Dnes je buněčné stárnutí považováno za běžnou reakci téměř všech typů proliferujících buněk

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

AbstraktníCílená eliminace senescentních buněk, analýza, je jedním ze základních trendů v anti-aging terapii. Nedávno bylo prokázáno, že srdeční glykosidy jsou širokospektrá senolytika. Zde jsme testovali senolytické vlastnosti srdečních glykosidů vůči lidským mezenchymálním kmenovým buňkám (hMSC). Srdeční glykosidy neměly žádnou senolytickou schopnost vůči senescentním hMSC různého původu. Pomocí biologických a bioinformatických přístupů porovnáváme vývoj stárnutí u „kardiálních glykosidů citlivých“ A549 a „necitlivých“ hMSC. Bylo zjištěno, že absence analýzy je zprostředkována účinným importem draslíku a zvýšenou odolností vůči apoptóze u senescentních hMSC. Oslabení "antiapoptotické obrany" předurčuje hMSC k analýze. Odhalili jsme, že rezistence na apoptózu, dříve uznávaná jako běžná charakteristika stárnutí, ve skutečnosti není obecným rysem senescentních buněk. Navíc pouze apoptózou-prolinové senescentní buňky jsou citlivé na analýzu indukovanou srdečními glykosidy. Můžeme tedy spekulovat, že účinnost analýzy může záviset na tom, zda se senescentní buňky skutečně stanou rezistentními vůči apoptóze ve srovnání s jejich proliferujícími protějšky.

Klíčová slovaKmenové buňky. Senolýza · Senescence · Apoptóza · Odolnost vůči stresu

Kliknutím sem se dozvíte více

Úvod

Dnes je stárnutí buněk považováno za běžnou reakci téměř všech typů proliferujících buněk, včetně rakovinných a kmenových, a také některých postmitotických buněk na různé stresové podněty [1-3]. Podle původu indukujícího faktoru lze rozlišit následující typy buněčného stárnutí: replikativní (v důsledku poškození DNA na zkrácených koncích telomer), onkogenem indukovaný (v reakci na aberantní aktivaci onkogenní signalizace), stresem indukovaný ( zprostředkované poškozením DNA způsobeným oxidačním stresem, tepelným šokem, UV a y zářením atd.) a indukované chemoterapií (aktivované v rakovinných buňkách jako odpověď na chemoterapeutika)[4-7]. Existuje heterogenita markerů exprimovaných senescentními buňkami v závislosti jak na typu buňky, tak na inzultu použitém k vyvolání stárnutí. Existuje však několik společných znaků typických pro většinu typů senescentních buněk. Základní charakteristikou stárnutí jakéhokoli druhu dělící se buňky je nevratná proliferace [8].extrakt z cistanche tubulosaIreverzibilita zástavy buněčného cyklu je řízena inhibitory cyklin-dependentní kinázy (CDK) pl6 a p21 a je často regulována tumor supresorovým proteinem p53 [8,9]. Dalšími důležitými rysy senescentních buněk jsou aktivace přetrvávající reakce na poškození DNA; buněčná hypertrofie, která často vzniká v důsledku narušené ribozomální biogeneze a syntézy proteinů; narušení lysozomální degradace a dysfunkce ostatních degradačních systémů; zvýšená aktivita specifického lysozomálního enzymu- -galaktosidázy související se stárnutím; různé mitochondriální změny; získání senescencí souvisejícího sekrečního fenotypu (SASP), složeného z prozánětlivých faktorů, enzymů degradujících matrici, reaktivních forem kyslíku atd.; epigenetické a chromatinové změny krajiny, včetně tvorby heterochromatických ložisek souvisejících se stárnutím a distenze satelitů související se stárnutím [8-10]. Jinými slovy, senescentní buňky si zachovávají metabolickou aktivitu a vitalitu, ale jejich fungování je výrazně změněno ve srovnání s původní buňky.

