese CD31 (obrázky 6A, B) a a-SMA (obrázky 6C, D) v polostínu ischemických oblastí I/R potkanů ​​ve srovnání s normálními potkany . Tento výsledek ukázal, že I/R může způsobit vaskulární poškození v kortexovém polostínu ischemických hemisfér. Léčba TG a EDI však pozoruhodně zvýšila hustotu kapilár, angiogenezi a arteriogenezi, jak naznačují zvýšené exprese CD31 a a-SMA. Tyto výsledky naznačují, že TG by mohly podporovat angiogenezi v ischemickém polostínu I/R krys, ale PS a OS ne.

TG zvyšují expresi proteinů těsného spojení u I/R krys

Narušení BBB může zvýšit obsah vody v mozku a otok tkání, což vede k poškození mozku. Proteiny těsného spojení jsou důležitými strukturálními složkami BBB (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Aby se otestovalo, zda léčba TG, PS a OS po cévní mozkové příhodě může ovlivnit integritu BBB, byly exprese ZO-1, claudinu-5 a okludinu provedeny imunofluorescenční analýzou. Výsledky ukázaly, že exprese claudinu-5, okludinu a ZO-1 byly ve skupině MOD viditelně sníženy. Po 14 dnech podávání TG se však podstatně zvýšily. Skupiny PS a OS nevykazovaly žádné významné změny v expresi těchto proteinů (obrázek 7). Tato data naznačují, že TG mohou regulovat expresi proteinu těsného spojení a pravděpodobně zachovat integritu BBB po I/R poškození. TG zvyšují pokrytí pericytů na kapilárách u krys poraněných I/R Pokrytí pericytů na kapilárách hraje zásadní roli při udržování integrity BBB (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Testovali jsme tedy, zda lze pokrytí pericytem zvýšit léčbou TG, PS a OS. Výsledky analýzy intenzity imunofluorescence ukázaly, že exprese PDGFRb i CD31 byly dramaticky sníženy ve skupině MOD. Podání TG krysám I/R významně obnovilo nebo dokonce zvýšilo intenzity exprese PDGFRb a CD31, ale nebyl pozorován žádný rozdíl v léčebných skupinách PS a OS (obrázek 8). Léčba TG by tedy mohla významně zvýšit pokrytí pericytů. Tato zjištění dále potvrdila, že TG mohou zachovat integritu BBB po I/R.

TG podporují neurální remodelaci u I/R zraněných krys

Podle četných studií může neurogeneze po mrtvici výrazně zlepšit funkční zotavení (Grefkes a Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Synaptophysin (SYN), proteiny postsynaptické denzity 95 (PSD-95) a protein 2 spojený s mikrotubuly (MAP-2) byly použity jako markery pro vyšetření neuronální plasticity v ischemickém polostínu kůry. Pro posouzení účinků léčby TG, PS a OS na neurogenezi u I/R zraněných potkanů ​​byly provedeny imunofluorescence a western blot pro SYN, PSD95 a MAP-2 exprese. Jak je znázorněno na obrázcích 9 a 10, hladiny exprese SYN, PSD95 a MAP{12}} u I/R krys po 14 dnech reperfuze poklesly ve srovnání s NOR krysami, zatímco vyléčení TGs a PSs mohlo významně zvýšit- regulují úroveň jejich exprese. Skupina OSs nezaznamenala žádnou významnou změnu ve srovnání se skupinou MOD. Data ukázala, že léčba TG a PS byla schopna dramaticky podpořit neurální remodelaci po I/R poranění.

TGs Alter Nrf-2 a Keep{1}} Expressions in I/R Injured Rats

Oxidační stres je hlavním patogenním mechanismem I/R poranění (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Studie potvrdily, že Nrf-2 je hlavním regulátorem antioxidačních reakcí (Thompson et al., 2015). Abychom prozkoumali oxidační reakce zprostředkované Nrf-2 a Keap{5}} po poranění I/R, hodnotili jsme cytoplazmatickou expresi a také jadernou translokaci Keap-1. Mezitím byla také testována exprese Nrf-2 v I/R poraněných krysích mozkových tkáních (obrázky 10 a 11). Podle imunofluorescenční analýzy bylo zjištěno, že Nrf{10}} se nachází hlavně v cytoplazmě ve skupině NOR. Ve skupině TGs byla exprese Nrf-2 v cytoplazmatické lokalizaci downregulována, ale upregulována v jádře, a byla také pozorována snížená exprese Keap{12}}. Data ukázala, že ochrana mozku TG by mohla být spojena s modulací Nrf-2 a Keap-1

