Celkové glykosidy ze stonků Cistanche Tubulosa zmírňují chování podobné depresi

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Li Fan, Ying Peng, Jingwen Wang, Ping Ma, Lijuan Zhao, Xiaobo Li *

ABSTRAKTNÍ

Pozadí:Jako nejčastěji používanýledvin-jang detoxikační bylinav tradiční čínské medicíně se sušené šťavnaté stonky Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) ukázaly jako účinné při léčbě deprese. Složky antidepresiv a jejich základní mechanismus však zůstávají nejasné.

Účel:Prozkoumat aktivní složky CT proti depresi, stejně jako potenciální mechanismy. Návrh studie a metody: Testy behaviorálního zoufalství byly použity k hodnocení antidepresivních aktivit polysacharidů, oligosacharidů a různých frakcí obohacených glykosidy separovaných z CT, stejně jako typických metabolitů střevní mikroflóry včetně kyseliny 3-hydroxyfenylpropionové ({{2 }}HPP) a hydroxytyrosol (HT). Dále byly zkoumány účinky bioaktivních frakcí a metabolitů na modely chronického nepředvídatelného mírného stresu (CUMS) pomocí mnoha farmakodynamických a biochemických analýz. Změny v histologii tlustého střeva a střevní bariéře byly pozorovány barvením a imunohistochemickou analýzou. Střevní mikrobiální vlastnosti a metabolismus tryptofan-kynureninu byly zkoumány pomocí sekvenování 16S rRNA a western-blottingu.

Výsledek:Celkové glykosidy (TG) dramaticky zmírnily chování podobné depresi ve srovnání s různými oddělenými frakcemi, což se odráží v synergických účincích fenylethanoidních a iridoidních glykosidů na hyperaktivaci osy hypotalamus-hypofýza-nadledviny (HPA), těžký neuro- a periferní zánět, a deficity 5-hydroxytryptaminu (5-HT) a neurotrofického faktoru odvozeného z mozku v hipokampu. Navíc TG zmírnil zánět nízkého stupně v tlustém střevě a narušení střevní bariéry a množství několika bakteriálních rodů vysoce korelovalo s osou HPA a zánětem u CUMS potkanů. V souladu s tím byla exprese indoleaminu 2, 3-dioxygenázy 1 (IDO1) v tlustém střevě významně snížena po podání TG, doprovázená supresí metabolismu tryptofan-kynureninu. Na druhou stranu, HT také vykazovala výrazný antidepresivní účinek zlepšením funkce osy HPA, uvolňováním prozánětlivých cytokinů a metabolismem tryptofanu-kynureninu, zatímco nebyla schopna do značné míry upravit narušenou střevní mikrobiotu stejným způsobem jako TG. Překvapivě, lepší než fluoxetin, TG a HT by mohly dále zlepšit dysfunkci hypotalamo-hypofyzární-gonadální osy a abnormální metabolismus cyklických nukleotidů.

výhody cistanche salsymohl dálezlepšit dysfunkci.

Úvod

Deprese je chronická, opakující se a potenciálně život ohrožující duševní porucha, která postihuje až 20 procent populace na celém světě (Nabavi et al., 2017). V současné době, přestože byla schválena řada antidepresiv, jsou vedlejší účinky znepokojivé. Zejména dlouhodobá léčba selektivními inhibitory zpětného vychytávání serotoninu (SSRI), jako je fluoxetin, hlavní farmakologické činidlo pro depresi, zhoršila problémy, jako je chronická sexuální dysfunkce (Bijlsma et al., 2014); to přitáhlo stále větší pozornost k objevu nových antidepresiv z přírodních bylin (Wang et al., 2019). V teorii tradiční čínské medicíny (TCM) vede nedostatek ledvin a jangu k výkonnostním rysům podobným klinickým symptomům deprese, jako je pocit na dně, ztráta zájmu a sentimentalita (Yang et al., 2020), která podporuje myšlenky. ke zmírnění depresivního chování tonizací ledvinového jangu. Shodou okolností mnoho bylin, které tonizují ledviny a jang, má tu výhodu, že zlepšuje sexuální funkce (Wu et al., 2015). Takové studie nás nutí věnovat pozornost potenciální aplikaci Cistanches Herba, která je nejčastěji používanou tonizující bylinou ledvin a jang v TCM a je účinná při léčbě mužské sexuální dysfunkce (Wang et al., 2020), pokud jde o vývoj antidepresiv. Cistanches Herba, oficiálně zaznamenané jako sušené sukulentní stonky Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (CT) a Cistanche deserticola (YC Ma) v čínském lékopisu (Wang et al., 2017), byly použity v Číně a dalších východoasijských zemích. od 15. století k léčbě stavů, jako je nedostatek jangu ledvin, impotence a ženská neplodnost. Moderní farmakologické studie naznačují, že Cistanches Herba má četné biologické aktivity, jako je posílení imunity, neuroprotekce, antioxidační účinky, účinky proti stárnutí a proti únavě (Wang et al., 2017). Neuroprotektivní vlastnosti Cistanches Herba naznačují jeho terapeutický potenciál u kognitivních onemocnění, jako je mrtvice, deprese a Alzheimerova choroba (Wang et al., 2020). V naší předchozí studii jsme zjistili, že CT extrakt zmírnil depresivní chování potkanů ​​s chronickým nepředvídatelným mírným stresem (CUMS) (Li et al., 2018). Chemická analýza CT dosud ukázala, že mezi její hlavní složky patří fenylethanoidní glykosidy, iridoidní glykosidy, polysacharidy a oligosacharidy (Jiang a Tu, 2009), avšak typ sloučeniny, která hraje dominantní roli v jejím antidepresivním účinku, zůstává nejasný.