Cistanche může proti stárnutí

Nyní je jasné, že senescentní buňky mohou modifikovat okolní mikroprostředí ovlivňující jak sousední buňky, tak buněčné niky, což může vést k poruchám funkce tkání, a proto může souviset s progresí stárnutí a nemocí souvisejících s věkem [11,12]. S ohledem na to se dnes více pozornosti zaměřuje na strategie cíleného „zabíjení“ senescentních buněk[13-15]. Za tímto účelem se aktivně vyvíjí nová třída léků nazývaná senolytika. Senolytika se zaměřují na signální dráhy, které přispívají k rezistenci senescentních buněk vůči apoptóze, a tak indukují apoptózu přednostně u senescentních buněk[16]. Seznam senolytik se neustále doplňuje o nové látky. Nejznámějšími sloučeninami s uvedenou senolytickou aktivitou jsou navitoclax (inhibitor rodiny Bcl{5}}), kombinace dasatinibu (inhibitor mnohočetných tyrosinkináz) a kvercetinu (přírodní flavonol), inhibitory Hsp90, inhibitory MDM2, FOXO{ {8}}P53 interferující peptid, degradátor proteinů rodiny BET, CAR-T specifický pro uPAR, galaktokonjugovaný navitoclax a různé senolytické přírodní sloučeniny[16-24]. Dvě nezávislé výzkumné skupiny nedávno pomocí vysoce výkonného screeningu léků identifikovaly srdeční glykosidy, zejména ouabain, digoxin a bufalin, jako širokospektrá senolytika [25,26].recenze cistanche tubulosaZa zmínku stojí, že téměř všechna deklarovaná senolytika mají omezení, jako jsou nežádoucí vedlejší účinky nebo neúčinnost vůči některým typům buněk. Mezenchymální kmenové buňky (MSC), které se nacházejí prakticky ve všech postnatálních orgánech/tkáních, se vyznačují schopností sebeobnovy (symetrické dělení) a diferenciace, čímž přispívají k udržení a regeneraci rezidenční tkáně [27]. Díky těmto jedinečným vlastnostem spolu se silnými protizánětlivými a imunosupresivními funkcemi jsou MSC široce používány v buněčné substituční terapii pro léčbu různých onemocnění, včetně diabetu Mellitus, roztroušené sklerózy, infarktu myokardu a tak dále [28]. Nicméně, podobně jako jejich diferencované potomstvo a jiné unipotentní buňky, jsou MSC schopny senescenovat buď replikačně nebo předčasně v reakci na aktivaci onkogenů a stresové podněty [29, 30]. Senescence MSC má spoustu nežádoucích následků, mezi které patří vyčerpání zásoby kmenových buněk, snížená údržba a regenerace tkání, zhoršená diferenciační kapacita, šíření stárnutí zprostředkované SASP, snížené angiogenní vlastnosti, modifikace niky kmenových buněk [29,31-33]. Vezmeme-li v úvahu biologický význam správného fungování MSC, mohou být senescentní MSC považovány za klíčový cíl analýzy. V souladu s tímto návrhem byla v posledním roce publikována řada přehledů zdůrazňujících možné příznivé výsledky odstranění senescentních MSC [29, 31, 34, 35]. Existuje však pouze několik experimentálních údajů týkajících se tohoto problému [36-40].

V rámci této studie poprvé prokazujeme, že srdeční glykosidy, jmenovitě ouabain a bufalin, nevykazují hemolytickou aktivitu vůči lidským MSC (hMSC) pocházejícím z endometria (END-MSC), tukové tkáně (AD-MSC), zubní dřeň (DP-MSC) a Warton jelly (WJ-MSC). Kromě toho potvrzujeme, že oba srdeční glykosidy jsou schopny indukovat apoptózu přednostně u senescentních A549 a SK-HEP-1, jak bylo popsáno dříve v pilotních studiích [25,26]. Posouzením změn v iontové homeostáze způsobené blokováním Nat/K plus -ATPázy a úrovněmi exprese příbuzných genů odhalíme, že nepřítomnost analýzy indukované ouabainem může být zprostředkována zvýšenou účinností kompenzačního K plus importu u senescentního END- MSC ve srovnání se senescentním A549. Dále pomocí pokročilé bioinformatiky demonstrujeme, že stárnutí END-MSC, rezistentních na analýzu indukovanou ouabainem, je doprovázeno získáním fenotypu rezistentního na apoptózu, zatímco senescence A549 citlivého na ouabain nikoli. Důležité je, že blokování aktivity antiapoptotického proteinu MCL-1 před léčbou srdečními glykosidy vedlo k analýze senescentních END-MSC rezistentních na apoptózu. Proto poskytujeme jasný důkaz, že rezistence vůči apoptóze není obecným rysem senescentních buněk. Na základě získaných dat docházíme k závěru, že účinnost analytických přístupů může záviset na tom, zda se buňky během vývoje stárnutí skutečně staly rezistentními vůči apoptóze.