TG zmírňují oxidační stres mozkové tkáně u I/R zraněných potkanů

Pro potvrzení antioxidačních účinků TG byly hodnoceny aktivity SOD, CAT, GSH-Px a MDA u I/R zraněných potkanů. Na obrázku 12 byl obsah MDA výrazně zvýšen ve skupině MOD a současně byly sníženy aktivity SOD, CAT a GSH-Px ve srovnání s normálními potkany. Naopak léčba TG vedla k významnému snížení obsahu MDA a zvýšení aktivit SOD, CAT a GSH-Px. Tyto výsledky dále potvrdily antioxidační aktivitu TG.

DISKUSE

Mnoho studií naznačuje, že TCMC. deserticolamá rozsáhlé biologické aktivity, např. zlepšuje schopnost učení, paměť a imunitu (Dong a kol., 2007; Jiang a Tu, 2009; Wang a kol., 2017; Xia a kol., 2018). Aktivní složky C. deserticola pro neuroprotekci však zůstávají nejasné. Současná práce si klade za cíl odfiltrovat aktivní komponentyC. deserticolaproti ischemické cévní mozkové příhodě na modelu MCAO/R. Tři extrakty z C. deserticola (TG, PS a OS) byly použity k hodnocení jejich účinků na MCAO/R potkany, stejně jako možných mechanismů.

Cévní mozková příhoda je běžné akutní cerebrovaskulární onemocnění. Epidemiologické studie ukazují, že mrtvice je častější u mužů než u žen (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik a Bushnell, 2017). V našem experimentu tedy byli pro testy adoptováni samci potkanů. Naše výsledky prokázaly, že indukce I/R zrychlila oxidační stres a objem infarktu, porušila BBB a vedla k nervovému a cerebrovaskulárnímu poškození. Po screeningu bylo zjištěno, že TG snižují objem infarktu a podporují neurální remodelaci a angiogenezi. Navíc bylo pozorováno, že TG udržují integritu BBB po I/R poranění. Naopak, PS a OS nepřinášejí žádné významné zmírnění poranění I/R. TG jsou tedy považovány za hlavní aktivní frakciC. deserticolapro neuroprotekci, potenciálně prostřednictvím podpory neurální remodelace, angiogeneze a integrity BBB prostřednictvím aktivace dráhy Nrf- 2/Keap{1}}.

Přibývající důkazy naznačují, že vytvoření účinné kolaterální cirkulace je významně důležité pro zamezení vzniku infarktu a ischemické penumbry a je kritickou léčbou v časné fázi ischemické cévní mozkové příhody (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Proliferace vaskulárních endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva po ischemickém infarktu určuje vytvoření kolaterálního oběhu. Modely ischemie však mají společný jev – to znamená, že oxidační stres široce existuje v mozkové mikrovaskulatuře. Údaje ze studií ukázaly, že velké množství antioxidantů může narušit funkci BBB a vlastnosti angiogeneze (Mentor a Fisher, 2017). CD31 a a-SMA jsou markery vaskulárních endoteliálních buněk, respektive buněk hladkého svalstva (Saboor et al., 2016). Zkoumat vliv na výše uvedenou buněčnou proliferaci extraktů zC. deserticolajsme zkoumali exprese CD31 a a-SMA v homogenátu mozkové ischemické penumbry. Naše data ukázala, že TG výrazně zvýšily expresi CD31 a a-SMA. U skupin PS a OS však nebyly žádné významné rozdíly. Proto jsme odvodili, že TG mohou snížit poškození mozku podporou angiogeneze prostřednictvím zvýšení exprese CD31 a a-SMA, zatímco PS a OS neposkytují žádnou takovou ochranu před poškozením mozku. Tyto výsledky dále potvrdily, že pouze TG mohou zabránit poranění mozku I/R.