Četné studie potvrdily, že fyziologické působení střeva (zejména komenzální mikroflóry) hraje důležitou roli při rozvoji deprese a může regulovat neuroendokrinní, autonomní nervový systém a imunitní systém (Yang et al., 2020). Navíc vztah spojující metabolismus tryptofanu, střevní mikrobiotu a depresi postupně přitahoval velkou pozornost. Změněná střevní mikroflóra může aktivovat dráhu tryptofan-kynurenin a následně snížit periferní a cerebrální dostupnost tryptofanu, což vede k nedostatku 5-HT (Agus et al., 2018). Naše předchozí studie ukázala, že fenylethanoidové glykosidy v CT obecně vykazují nízkou biologickou dostupnost a mohou být rychle metabolizovány na 3-hydroxyfenylpropionovou kyselinu (3-HPP) a hydroxytyrosol (HT) střevní mikroflórou (Li et al., 2016). Navíc bylo hlášeno, že extrakt CT obnovuje homeostázu střevní mikroflóry u potkanů ​​CUMS (Li et al., 2018). Na základě takového výzkumu jsme odvodili, že obousměrná interakce fytochemikálií a střevní mikroflóry může řídit antidepresivní účinky specifických bioaktivních složek CT. Konkrétně by se sloučeniny mohly přeměnit na vstřebatelné metabolity (jako je 3-HPP a HT) v gastrointestinálním traktu střevní mikroflórou a následně vykazovat antidepresivní účinky. Strukturální změny střevní mikroflóry vyvolané bioaktivními složkami mohou současně hrát zásadní roli v antidepresivní aktivitě.

Materiály a metody

Materiály

Všechny standardy používané pro chemickou analýzu byly zakoupeny od společnosti Durst (Sichuan, Čína). 3-HPP, HT, fluoxetin a imipramin byly zakoupeny od společnosti Aladdin (Shanghai, Čína). BCA proteinový kvantitativní kit byl zakoupen od Boster (Wuhan, Čína). Nanjing Jiancheng (Nanjing, Čína) poskytl 5-HT, BDNF, tumor nekrotizující faktor-alfa (TNF-), interleukin-1beta (IL-1) a interferon-gama (IFN- ) soupravy ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Soupravy ELISA pro kortikosteron (CORT), adrenokortikotropní hormon (ACTH) a hormon uvolňující kortikotropin (CRH) byly zakoupeny od společnosti Multi Sciences (Hangzhou, Čína). Cyklický adenosinmonofosfát (cAMP), cyklický guanosinmonofosfát (cGMP), testosteron (T) a ELISA soupravy pro hormon uvolňující gonadotropin (GnRH) byly zakoupeny od Enzyme-linked Biotechnology (Shanghai, Čína). Tryptofanové a kynureninové ELISA soupravy byly získány od Small Molecule Antibodies (Bordeaux, Francie). Primární/sekundární protilátky včetně zonula occludens 1 (ZO-1), indolamin 2, 3-dioxygenáza 1 (IDO1), -aktin a HRP kozí anti-králičí IgG (H plus L) byly zakoupeny od společnosti Proteintech (Wuhan, Čína). Všechna ostatní činidla analytické čistoty nebo vyšší čistoty byla získána od komerčních dodavatelů.

doplněk extraktu z cistanche

Příprava různých frakcí separovaných z CTE

CT byla shromážděna v listopadu 2015 v Hetian, Xinjiang, Čína, a ověřena prof. Xiaobo Li. Vzor voucheru (20151108) byl uložen na School of Pharmacy na Shanghai Jiao Tong University.

Rozdrcené vzorky byly třikrát extrahovány destilovanou vodou (1:10, w/v) po dobu 2 hodin při 80~90 °C, aby se získal CTE (výtěžek byl 57,1 procenta). CTE byl rozpuštěn v destilované vodě a poté pomalu míchán s ethanolem (1:4, obj./obj.) a umístěn při 4 °C na 24 hodin. Poté byly sraženina a supernatant shromážděny centrifugací při 4000 otáčkách za minutu po dobu 20 minut. Celkové polysacharidy (TP; výtěžek byl 5,7 procenta) byly získány promytím 80 procentním ethanolem a deproteinizací Sevageovým činidlem třikrát ze shromážděné sraženiny. Zbývající supernatant byl poté chromatografován na koloně D101 s mikroporézní pryskyřicí a eluován destilovanou vodou a 40% ethanolem. Eluované vodné a 40% ethanolové frakce obsahovaly celkové oligosacharidy (TO; výtěžek byl 35,1 procenta) a celkové glykosidy (TG; výtěžek byl 12,1 procenta). TG byl dále eluován destilovanou vodou a 5 procenty, 10 procenty a 40 procenty ethanolu opět přes mikroporézní pryskyřici D101 a eluované frakce 5 procent a 40 procent ethanolu byly celkové iridoidní glykosidy (TG-IrG; výtěžek byl 2,7 procenta) a celkové fenylethanoidové glykosidy (TG-PhG; výtěžek byl 8,7 procenta).

Chemický rozbor

Nejprve byly pomocí UPLC-QTOF-MS charakterizovány hlavní chemické složky různých frakcí separovaných z CTE. Za druhé, relativní obsahy celkových sacharidů a glykosidů byly stanoveny metodou UV-Vis. Za třetí, hlavní složky (echinakosid, verbascosid, isoverbaskosid, 8-epiloganová kyselina a geniposidová kyselina) byly kvantifikovány validovanou metodou HPLC. Podrobné parametry a validace metody jsou uvedeny v doplňkových materiálech.

Obr. 1. Vývojový diagram pokusů na zvířatech

Tabulka 1 Subjekty a dávka pro myši nebo krysy v každé skupině.

Pokusy na zvířatech

Konkrétní rozvrhy pokusů na zvířatech jsou znázorněny na obr. 1. Všechna pokusná zvířata byla chována a aklimatizována po dobu 1 týdne před experimenty v Centru laboratorních zvířat Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Čína), při kontrolované pokojové teplotě (25 ± 2 °C). ◦C; 55 ± 10 procent relativní vlhkosti) s cyklem 12:12 h světlo-tma. Tento výzkum byl proveden v souladu se Směrnicí pro péči a používání laboratorních zvířat SJTU. Zařízení pro zvířata a protokoly byly schváleny Etickou komisí zvířat SJTU (č. A2019008).