Materiály a metody

Buňky

END-MSC, WJ-MSC, DP-MSC, AD-MSC, A549 a SK-Help byly získány z Ruské sbírky buněčných kultur (Institute of Cytology, Saint-Petersburg, Rusko). Linie A549 a SK-Help byly ověřeny karyologií, tumorigenicitou, izoenzymovými (LDH a G6PD) testy a STR analýzou. Buňky byly kultivovány v kompletním médiu DMEM F12 (Gibco BRL) doplněném 10 procenty FBS (HyClone), 1 procentem penicilin-streptomycinu (Gibco BRL) a 1 procentem glutamové (Gibco BRL). Všechny buňky byly rutinně testovány na kontaminaci mykoplazmaty.

Stavy vyvolávající stárnutí a stres

Pro stárnutí vyvolané oxidačním stresem byly END-MSC/WJ-MSC ošetřeny 200 uM/100 uM HO(Sigma) po dobu 1 hodiny. Pro doxorubicinem indukovanou senescenci byly DP-MSC/A549 ošetřeny 1 uM doxorubicinu (Veropharm) po dobu 3 dnů. V každém případě byly buňky považovány za senescentní ne dříve než 14 dní po ošetření. Pro replikativní senescenci byly AD-MSC dříve než ve 4. pasáži identifikovány jako kontrolní buňky a později než po 10. jako senescentní buňky. Pro etoposidem indukovanou senescenci byly A549/END-MSC/SK-Help ošetřeny 2 uM/5 uM/3 uM etoposidu (Veropharm) po dobu 3 dnů a analyzovány ne dříve než 7 dní po indukci senescence. V tomto případě se design léčby zcela shodoval s designem popsaným ve studii, ze které pocházela data RNA-seq (Wang et al., 2017). Jako senolytické sloučeniny jsme aplikovali dva srdeční glykosidy — Ouabain (Sigma) a Bufalin (Calbiochem).

Za účelem srovnání odolnosti vůči stresu mezi kontrolními a senescentními END-MSC nebo A549 byly buňky ošetřeny buď 400/800 uM H02 (Sigma) po dobu 1 hodiny nebo 0,3/1 uM staurosporinem (Sigma). Životaschopnost buněk byla analyzována 48 hodin po indukci stresu.

K zablokování aktivity MCL-1 byly END-MSC předem ošetřeny 10 uM A-1210477(Sigma) po dobu 3 dnů.

Analýza průtokovou cytometrií

Měření buněčné životaschopnosti, proliferace, velikosti buněk, autofluorescence, rychlosti apoptózy, štěpení kaspázou 3/7, mitochondriálního membránového potenciálu a membránové depolarizace byla provedena průtokovou cytometrií. Průtoková cytometrie byla provedena pomocí CytoFLEX (Beckman Coulter) a získaná data byla analyzována pomocí softwaru CytExpert verze 2.0. Adherentní buňky byly dvakrát promyty PBS a sklizeny trypsinizací. Oddělené buňky byly spojeny a resuspendovány v čerstvém médiu a poté spočítány a analyzovány na autofluorescenci. Aby se získala životaschopnost buněk, bylo ke každému vzorku těsně před analýzou přidáno 50 ug/ml propidium jodidu (Life Technologies). Velikost buněk byla hodnocena cytometrickým dopředným rozptylem světla PI-negativních buněk. Indukce apoptózy byla ověřena pomocí Annexin-V-APC (Invitrogen) a DAPI (Sigma) společného barvení podle pokynů výrobce. Aktivita kaspázy byla hodnocena pomocí soupravy CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) podle protokolu výrobce. Ztráta mitochondriálního membránového potenciálu byla hodnocena pomocí poměrového barviva JC-1 (Invitrogen). Postup barvení byl proveden v souladu s protokolem výrobce. Pro depolarizaci membrány jsme použili fluorescenční sondu DiBAC4(3) (Invitrogen).