Ischemická cévní mozková příhoda může být považována za výsledek mozkové ischemie způsobené poruchou neuronální plasticity nebo remodelací oblastí mozku. Většina pacientů s mrtvicí trpí neurologickým deficitem. Aktivace neurogeneze je slibnou strategií pro pacienty s mrtvicí ke zlepšení jejich neurologických funkcí (Cramer a Chopp, 2000). Neurogeneze se přímo účastní obnovy neurologických funkcí po I/R poranění mozku (Zhang et al., 2019). Předchozí výzkumy ukazují, že TG mohou zlepšit míru přežití hipokampálních pyramidálních buněk a indukovat neurogenezi (Lian et al., 2017). Oxidační stres způsobuje ztrátu neuronů během mnoha onemocnění, jako je Parkinsonova choroba, mrtvice a tak dále (Duan a Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2 přepisuje mnoho genů souvisejících s neuroprotekcí v jejich promotorové oblasti, včetně SOD, MDA, CAT a g glutamylcystein ligáz atd. (Satoh et al., 2006). Proteiny SYN, PSD-95 a MAP{8}}, které jsou úzce spojeny se synaptickou tvorbou a neurotransmisí, lze považovat za markery plasticity neuronů ve výzkumu v oblasti ischemického polostínu. Po studiu jsme zjistili, že léčba pomocí TG může významně zvýšit expresi PSD95, SYN a MAP-2, což naznačuje, že cerebrální ochrana TGs korelovala se zvýšenou neuronální plasticitou během I/R. Je však škoda, že zde není patrný rozdíl pro PS a skupiny OS. Tyto výsledky ukázaly, že TG mohou zvýšit neuroplasticitu po mozkovém I/R poranění.Zobrazovací výzkum u pacientů s mrtvicí ukázal, že dysfunkci BBB lze považovat za nápadný atribut periischemického mozku (Bang et al., 2007). TJs, které se skládají z cytoplazmatických proteinů, transmembránových proteinů a spojovacích adhezních molekul mezi kapilárními endoteliálními buňkami, jsou velmi důležité pro udržení integrity BBB (Ye et al., 2019). Mezi nimi jsou ZO-1, claudin-5 a okludin nejdůležitějšími proteiny v TJ. Přibývající důkazy ukazují, že zvýšená permeabilita BBB vyvolaná ischemií obecně koreluje se změnami ZO-1, claudinu-5 a okludinu (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu a kol., 2017; Liu a kol., 2018). V této práci výsledky prokázaly, že ačkoli TG mohly významně zvýšit expresi proteinů ZO-1, claudinu-5 a okludinu v mozkových tkáních indukovaných MCAO, nedělaly to ani PS ani OS. BBB se skládá z mozkových endoteliálních buněk a je úzce spojena s pericyty (Nyul-Toth et al., 2016). Pericyty jsou životně důležité pro integritu BBB (Bell et al., 2010). Ischemická cévní mozková příhoda spouští smrt pericytů a odloučení od endoteliálních buněk mozku v akutní fázi, čímž destabilizuje mikrovaskulaturu a mění vlastnosti BBB (Zechariah et al., 2013). Naše data ukázala, že TG mohou zvýšit pokrytí pericytů na kapilárách a zvýšit hladiny exprese ZO-1, claudinu-5 a okludinu. Tyto jevy prokázaly, že TG mohou účinně chránit integritu BBB po cerebrálním I/R poranění. Stručně řečeno, TG mohou zmírnit cerebrální poškození mnoha způsoby, jako je podpora angiogeneze, zlepšení neuronální plasticity a udržení integrity BBB.

Poté jsme zkoumali signální dráhu, abychom prozkoumali mechanismus, který je základem ochrany mozku TG. Proces I/R poškození je multifaktoriální, a tak se na patogenezi podílí četné mechanismy. Oxidační stres je základním rizikovým faktorem přispívajícím k I/R-indukovaným poraněním mozku (Suda et al., 2013), jako je poškození struktury BBB, vaskulární endoteliální dysfunkce a zhoršení ischemického poškození neuronů (Xiong et al., 2015; Caglayan a kol., 2019; Priestley a kol., 2019). Oxidační stres se tak stal atraktivním terapeutickým cílem při poranění mozku vyvolaném I/R. Enzymy fáze 2, které jsou zprostředkovány jaderným faktorem E2-faktorem souvisejícím-2 (Nrf-2), byly považovány za důležitý prostředek, kterým se neurony chrání před oxidačním stresem (Suzuki a Yamamoto, 2015; Ya a kol., 2018). Přibývající důkazy naznačují, že aktivace Nrf-2 během I/R je potenciálním terapeutickým cílem pro neuroprotekci (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, jako důležitý regulátor endogenní antioxidační obrany, zprostředkovává hladinu hemoxygenázy 1 (HO-1) a dalších antioxidačních enzymů, jako je NAD(P)H chinonoxidoreduktáza 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH a MDA (Siow a kol., 2007; Ding a kol., 2014). Kromě toho hraje Nrf-2 důležitou regulační roli v angiogenezi. Tato studie ukazuje, že Nrf-2 může být významně zesílen a aktivován v procesu vaskulárního vývoje (Wei et al., 2013).