Sto padesát samců myší ICR (o hmotnosti 18–20 g, stáří 6 týdnů) bylo zakoupeno od společnosti Shanghai Slack Biotechnology Company (Shanghai, Čína) a náhodně rozděleni do 10 skupin (n=15/skupina). Subjekty a dávky pro myši se zoufalým chováním v každé skupině jsou uvedeny v tabulce 1. Dávky CTE a jeho oddělené frakce byly vypočteny podle následujícího vzorce: dávka=4,55 g/kg.d.bw × výtěžek, který byl stanoven podle tří výpočtů ekvivalentní lidské dávky na základě plochy povrchu těla. Dávky pozitivního léku imipramin a metabolity střevní mikrobioty (3-HPP a HT) byly nastaveny podle předchozích studií (Gupte et al., 2016; Pablos et al., 2019). Po intragastrickém podávání jednou denně po dobu 7 dnů byl 8., 9. a 10. den proveden test na otevřeném poli (OFT), test zavěšení ocasu (TST) a test nuceného plavání (FST). Konkrétní metody behaviorálních testů jsou uvedeny v doplňkových materiálech.

Sedmdesát dva samců krys Sprague-Dawley (o hmotnosti 160–180 g, stáří 6 týdnů) bylo zakoupeno od společnosti Shanghai Slack Laboratory Animal Company (Shanghai, Čína). Před formálními experimenty byly všechny krysy po odpovídajícím tréninku podrobeny testu preference sacharózy (SPT). Potkani byli rozděleni do 8 skupin (n=9/skupina) podle jejich preference sacharózy (doplňkový obrázek S1). Subjekty a dávky pro krysy v každé skupině jsou uvedeny v tabulce 1. Dávky byly nastaveny podle konverzního koeficientu mezi myší a krysou na základě jejich účinných dávek u myší s zoufalým chováním. A dávka pozitivního kontrolního léku fluoxetinu byla v souladu s předchozí studií (Hou et al., 2017). Všechny skupiny dostaly sérii chronického nepředvídatelného mírného stresu (CUMS) kromě kontrolní skupiny. Stresory byly aplikovány nepřetržitě a náhodně po dobu 4 týdnů (podrobnosti viz doplňková tabulka S1). Potrava a voda byly volně dostupné pro kontrolní krysy, které zůstaly nerušeně v jiné místnosti, s výjimkou behaviorálních testů. Subjektům byla intragastricky podávána 1 h před procedurou CUMS v průběhu 4 týdnů. Po 28 dnech nepřetržitého podávání stresorů a podávání léků byly OFT, SPT a FST provedeny 29., 31. a 33. den. Konkrétní metody behaviorálních experimentů jsou uvedeny v doplňkových materiálech.

Tabulka 2 Obsahy echinakosidu, verbascosidu, isoverbaskosidu, 8-epiloganové kyseliny a geniposidové kyseliny v každé frakci.

Odběr vzorků a biochemická analýza

Po behaviorálních testech byly hladovějící krysy anestetizovány pentobarbitalem sodným a byla odebrána plná krev pro získání vzorků séra. Po perfuzi srdce fyziologickým roztokem byl obsah hipokampu, tlustého střeva a slepého střeva odebrán a uložen při -80 ◦C. Distální segmenty tlustého střeva byly odstraněny a fixovány ve 4% paraformaldehydu. Hladiny CORT, CRH, ACTH, TNF-, IL-1, IFN-, cAMP, cGMP, T, GnRH, tryptofanu a kynureninu v séru, 5-HT, BDNF a TNF- v hipokampu a TNF- a IFN- v tlustém střevě byly měřeny podle pokynů dodaných s odpovídající soupravou ELISA.

Histologie, imunohistochemie a test western-blotting

K pozorování patologických změn v tkáni tlustého střeva bylo použito barvení hematoxylinem a eozinem (H&E) a barvením Alciánovou modří-kyselina jodistá-Schiff (AB-PAS). Kromě toho byla provedena imunohistochemická hodnocení těchto řezů za účelem pozorování exprese proteinu ZO-1 v epiteliálních buňkách tlustého střeva (Ding et al., 2020). Podrobnosti týkající se přípravy vzorku a testu western-blotting pro stanovení exprese proteinu IDO1 v tlustém střevě a hippocampu jsou také popsány v doplňkových materiálech.

Analýza kompozičního profilu střevní mikroflóry

Vysokokapacitní sekvenování 16S rRNA provedla MajorBio Co., Ltd. (Shanghai, Čína) a podrobná metoda a zpracování dat jsou uvedeny v doplňkových materiálech.

Statistická analýza

Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM). Jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA) byla použita k porovnání více skupin pomocí softwaru SPSS 20.0. Rozdíl byl považován za významný při p < 0,05.="" korelace="" mezi="" střevními="" mikroby="" a="" určitými="" fyziologickými="" faktory="" souvisejícími="" s="" depresí="" byly="" analyzovány="" pomocí="" spearmanova="" korelačního="" koeficientu="" založeného="" na="" analýze="" teplotní="">

Výsledek

Chemická analýza různých frakcí separovaných z CTE

Hlavní složky byly charakterizovány pomocí UPLC-QTOF-MS (doplňková tabulka S2 a obr. S2) a bylo identifikováno celkem 21 složek, včetně 16 složek fenylethanoidových glykosidů, 2 složek fenolických glykosidů v CTE, TG a TG- PhG; a 3 složky iridoidních glykosidů v CTE, TG a TG-IrG. Celkově byl relativní obsah celkových sacharidů v TP a TO 60,3 procenta a 80,8 procenta. Relativní obsahy celkových glykosidů v TG byly 87,7 procenta. V souladu s tím fenylethanoid a iridoidní glykosidy představovaly 86,7 procenta a 53,4 procenta TG-PhG a TG-IrG, v daném pořadí. Obsahy echinakosidu, verbascosidu, isoverbaskosidu, 8-epiloganové kyseliny a geniposidové kyseliny v každé frakci jsou uvedeny v tabulce 2 a údaje z HPLC chromatogramu a validace metody jsou uvedeny v doplňkové tabulce S3 a obr. S3.

Obr. 2. Účinky různých frakcí oddělených od CTE a typických metabolitů střevní mikroflórou na FST, TST, OFT u myší.