Barvení galaktozidázou spojené se stárnutím

Barvení galaktosidázou (SA- -Gal) spojené se stárnutím bylo provedeno pomocí soupravy pro barvení senescencí galaktosidázou (Cell Signaling Technology) podle pokynů výrobce. Kvantitativní analýza snímků byla vytvořena s použitím balíčku MatLab podle algoritmu popsaného dříve[41]. Pro každý experimentální bod bylo analyzováno ne méně než 50 náhodně vybraných buněk.

Western blotting

Western blotting byl proveden tak, jak bylo popsáno dříve [41]. Elektroforéza SDS-PAGE, přenos na nitrocelulózovou membránu a imunoblotování s detekcí ECL (Thermo Scientific) byly provedeny podle standardních protokolů výrobce (Bio-Rad Laboratories). Byly použity protilátky proti následujícím proteinům: glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH)(klon 14C10), fosfo-p53(Ser15), p21(klon 12D1), fosfo-Rb (Ser807/811) HMGB1 (klon D3E5), stejně jako kozí antikráličí IgG konjugovaný s křenovou peroxidázou. Rychlost ředění byla 1:1000 pro všechny primární protilátky a 1:7000 pro sekundární protilátky. Všechny protilátky byly zakoupeny od Cell Signaling. K výběru a stanovení hustoty pruhů odečtené od pozadí ve všech gelech a blotech byl použit Scion Image 4.0 (Scion Corporation).

Transkriptomická analýza

V analýze byly použity vzorky z následujících tří datových sad Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 a GSM2742121-GSM2742122pro kontrolní a senescentní buňky A549, podle toho); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 a GSM3454500-GSM3454502 pro kontrolní a senescentní IMR-90 buňky); a naše datová sada GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 a GSM4877907-GSM4877910 pro řídicí a senescentní END-MSC). Údaje pro všechny datové sady byly zpracovány stejným způsobem.

Nezpracovaná data prošla kvalitním filtrováním a ořezáváním adaptéru pomocí skriptů FilterByTile a BBDuk z balíčku BBtools (verze 38.75) s použitím výchozích možností. Zbývající čtení byla dodatečně filtrována a oříznuta pomocí trimestrového skriptu z balíčku FastqPuri (verze 1.0.7).cistanche UKOperace oříznutí byla použita pro oba konce čtení, pokud obsahovaly N nebo jejich kvalita byla pod prahem kvality nastaveným na 27, všechna čtení kratší než 25 bází byla vyřazena. Kontrola kvality oříznutí byla provedena pomocí softwaru FastQC (verze 0.11.7) a skriptů FastqPuri. Čtení, která prošla všemi operacemi, zahrnují ne méně než 90 procent počátečních dat.

Množství přepisů bylo odhadnuto pomocí odlehčeného mapování Salmon (verze 1.1.0) spuštěného v režimu selektivního zarovnání. Seznam návnad byl vytvořen na základě lidského referenčního genomu Gencode GRCh38.p13 (vydání 33) a dále byl použit pro vytvoření indexu na zřetězeném transkriptomu a referenčních souborech genomu Gencode (vydání 33) s použitím velikosti kmer 21. Byly spuštěny operace mapování s dalšími příznaky——numBootstraps 30——flitry——gcBias——ověření mapování. Výsledné míry mapování se pohybovaly kolem 70 procent.