Jak bylo popsáno dříve (Jiang a Tu, 2009), TG obsahují mnoho bioaktivních sloučenin, například echinakosid, tubulosid A, akteosid, iso-akteosid a 2'-acetylakteosid, a některé z nich vykazovaly neuroprotektivní funkce po cerebrálních I/R zranění (Peng et al., 2016). Echinakosid má mnoho farmakologických účinků, jako je antioxidace, anti-senescence, neuroprotekce, protizánětlivé účinky, podpora jizvy, hepatoprotekce, podpora tvorby kostí a protinádorové aktivity (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. a kol., 2018; Ji a kol., 2019; Xu a kol., 2019). Nedávno byl echinakosid identifikován jako silný antioxidant v centrálním nervovém systému (Lu et al., 2016). Echinakosid může snížit obsah MDA a zlepšit aktivity SOD a GSH Px při ischemickém poranění mozku a analýza molekulárního dokování ukázala, že echinakosid se může vázat na Keap-1, což vede k jaderné translokaci Nrf-2 (Li a kol., 2018). Studie Xia ukázala, že akteosid by mohl snížit objem infarktu a obsah vody v mozku, aby se zlepšil neurologický deficit u MCAO/R potkanů ​​prostřednictvím zmírnění oxidačního stresu (Xia et al., 2018). Jiné studie prokázaly, že iso-akteosid by mohl zvýšit aktivity buněčných antioxidačních enzymů, SOD a CAT v H2O2-ošetřených V79-4 buňkách (Chae et al., 2005). Na základě výše uvedených zpráv o aktivních sloučeninách obsažených v TG je možné odvodit, že TG by mohly chránit proti ischemické mrtvici prostřednictvím antioxidačních cest.

Li referoval o neuroprotektivních účincích fenylethanoidních glykosidů (PhGs) na H2O2-indukovanou apoptózu na buňkách PC12 prostřednictvím dráhy Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Tyto PhG byly významně potlačeny spuštěním jaderné translokace Nrf2 a zvýšením exprese HO-1, NQO1, katalytické podjednotky glutamát-cystein ligázy (GCLC) a podjednotky modifikátoru glutamát-cystein ligázy (GCLM) (Li et al., 2018 Gong a kol., 2019). Tato zjištění proto naznačují, že dráha Nrf-2/ARE hraje klíčovou roli v ochranných účincích na neuronové buňky zprostředkovaných PhGs. Podobně jsme v této studii zjistili, že TG mohou snížit hladinu MDA a zvýšit hladiny SOD, CAT a GSH-Px u I/R potkanů. Mezitím TG mohly zvýšit expresi Nrf2 v jádře, snížit odpovídající expresi v cytoplazmě a významně snížit expresi Keap{16}}. Proto se cesta Nrf-2/Keap-1 může podílet na neuroprotektivních účincích zprostředkovaných TG. Další validace této dráhy by byla v budoucnu provedena in vitro na buněčné kultuře s modely poškození kyslíku a glukózy/reoxygenace. Navíc,C. deserticolaextrakty byly v naší studii podávány nepřetržitě po dobu 14 dnů. Protože neurogeneze dospělých by ovlivnila interpretaci neuroprotektivních účinků během 14 dnů reperfuze, nelze neurogenezi vyloučit v našem současném designu experimentu při zkoumání neuroprotektivního účinku CT. To je omezení našeho výzkumu.

Na závěr, je to TGs odC. deserticolakteré mohou zvýšit angiogenezi a neurogenezi, stejně jako zachovat integritu BBB u krys s poraněním I/R, ale ne PS a OS. Účinky by mohly být zprostředkovány aktivací cesty Nrf-2/Keap-1.