Účinky různých frakcí oddělených od CTE a typických metabolitů střevní mikroflórou na testy behaviorálního zoufalství u myší

Jak je znázorněno na obr. 2, ve srovnání s kontrolní skupinou, myši vystavené 7dennímu podávání imipraminu (pozitivní kontrola) vykazovaly významné snížení doby imobility v FST i TST a nevykazovaly žádný významný vliv na celkovou vzdálenost ujetou v OFT. . Podobné změny byly také pozorovány ve skupinách CTE, TG a HT, což naznačuje, že CTE, TG a HT vykazovaly antidepresivní aktivitu a účinky nesouvisely s excitabilitou. TG a HT byly tedy dominantní bioaktivní frakcí oddělenou od CTE a typických metabolitů střevní mikroflórou. Je zajímavé, že po podání TG-PhG a TG-IrG nebyly prokázány žádné významné změny v dobách imobility v FST ve srovnání s kontrolami nebo v TST po podání TG-PhG, což naznačuje, že přítomnost fenylethanoidních a iridoidních glykosidů by mohla být zásadní pro antidepresivní aktivitu CTE.

Tabulka 3 Účinky různých frakcí obohacených o glykosidy a HT na FST, SPT a OFT u CUMS potkanů.

Farmakodynamické účinky a biochemické změny různých glykosidově obohacených frakcí a HT na CUMS potkanech

Jak je uvedeno v tabulce 3, krysy podrobené 28 dnům paradigmatu CUMS vykazovaly významné snížení (p < 0.001)="" v="" preferenci="" sacharózy="" v="" spt,="" celkové="" ušlé="" vzdálenosti,="" a="" počet="" odchovů="" v="" oft,="" stejně="" jako="" významné="" zvýšení="" (p="">< 0,01)="" celkové="" doby="" imobility="" u="" fst="" ve="" srovnání="" s="" kontrolami,="" což="" naznačuje="" indukci="" fenotypů="" podobných="" depresi="" u="" cums="" potkanů.="" depresivní="" projevy="" byly="" obráceny="" ve="" skupině="" flx="" (pozitivní="" kontrola).="" podobně="" léčba="" cte,="" tg,="" tg-phg,="" tg-irg="" a="" ht="" vedla="" k="" obnovení="" preference="" sacharózy="" na="" normální="" hladiny="" u="" potkanů="" ​​cums,="" což="" bylo="" 102,7="" procenta,="" 94,1="" procenta,="" 89,8="" procenta,="" 91,9="" procenta="" a="" 94,3="" procenta="" ovládání,="" resp.="" konzistentně="" ve="" skupinách="" fst="" vykazovaly="" nejzřetelnější="" účinky="" cte="" a="" tg="" a="" časy="" imobility="" dosáhly="" 103,3="" procenta="" a="" 93,4="" procenta="" času="" kontrolní="" skupiny,="" zatímco="" časy="" imobility="" skupin="" tg-phg,="" tg-irg="" a="" ht="" právě="" dosáhl="" 62,1="" procenta,="" 73,2="" procenta="" a="" 69,9="" procenta="" kontrolní="" skupiny.="" podobné="" významné="" zvýšení="" (p="">< 0,05)="" bylo="" pozorováno="" v="" celkové="" ujeté="" vzdálenosti="" a="" počtu="" odchovů="" v="" oft="" po="" podání="" cte,="" tg="" a="" ht="" a="" léčba="" tg-phg="" a="" tg-irg="" směřovala="" k="" revizi="" počtu="" odchovů="" u="" potkanů="" ​​cums.="" výsledky="" ukázaly,="" že="" tg="" byl="" dominantní="" bioaktivní="" antidepresivní="" frakcí="" oddělenou="" od="" cte="" a="" fenylethanoidní="" a="" iridoidní="" glykosidy="" byly="" nepostradatelné="" pro="" uplatnění="" jeho="" antidepresivního="" účinku.="" navíc="" bylo="" prokázáno,="" že="" ht="" je="" jedním="" z="" aktivních="" metabolitů="" tg="" in="">

Trpění CUMS významně zvýšilo hladiny CORT, CRF, ACTH, TNF-, IL-1 a IFN- v séru a TNF- v hipokampu potkanů ​​ve srovnání s kontrolní skupinou (p< 0.05),="" resulting="" in="" significant="" reductions="" (p="" <="" 0.05)="" in="" the="" levels="" of="" hippocampal="" 5-ht="" and="" bdnf="" (fig.="" 3).="" except="" for="" a="" non-significant="" difference="" in="" the="" level="" of="" hippocampal="" bdnf="" between="" flx="" and="" cums="" groups,="" the="" above-mentioned="" alterations="" in="" cums="" rats="" could="" be="" significantly="" reversed="" (p="" <="" 0.05)="" after="" administration="" of="" fluoxetine,="" cte,="" tg,="" and="" ht,="" indicating="" that="" cte,="" tg,="" and="" ht="" showed="" ameliorative="" effects="" on="" the="" hyperactivation="" of="" hpa="" axis,="" severe="" peripheral="" and="" neural="" inflammation,="" and="" deficiencies="" in="" 5-ht="" and="" bdnf.="" likewise,="" tg-irg="" and="" tgphg="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" levels="" of="" serum="" cort,="" tnf-α,="" ifn-γ,="" and="" hippocampal="" tnf-α,="" and="" increased="" the="" level="" of="" hippocampal="" 5-ht="" in="" cums="" rats="" (p="" <="" 0.05).="" significant="" decreases="" (p="" <="" 0.05)="" in="" the="" levels="" of="" serum="" crf="" and="" acth="" were="" also="" observed="" in="" the="" tg-irg="" group="" compared="" with="" cums="" group.="" interestingly,="" the="" levels="" of="" serum="" cort,="" tnf-α,="" acth,="" and="" crf="" in="" tg-phg="" and="" tg-irg="" groups="" were="" significantly="" higher="" than="" those="" in="" the="" tg="" group="" (p="" <="" 0.05),="" and="" the="" levels="" of="" hippocampal="" 5-ht="" and="" bdnf="" exhibited="" the="" opposite="" expression="" pattern="" (p="" <="" 0.05).="" these="" results="" showed="" that="" the="" effects="" of="" tg-phg="" and="" tg-irg="" on="" the="" hyperactivity="" of="" the="" hpa="" axis,="" peripheral="" and="" neural="" inflammation="" and="" shortage="" of="" 5-ht="" were="" clearly="" inferior="" to="" tg,="" indicating="" that="" phenylethanoid="" and="" iridoid="" glycosides="" might="" exert="" synergistic="" effects="" on="" the="" above-mentioned="" multiple="">