Další zpracování dat bylo provedeno pomocí R verze 3.6.3 s kolekcí balíčků Tidyverse (verze 1.3.0). Odhadované počty genů, metadata a rozsahy transkriptů byly načteny do R a sumarizovány na genovou úroveň pomocí tximeta (verze 1.4.5). Výsledná matice počtu byla filtrována tak, aby obsahovala řádky s alespoň 5 odhadovanými počty ve všech vzorcích, výsledná matice obsahovala 20 400 genů.

Pro reprezentaci PCA a teplotní mapy byly počty přečtení normalizovány pomocí log transformace z balíčku DESeq2 (verze 1.26.0).cistanche wirkungTeplotní mapy byly vytvořeny s použitím balíčků genového filtru (verze 1.38.0) a teplotní mapy (verze 1.0.12)R. Validace vzorků dělení podle proměnné stárnutí byla provedena prostřednictvím podmnožin normalizovaných počtů čtení genů souvisejících s termínem "Cellular seescence" (Cellular senescence) (GO 0090398) z genové ontologie. Diferenciální analýza exprese a odhad log násobných změn byly vypočteny pomocí DESeq2 pro poslední proměnnou ve vzorci návrhu kontroly stavu stárnutí buněk, reakci na ošetření ouabainem a interakci uvedených faktorů. Pro posílení diferenciálního testování exprese byla použita korekce změny logaritmického skládání pomocí kombinace adaptivního odhadu smrštění z balíčku pro dlaně (verze 1.8.{28}}) a specifikující další práh změny logaritmického skládání rovnající se 0,667. Výsledné zmenšené odhady byly dále použity pro klasifikaci genů a spuštění analýzy obohacování genové sady s použitím balíčků klastrového profilu (verze 3.14.3) a fúze (verze 1.12.0)R s hodnotami p upravenými pro vícenásobná srovnání podle Benjamin-Hochbergovy metody. Vzorky mikročipů Affymetrix pro kontrolu a senescentní AD-MSC byly získány z databáze GEO (GSE66236) a zpracovány webovou aplikací Phantasus s normalizací log2 a kvantilů. Analýza obohacení genové sady byla provedena s použitím balíčku fuse (verze 1.12.0)R.

Extrakce RNA, reverzní transkripce a PCR v reálném čase

Extrakce RNA, reverzní transkripce a PCR v reálném čase byly provedeny tak, jak je popsáno v naší předchozí studii [32]. Reagencie pro extrakci RNA (reagent ExtractRNA), reverzní transkripci (MMLV RT kit) a real-time PCR (HS SYBR kit) byly získány od Evrogen. Úrovně genové exprese byly hodnoceny pomocí zesilovače BioRad CFX-96 v reálném čase (BioRad) s následujícím běžícím programem pro všechny zkoumané geny: 40 cyklů tání po dobu 10 s při 95 stupních, žíhání 15 s při 57,5 ​​stupních a syntéza po dobu 15 s při 72 stupních. Ke kontrole specifičnosti reakcí byla použita analýza křivek tání. Následující analýza získaných dat byla provedena pomocí softwaru Bio-Rad CFX Manager (BioRad) se standardní kvantifikační metodou 2deltaCt s použitím exprese GAPDH jako reference. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 1.

Statistická analýza

Pro získání významnosti rozdílu mezi dvěma skupinami byl použit Studentův t-test nebo Welchův t-test. Pro vícenásobná srovnání mezi skupinami byla použita ANOVA s Tukeyho HSD. Pokud není uvedeno jinak, všechny kvantitativní údaje jsou uvedeny jako průměr ± SD a hvězdičky označují významné rozdíly takto: ns, nevýznamné,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Výsledek

END-MSC ošetřené H2O2-vstupují do předčasného stárnutí

V této studii jsme použili lidské mezenchymální kmenové buňky izolované z deskvamovaného endometria (END-MSC), které splňují minimální kritéria navržená ISCT pro definování hMSC [41]. Dříve jsme vyvinuli spolehlivý experimentální model pro studium různých aspektů předčasného stárnutí END-MSC [30]. Konkrétně jsme ukázali, že END-MSC vystavené subletálnímu oxidativnímu stresu postupně získaly všechny typické rysy senescentních buněk, včetně perzistentních ložisek poškození DNA a aktivní reakce na poškození DNA, nevratné zástavy buněčného cyklu zprostředkované klasickým p53/p21/Rb dráha, ztráta proliferace, buněčná hypertrofie, výskyt SA- -Gal barvení a vývoj sekrečního fenotypu spojeného se stárnutím [30, 32, 42]. Zde jsme použili navržený model ke studiu senolytického účinku ouabainu a také k odhalení základních intracelulárních změn v iontové homeostáze. Zpočátku jsme odhadem nejběžnějších parametrů potvrdili, že léčba jednou dávkou (1 h, 200 μM) HO byla dostatečná k vyvolání stárnutí u END-MSC. Důležité je, že stresované END-MSC byly považovány za senescentní dva týdny po oxidačním stresu; proto byly všechny markery stárnutí hodnoceny ne dříve než 14 dní po ošetření H-Oz. Ošetření END-MSC H-Oz skutečně vedlo k proliferačnímu bloku, buněčné hypertrofii, jak je indikováno zvětšenou velikostí buněk, akumulaci lipofuscinu detekované zvýšením autofluorescence, objevením SA- -Gal, aktivací p21/Rb dráha a ztráta HMGB1 společně podporují vznik stárnutí za zvolených experimentálních podmínek (obr. ac,e,f).

Předpokládá se, že nejškodlivější účinky senescentních buněk na úrovni tkání a organismu jsou důsledkem jejich prodloužené vitality. V souladu s tímto bodem si END-MSC ošetřené HO? zachovaly vysokou životaschopnost i v pozdních fázích vývoje stárnutí (životaschopnost senescentních END-MSC byla hodnocena 17 dní (14 dní – 3 dny) po počátečním oxidativním stresu) (obr. 1d ). Abychom to shrnuli, subletální HO2-léčba END-MSC je vhodným modelem předčasného stárnutí a je relevantní pro zkoumání účinků senolytických sloučenin na END-MSC.

Srdeční glykosid ouabain nemá žádnou senolytickou aktivitu vůči senescentním END-MSC v širokém rozmezí koncentrací

Nedávné důkazy naznačují, že srdeční glykosidy, včetně ouabainu, digoxinu a bufalinu, představují skupinu sloučenin s hemolytickou aktivitou [25,26]. I když jsou dnes srdeční glykosidy považovány za širokospektrá senolytika, údaje o jejich účincích na senescentní hMSC chybí. Proto jsme zde testovali, zda má ouabain potenciál selektivně vyvolat smrt u senescentních END-MSC. Abychom tak učinili, hodnotili jsme životaschopnost kontrolních a senescentních END-MSC po léčbě ouabainem v širokém rozmezí koncentrací (od 10-' do 10~ M). Je zajímavé, že ani jedna aplikovaná koncentrace nevedla ke znatelnému snížení životaschopnosti jak kontrolních, tak senescentních buněk první den po aplikaci ouabainu (obr. 2 a doplňkový obr. S1).

Třetí den po léčbě ouabainem jsme však odhalili významný na dávce závislý pokles životaschopnosti kontrolních END-MSC (obr. 2a a doplňkový obr. S1). Neočekávaně se ukázalo, že senescentní buňky jsou odolnější vůči ouabainu v každé testované koncentraci. V souladu s tímto výsledkem10-Mouabain vedl k náchylnější apoptotické smrti v kontrolních buňkách (20,75 procent An plus /PI-a 36,47 procent An plus /PI plus ) ve srovnání se senescentními buňkami (15,01 procent An＋/PI -a 12,15 procenta An plus/PI plus) (obr. 2b). Získané výsledky jasně ukazují, že v kontextu senescentních END-MSC nemá ouabain žádnou senolytickou aktivitu.