TG a HT regulují HPG osu a metabolismus cyklických nukleotidů u CUMS potkanů

Byly měřeny hladiny T, GnRH, cAMP a cGMP a poměr cAMP a cGMP (cAMP/cGMP) v séru vystaveném CUMS a výsledky jsou uvedeny v tabulce 4. Koncentrace T, GnRH, cAMP, a cAMP/cGMP v séru byly významně sníženy a hladina cGMP byla významně zvýšena (p < 0.05)="" ve="" skupině="" cums="" ve="" srovnání="" s="" kontrolami,="" což="" naznačuje,="" že="" podrobení="" cums="" vedlo="" k="" potlačení="" osy="" hpg="" a="" dysfunkce="" metabolismu="" cyklických="" nukleotidů.="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" cums="" nedošlo="" ve="" skupině="" flx="" k="" žádným="" významným="" změnám.="" překvapivě="" po="" léčbě="" tg="" a="" ht="" došlo="" k="" významnému="" zvýšení="" (p="">< 0,05)="" hladin="" sérového="" t,="" gnrh,="" camp="" a="" camp/cgmp,="" zatímco="" hladina="" sérového="" cgmp="" byla="" významně="" snížena="" (p="">< 0,05).="" tyto="" výsledky="" ukázaly,="" že="" tg="" a="" ht="" regulovaly="" osu="" hpg="" a="" metabolismus="" cyklických="" nukleotidů,="" což="" bylo="" výrazně="" lepší="" než="" pozitivní="" kontrola="">

Obr. 3. Účinky různých frakcí obohacených o glykosidy a HT na hladiny CORT, ACTH, CRF, TNF-, IL-1, IFN- v séru a 5-HT, BDNF, TNF- Obr. v hippocampu CUMS krys.

TG a HT zmírňují zánět nízkého stupně v tlustém střevě a narušení střevní bariéry u potkanů ​​CUMS

K hodnocení morfologického poškození tlustého střeva bylo použito barvení H&E a mezi experimentálními skupinami nebyly pozorovány žádné významné rozdíly v tlustém střevě (obr. 4a). Dále byly také analyzovány účinky TG a HT na zánět v tlustém střevě a narušení střevní bariéry (obr. 4b-d). Ve srovnání s kontrolní skupinou byl u skupiny CUMS snížen počet pohárkových buněk a tloušťka vrstvy hlenu. V souladu s tím byla proteinová exprese ZO-1 a hladiny IFN- a TNF- v tlustém střevě významně sníženy (p < 0.05)="" a="" zvýšeny="" (p="">< {="" {13}}.05),="" což="" naznačuje,="" že="" ačkoli="" nebylo="" indukováno="" žádné="" zjevné="" histologické="" poškození,="" cums="" vedlo="" k="" zánětu="" nízkého="" stupně="" v="" tlustém="" střevě="" a="" narušení="" střevní="" bariéry.="" po="" léčbě="" fluoxetinem,="" tg="" a="" ht="" se="" zvýšil="" počet="" pohárkových="" buněk="" a="" tloušťka="" vrstvy="" hlenu="" a="" významně="" se="" snížily="" hladiny="" ifn-="" a="" tnf-="" v="" tlustém="" střevě="" (p="">< 0,05).="" navíc="" tg="" a="" ht="" významně="" zvýšily="" (p="">< 0,05)="" proteinovou="" expresi="" zo-1="" na="" úroveň="" podobnou="" úrovni="" kontrolní="" skupiny.="" tyto="" výsledky="" ukázaly,="" že="" tg="" a="" ht="" by="" mohly="" zmírnit="" zánět="" nízkého="" stupně="" v="" tlustém="" střevě="" a="" narušení="" střevní="" bariéry="" u="" cums="">

Tabulka 4 Účinky TG, HT nebo fluoxetinu na hormony související s osou HPG a indexy související s metabolismem nukleotidů v séru krys CUMS.

Účinky TG a HT na složení střevní mikroflóry

Po odstranění nekvalifikovaných sekvencí bylo získáno celkem 1 874 721 efektivních čtení. Výsledky alfa diverzity (obr. 5a) a beta diverzity (obr. 5b) ukázaly, že ačkoli se bohatost (Chao) a diverzita (Shannon) střevní mikroflóry v obsahu slepého střeva nelišila, celková struktura střevní mikroflóry v graf analýzy hlavních souřadnic (PCoA) ukázal výrazný rozdíl mezi kontrolní skupinou a skupinou CUMS. Kromě toho léčba TG a HT významně zvýšila bakteriální bohatost potkanů ​​CUMS a vyvolala výrazné rozdíly v grafu PCoA ve srovnání s potkany CUMS, což ukazuje jasné podobnosti s kontrolami, zvláště když byl testován TG.