Abychom vyloučili možné účinky spojené s variabilitou stimulů indukujících senescenci na senolytické působení ouabainu, provedli jsme další sadu experimentů. Jmenovitě jsme ošetřili END-MSC etoposidem místo oxidačního stresu, abychom vyvolali předčasné stárnutí.citrusové bioflavonoidyEND-MSC ošetřené etoposidem vykazovaly všechny rysy typické pro senescentní buňky (obr. 3a-e).

Důležité je, že ouabain neměl žádný hemolytický účinek na senescentní END-MSC ošetřené etoposidem (obr. 3f a doplňkový mentální obr. S2). Tato data poskytují další potvrzení výše uvedených výsledků a důkaz, že nedostatek analýzy indukované ouabainem není důsledkem konkrétního spouštěče stárnutí použitého k vyvolání stárnutí.

Obr. 1 Validace modelu předčasného stárnutí END-MSC indukovaného oxidačním stresem. Senescentní END-MSC volná proliferace, b podléhají hypertrofii, c získají zvýšenou autofluorescenci, zachovávají si vysokou životaschopnost buněk da e vykazují SA- -Gal aktivitu ve srovnání s kontrolními. f Hladiny fosforylace p53 a Rb a hladiny exprese p21 a HMGBI proteinů v kontrolním a senescentním END-Ouabainu nemá žádný hemolytický účinek na lidské mezenchymální kmenové buňky různého původu Abychom rozšířili naše pozorování ohledně absence analýzy indukované ouabainem v END-MSC analyzovali jsme účinky ouabainu na hMSC izolované z jiných zdrojů, včetně tukové tkáně, zubní dřeně a Whartonova želé. Abychom dále posílili naše data, použili jsme různé modely senescence – replikační senescence pro AD-MSC, doxorubicinem indukovaná senescence pro DP-MSC a stárnutí indukované oxidačním stresem pro WJ-MSC (obr. 4a-f).

Jak je znázorněno na obr. 4g, různé typy hMSC se lišily v životaschopnosti po léčbě ouabainem, například kontrolní i senescentní DP-MSC byly mnohem odolnější vůči působení ouabainu než WJ-MSC (obr. 4g a doplňkový obr. S3b, C). Nicméně ouabain nebyl schopen vyvolat senolýzu v žádném typu senescentních hMSC (obr. 4g a doplňkový obr. S3). Získaná data společně ukazují, že absence analýzy indukované ouabainem je společným rysem pro různé typy hMSC. MSC. Uvedené hodnoty jsou průměr ± SD. Pro více skupinových srovnání v a a d byla použita jednosměrná analýza ANOVA, n=3, ns nevýznamné,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH byl použit jako kontrola zatížení

Srdeční glykosid bufalin nedokáže zabít senescentní END-MSCS

Abychom ověřili absenci senolytického účinku srdečních glykosidů vůči hMSC, aplikovali jsme bufalin, další sloučeninu s uvedenou senolytickou aktivitou patřící do rodiny srdečních glykosidů [25]. Bufalin neměl téměř žádný vliv na životaschopnost kontrolních a H2O2-léčených senescentních END-MSC v širokém rozmezí koncentrací (od 10-7 do 10-5 M) (obr. 5a a dodatek obr. S4a).

Podobně jako jsme pozorovali u léčby ouabainem, nepřítomnost analýzy bufalinu byla nezávislá na stimulech vyvolávajících stárnutí, protože životaschopnost ESC, které senesly buď v reakci na oxidační stres, nebo na etoposid, nebyla ovlivněna (obr. 5a, b, doplňkový obr. S4a, b). Výše popsané výsledky potvrzují, že se srdeční glykosidy ukázaly jako neúčinné pro cílenou indukci smrti u senescentních END-MSC. MSC. Uvedené hodnoty jsou průměr ± SD. Pro více skupinových srovnání v a a d byla použita jednosměrná analýza ANOVA, n=3, ns nevýznamné,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Srdeční glykosid bufalin nedokáže zabít senescentní END-MSCS

Abychom ověřili absenci senolytického účinku srdečních glykosidů vůči hMSC, aplikovali jsme bufalin, další sloučeninu s uvedenou senolytickou aktivitou patřící do rodiny srdečních glykosidů [25]. Bufalin neměl téměř žádný vliv na životaschopnost kontrolních a H2O2-léčených senescentních END-MSC v širokém rozmezí koncentrací (od 10-7 do 10-5 M) (obr. 5a a dodatek obr. S4a).