Taxonomické změny v mikrobiotě dále potvrdily, že TG má dramatický regulační účinek na složení střevní mikroflóry. Po podání TG byla abundance většiny pozměněných taxonů u CUMS potkanů ​​obrácena na úroveň podobnou hladinám u kontrolní skupiny. Významné snížení (14,2 procenta, p < 0,05)="" a="" obohacení="" (53,6="" procenta,="">< 0.05)="" in="" the="" abundances="" of="" the="" phylum="" firmicutes="" and="" bacteroidetes="" were="" observed="" in="" the="" tg="" group="" compared="" with="" cums="" group="" (fig.="" 5c),="" respectively.="" consistently,="" at="" the="" family="" level="" (supplementary="" table="" s4),="" tg="" decreased="" the="" abundances="" of="" ruminococcaceae="" (phylum="" firmicutes)="" and="" peptococcaceae="" (phylum="" firmicutes)="" by="" 33.9%="" and="" 82.9%,="" respectively,="" compared="" with="" cums="" group="" (p="" <="" 0.05).="" conversely,="" significant="" enrichments="" in="" the="" abundances="" of="" family="" erysipelotrichaceae="" (phylum="" firmicutes,="" 78.4%,="" p="" <="" 0.05)="" and="" muribaculaceae="" (phylum="" bacteroidetes,="" 77.3%,="" p="" <="" 0.05)="" existed="" in="" tg="" group.="" consistently="" at="" the="" genus="" level="" (fig.="" 5d),="" the="" abundances="" of="" anaerotruncus,="" harryflintia,="" ruminiclostridium_9,="" unclassified_f_ruminococcaceae="" (members="" of="" the="" family="" ruminococcaceae),="" and="" peptococcus="" (a="" member="" of="" the="" family="" peptococcaceae)="" were="" significantly="" decreased="" while="" norank_f_erysipelotrichaceae,="" allobaculum,="" dubosiella="" (members="" of="" the="" family="" erysipelotrichaceae)="" and="" norank_f_muribaculaceae="" (a="" member="" of="" the="" family="" muribaculaceae)="" displayed="" higher="" abundances="" in="" tg="" group="" than="" those="" of="" cums="" group="" (p="">< 0.05).="" in="" addition,="" tg="" decreased="" the="" abundances="" of="" tyzzerella_3,="" acetatifactor,="" and="" norank_f_lachnospiraceae="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae="" (p="" <="" 0.05),="" although="" the="" abundance="" of="" the="" family="" lachnospiraceae="" was="" similar="" across="" all="" experimental="" groups.="" unlike="" tg,="" ht="" decreased="" the="" abundances="" of="" partially="" altered="" taxa="" induced="" by="" cums,="" including="" the="" family="" ruminococcaceae,="" 3="" genera="" (anaerotruncus,="" harryflintia,="" and="" ruminiclostridium_9)="" assigned="" to="" the="" family="" ruminococcaceae="" and="" 2="" genera="" (tyzzerella_3,="" acetatifactor)="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae.="" additionally,="" converse="" variations="" were="" observed="" in="" the="" abundances="" of="" ruminococcaceae_ucg_013="" and="" streptococcus="" in="" the="" ht="" group.="" these="" results="" indicated="" that="" tg="" and="" ht="" exerted="" clear="" differences="" in="" the="" regulation="" of="" gut="" microbiota="" composition,="" and="" the="" effect="" of="" tg="" was="" superior="" to="" that="" of="" tg="" especially="" in="" altering="" the="" genera="" assigned="" to="" the="" family="" erysipelotrichaceae,="" peptococcaceae,="" and="">

Obr. 4. Účinky TG, HT nebo fluoxetinu na morfologické změny, expresi proteinu ZO-1, koncentrace IFN- a TNF- v tlustém střevě potkanů ​​CUMS.

Korelační analýza změněných mikrobiálních rodů ovlivněných TG a HT, hormony souvisejícími s HPA osou, prozánětlivými cytokiny, 5-HT a BDNF

K objasnění souvislostí mezi změnami ve složení střevní mikroflóry ovlivněnými TG a HT a odpovídajícími rysy souvisejícími s depresí byla provedena Spearmanova korelační analýza. Jak je znázorněno na obr. 6, hladiny 5-HT a BDNF v hipokampu pouze významně pozitivně korelovaly s norank_f_Muribaculaceae. Jinak by mohly být identifikovány jasné korelace mezi změněnými mikrobiálními rody a hormony souvisejícími s HPA osou. Zejména Dubosiella, norank{6}}f_Muribaculaceae, norank{8}}f_ Erysipelotrichacea a Peptococcus byly silně spjaty s funkcí osy HPA. Sérum CORT, CRF a ACTH mělo negativní korelace s Dubosiella, norank_f_Muribaculaceae a norank{12}}f_Erysipelotrichacea a pozitivní asociace s Peptococcus. Kromě toho Dubosiella a norank{14}}f{15}} Erysipelotrichacea vykazovaly negativní asociace s tlustým střevem IFN- a hipokampálním TNF-, zatímco podobné vztahy existovaly u Allobaculum, Harryfinita a séra a hipokampu TNF-, stejně jako u noranku _f_Lachnospiracea a sérum IFN- a TNF-. Naproti tomu Peptococcus byl pozitivně spojen s TNF- a TNF- v séru. Podobně, norank_f_Muribaculaceae byl pozitivně příbuzný se sérovým IFN- a TNF-. Tyto výsledky ukázaly, že změněné mikrobiální rody, zejména některé rody patřící do čeledi Erysipelotrichaceae, Peptococcaceae a Muribaculaceae, které byly specificky ovlivněny TG, vykazovaly současně silné asociace s hormony souvisejícími s osou HPA a prozánětlivými cytokiny, což dokazuje kritickou roli střevní mikroflóry při regulaci funkce osy HPA a zánětu.

cistanche propiedades

TG a HT inhibují metabolismus tryptofanu-kynureninu u CUMS potkanů

Byly stanoveny účinky TG a HT na hladiny tryptofanu a kynureninu v séru krys, stejně jako exprese IDO1 v tlustém střevě a hippocampu. Jak je znázorněno na obr. 7 a obr. 8, ve srovnání s kontrolní skupinou byla hladina tryptofanu v séru významně snížena ve skupině CUMS, na rozdíl od zvýšené hladiny kynureninu a poměru kynureninu k tryptofanu (Kyn /Trp) a exprese proteinu IDO1 v tlustém střevě a hippocampu. Ve srovnání se skupinou CUMS bylo sérum Kyn/Trp ve skupině FLX významně sníženo (str< 0.05).="" tg="" and="" ht="" treatment="" resulted="" in="" a="" significant="" increase="" in="" the="" serum="" tryptophan="" level="" in="" cums="" rats="" (p="" <="" 0.05),="" and="" a="" decrease="" in="" the="" levels="" of="" serum="" kynurenine="" and="" kyn/trp="" (p="" <="" 0.05).="" in="" addition,="" tg="" significantly="" inhibited="" the="" expression="" of="" ido1="" protein="" in="" the="" colon="" of="" cums="" rats="" (p="" <="" 0.05),="" while="" a="" non-significant="" difference="" in="" the="" expression="" of="" ido1="" protein="" in="" the="" hippocampus="" was="" observed="" between="" cums="" and="" tg="" groups.="" however,="" the="" effect="" of="" ht="" on="" the="" expression="" of="" ido1="" protein="" in="" the="" colon="" and="" hippocampus="" was="" contrary="" to="" that="" of="" tg,="" indicating="" that="" tg="" and="" ht="" inhibited="" tryptophan-kynurenine="" metabolism="" by="" decreasing="" the="" expression="" of="" ido1="" in="" the="" colon="" and="" hippocampus="" of="" cums="" rats,="">

Obr. 5. Analýza diverzity, složení a rozdílů střevní mikroflóry ve vzorcích slepého střeva.

Diskuse

V této studii byly použity dva různé zvířecí modely ke screeningu bioaktivních sloučenin v CT, které poprvé zmírňují chování podobné depresi. TP a TO byly s největší pravděpodobností neúčinné složky v CTE, zatímco TG vykazoval největší potenciál v léčbě deprese. Předchozí studie na CT, stejně jako na rostlinách Cistanche, se většinou zaměřovaly na bioaktivity fenylethanoidních glykosidů s nejvyššími obsahy a zanedbávaly význam iridoidních glykosidů a dalších méně hojných složek. Zajímavé je, že naše studie ukázala, že fenylethanoidní a iridoidní glykosidy vykazovaly synergické účinky na hyperaktivitu osy HPA, závažné periferní a nervové záněty a nedostatky v hipokampálním 5-HT a BDNF, což může být kritickým důvodem pro výhodné antidepresivum účinek TG. Tyto výsledky dále naznačují vícesložkové a vícecílové vlastnosti bylinné medicíny a připomínají nám, že složky s nižšími hladinami, dokonce i stopové složky, mohou také hrát klíčovou roli ve farmakologických účincích.

Chronický stres vyvolává hyperaktivitu osy HPA, která podporuje nástup deprese, stejně jako potlačení osy HPG prostřednictvím sníženého uvolňování GnRH a/nebo hypofyzární citlivosti GnRH (Kirby et al., 2009). Mezitím jsou cAMP a cGMP důležité mezilehlé uzly, které se při uplatňování svých fyziologických účinků spoléhají na mnoho neurotransmiterů a hormonů (Siawrys et al., 2002). Nedávné studie konzistentně prokázaly, že výskyt deficitu ledvin-yang úzce souvisí s dysfunkcí osy hypotalamus-hypofýza-cílová žláza (Zhang et al., 2019). U syndromu nedostatečnosti ledvin a jang bylo také pozorováno výrazné snížení hladin cAMP a cAMP/cGMP v séru. V této studii jsme zjistili, že TG může inhibovat hladiny sérového CORT, CRF a ACTH a zvýšit obsah T a GnRH v séru u CUMS potkanů, což ukazuje na obnovení dysfunkce os HPA a HPG po podání TG. Navíc TG zvrátil významný pokles hladiny cAMP/cGMP v séru u potkanů ​​podrobených CUMS. Potenciální základní mechanismus CT při léčbě deprese a deficitu jangu ledvin tedy může být částečně podobný a zaslouží si další prozkoumání. Kromě toho je produkce sexuální touhy a chování komplexním nervovým reflexním procesem. Pohlavní hormony jsou hlavním zdrojem centrálního sexuálního vzrušení a nedostatek pohlavních hormonů může způsobit menší sexuální touhu nebo sexuální dysfunkci (Holloway a Wylie, 2015). Zejména nadměrné 5-HT inhibuje uvolňování GnRH, což je dominantní důvod pro výskyt chronické sexuální dysfunkce po dlouhodobé léčbě SSRI (Prasad et al., 2015). V naší studii byl fluoxetin (zástupce SSRI) u dysfunkce osy HPG neúčinný. Ačkoli však TG významně zlepšila hladinu 5-HT v hipokampu, byly také pozorovány podobné změny v hladinách T a GnRH v séru, čímž se zlepšila suprese osy HPG. Tyto výsledky ukazují zřetelnou výhodu CT v léčbě deprese a vnitřní mechanismus odpovědný za tyto účinky je třeba dále studovat.

Stále více důkazů ukazuje, že střevo je potenciálním cílem pro léčbu chronických onemocnění pomocí přírodních sloučenin s nízkou biologickou dostupností (Zhou et al., 2020). Nedávný výzkum (Wei et al., 2019) ukázal, že léčba CUMS vyvolává změny fekálního mikrobiomu a defekty střevní bariéry, které usnadňují bakteriální invazi do sliznice tlustého střeva a zhoršují zánětlivé reakce v tlustém střevě. V souladu s touto zprávou naše výsledky ukázaly, že 4 týdny expozice CUMS vyvolaly rozsáhlé vyčerpání počtu pohárkových buněk a tloušťky vrstvy hlenu v krysím tlustém střevě, stejně jako nástup narušení střevní bariéry představované zvýšenou propustností střeva, což bylo určeno měření proteinu ZO-1. Kromě toho byly v tlustém střevě pozorovány zvýšené exprese prozánětlivých faktorů (jako je TNF- a IFN-). V souladu s tím tato zjištění ukázala, že ačkoli nebylo indukováno žádné zjevné histologické poškození, léčba CUMS iniciovala zánět tlustého střeva a narušení střevní bariéry. Předchozí studie uváděly, že CT vykazovalo zlepšenou účinnost při prevenci kolitidy vyvolané DSS u myší (Jia et al., 2014). Nekonzistentně se také ukázalo, že TG zmírňuje zánět nízkého stupně v tlustém střevě a narušení střevní bariéry u potkanů ​​CUMS, což podtrhuje jeho potenciál pro klinickou léčbu onemocnění souvisejících se zánětem tlustého střeva.

Rozsáhlé studie také prokázaly, že vztah spojující komenzální střevní mikrobiotu, osu HPA a zánět je komplexní a hraje klíčovou roli ve vývoji deprese (Misiak, et al., 2020). Změny ve složení střevní mikroflóry mohou přispět ke zvýšenému uvolňování cytokinů a syntéze malých bioaktivních molekul (Du et al., 2020). Některé cytokiny (jako je TNF-) mohou procházet hematoencefalickou bariérou a jsou účinnými aktivátory osy HPA (Misiak et al., 2020). Hyperaktivace osy HPA může zase přispívat k dysbióze střevní mikroflóry, chronickému zánětu v tlustém střevě a změněné propustnosti střeva (Misiak et al., 2020). V souladu s předchozími studiemi je modifikace střevní mikroflóry pomocí TG pravděpodobně zodpovědná za její zmírňující účinky na depresi. Pozorovali jsme, že TG zvrátil množství mikrobiálních taxonů na různých úrovních u potkanů ​​podrobených CUMS na úroveň podobnou hladinám u kontrol. Zejména bylo zjištěno, že hlavní pozměněné rody patřící do čeledi Peptococcaceae, Erysipelotrichaceae a Muribaculaceae vysoce korelují s osou HPA a zánětem. V souladu s našimi výsledky se uvádí, že čeleď Peptococcaceae, Erysipelotrichaceae a Muribaculaceae hraje důležitou roli při udržování integrity slizniční bariéry a výskytu zánětu (Kankoush, 2015; Borton et al., 2017; Zhang et al., 2020). Proto jsme se domnívali, že TG by mohl zmírnit početnost některých rodů přiřazených k rodině Erysipelotrichacea, Peptococcaceae a Muribaculaceae, následně zmírnit zánět nízkého stupně v tlustém střevě, hyperaktivitu osy HPA a narušení integrity slizniční bariéry. Je zajímavé, že v naší studii pouze jeden rod pojmenovaný nor ank_f_Muribaculaceae koreloval s 5-HT a BDNF v hippocampu. Konkrétní mechanismus vztahu zůstává nejasný a je třeba jej dále prozkoumat. Jinak zjištění také naznačují, že pro většinu změněných rodů způsobených TG je extrémně obtížné přímo ovlivnit hladiny 5-HT v hipokampu. Abychom vysvětlili, jak změny ve složení střevní mikroflóry ovlivňují hladinu hipokampální 5-HT po léčbě TG, zaujal nás složitý vztah spojující metabolismus tryptofanu, osu HPA, zánětlivé cytokiny a 5-HT. Tryptofan je esenciální aminokyselina pro člověka a méně než 1 procento se používá při syntéze bílkovin, přičemž většina (přes 90 procent) je přeměněna IDO1 a tryptofanem 2,3-dioxygenázou 2 (TDO2) na kynureniny a přibližně 5 procent je poháněno tryptofanhydroxylázou serotoninovou cestou (Duan, et al. 2018). Hladina 5-HT v mozku do značné míry závisí na periferní dostupnosti tryptofanu, vzhledem k tomu, že tryptofan je transportován do mozku prostřednictvím neutrálních přenašečů aminokyselin (Duan et al., 2018). IDO1, enzym omezující rychlost v prvním kroku kynureninové dráhy, je primárně indukován IFN- a dalšími prozánětlivými cytokiny, jako je IL-1 a TNF- (Kennedy et al., 2017), u kterých se v naší studii ukázalo, že jsou spojeny se střevní mikrobiotou. Jak bylo uvedeno, více tryptofanu je metabolizováno kynureninovou cestou, čímž se kompetitivně snižuje přeměna tryptofanu na 5-HT a souvisí se sníženým 5-HT, který se běžně vyskytuje u deprese (O'Mahony et al., 2015). Nižší hladiny tryptofanu a vyšší Kyn/Trp jsou tedy běžné a shodují se se zvýšeným rizikem depresivní nálady. Po podání TG byla nadměrná exprese IDO1 v tlustém střevě inhibována, což vedlo ke zvýšeným hladinám tryptofanu v séru a snížení sérového Kyn/Trp, což odhalilo potenciální vazbu mezi střevní mikrobiotou a hladinou HT v hippocampu ovlivněnou TG. Mezitím je BDNF, člen rodiny neurotrofinů, nezbytný pro buněčnou diferenciaci, přežití neuronů, tvorbu synapsí a procesy neuroplasticity při depresi (Greenberg et al., 2009). Nedávné studie ukázaly, že bylo zjištěno, že BDNF je úzce spojen s funkcí střevní slizniční bariéry a střevní mikroflórou (Maqsood a Stone, 2016). Také se uvádí, že změny střevní mikroflóry mají potenciál zvýšit hladiny exprese BDNF, a tak ovlivnit vývoj chování podobného depresi (Du et al., 2020). Nicméně, podobně jako u variace 5-HT, bylo extrémně nemožné, aby většina pozměněných rodů způsobených TG v naší studii přímo ovlivnila hladiny BDNF v hipokampu, a vnitřní molekulární spojení a mechanismus vyžadují další zkoumání.

Naproti tomu HT, metabolit střevní mikroflóry TG, také vykazoval v této studii antidepresivní účinek, což je v souladu s jeho výhodnou neuroprotektivní aktivitou (Hu et al., 2014). Znepokojivé je, že HT může také zmírňovat prozánětlivé cytokiny, hormony související s osou HPA a HPG a koncentrace hippocampu 5-HT na úroveň podobnou jako u kontrol u potkanů ​​CUMS, zatímco většina změněných mikrobiálních rodů ovlivnila by HT měl slabé korelace s výše uvedenými fyziologickými indexy, což naznačuje, že střevní mikroflóra nemusí být cílem antidepresivní aktivity HT. Kromě toho HT potlačila nadměrnou expresi IDO1 v hippocampu, ale ne v tlustém střevě, doprovázenou zvýšenými hladinami tryptofanu v séru. Výskyt zjevných rozdílů mezi TG a HT může být způsoben vynikající absorpcí HT do krevního řečiště a schopností HT procházet hematoencefalickou bariérou (Robles-Almazan et al., 2018), což také naznačuje, že silná metabolická kapacita střevní mikroflóry je kromě fyziologických funkcí zvláště důležitá v antidepresivní aktivitě TG. Předběžně jsme tedy prokázali, že obousměrná interakce fytochemikálií a střevní mikroflóry hraje kritickou roli v léčbě deprese podáváním TG (jak ukazuje obr. 9).

Doplňky stravy Cistanchehrát azásadní roli v léčbě deprese.

Pro více informací klikněte

Závěr

Stručně řečeno, TG byl zodpovědný hlavně za antidepresivní aktivitu CT, což se odráží v synergických účincích fenylethanoidových a iridoidních glykosidů na hyperaktivaci osy HPA, těžké periferní a nervové záněty a deficity 5-HT a BDNF v hippocampus. Dále bylo dosaženo potenciálního molekulárního mechanismu antidepresivního účinku TG prostřednictvím obousměrné interakce fytochemikálií a střevní mikroflóry. Kromě toho zlepšení suprimované osy HPG a abnormality cyklických nukleotidů pomocí TG a HT, které nebyly regulovány léčbou SSRI reprezentovanými fluoxetinem, naznačovaly výraznou výhodu CT v léčbě deprese. Takové modulace představují slibnou strategii pro léčbu deprese pomocí CT a podobných tradičních rostlinných léků.