Podobně jako jsme pozorovali u léčby ouabainem, nepřítomnost analýzy bufalinu byla nezávislá na stimulech vyvolávajících stárnutí, protože životaschopnost ESC, které senesly buď v reakci na oxidační stres, nebo na etoposid, nebyla ovlivněna (obr. 5a, b, doplňkový obr. S4a, b). Výše popsané výsledky potvrzují, že se srdeční glykosidy ukázaly jako neúčinné pro cílenou indukci smrti u senescentních END-MSC.

Obr. 2 Ouabain nemá žádnou hemolytickou aktivitu vůči senescentním END-MSC ošetřeným HO2-v širokém rozmezí koncentrací. Relativní buněčná životaschopnost (procenta) kontrolních a senescentních END-MSC za 3 dny po léčbě 1077,10~6,10-5 Mouabainem. b Indukce apoptózy v END-MSC po 10-6 Mouabainu hodnocená dvojitým barvením Annexinem V/DAPI. n=3 nezávislých experimentů. Všechny údaje odpovídají průměru ± SD. Statistická významnost byla hodnocena Welchovým t-testem: nevýznamný,***p<>

Oba srdeční glykosidy ouabain a bufalin jsou schopny selektivně vyvolat buněčnou smrt v senescentních buňkách A549 a SK-Hep1

Vzhledem k tomu, že naše výsledky neodpovídají nedávno publikovaným důkazům o širokospektrálním senolytickém působení srdečních glykosidů, rozhodli jsme se tento účinek reprodukovat pomocí buněčného modelu popsaného v relevantních studiích [25,26]. Provedli jsme tedy sérii experimentů s použitím kontrolních a senescentních buněk plicního karcinomu A549. Senescence v buňkách A549 byla indukována ošetřením etoposidem. Etoposidem indukovaná senescence buněk A549 je často používaným, a tedy dobře charakterizovaným modelem stárnutí indukované léčbou [4]. Také bylo prokázáno, že ouabain selektivně zabíjí senescentní buňky A549 ošetřené etoposidem[25]. Abychom prokázali stárnutí u A549, hodnotili jsme rychlost proliferace, velikost buněk, akumulaci lipo-jemných, SA- -Gal barvení, stav aktivace dráhy p53/p21/Rb a úroveň exprese HMGB1 (obr. 6a-e).

Abychom ověřili hemolytickou aktivitu ouabainu vůči senescentním rakovinným buňkám, nejprve jsme odhadli životaschopnost buněk závislou na dávce. V souladu s našimi výsledky popsanými výše jsme nebyli schopni detekovat žádný významný pokles počtu životaschopných kontrolních nebo senescentních buněk A549 do 24 hodin po aplikaci ouabainu (doplňkový obr. S5a). Nicméně za 3 dny po léčbě ouabain významně snížil životaschopnost senescentních buněk A549 způsobem závislým na dávce, zatímco počet kontrolních buněk A549 se snížil v mnohem menší míře (obr. 7a a doplňkový obr. S5a). Konkrétně přibližně 90 procent kontrolních buněk si zachovalo životaschopnost při 10- Mouabain ve srovnání s 50 procenty senescentních buněk A549 ošetřených stejnou dávkou (obr. 7a). Navíc senescentní buňky A549 byly náchylnější k bufalinem indukované buněčné smrti než jejich kontrolní protějšky (obr. 7b) (obr. 5b a doplňkový obr. S5b).

Podle publikovaných údajů spustil ouabain apoptózu v senescentních buňkách A549 -3-závislou na kaspáze [26]. Ve skutečnosti jsme odhalili významný nárůst dvojitě pozitivní a/nebo PI-frakce u senescentních rakovinných buněk ošetřených 10-6M ouabainem (obr. 7c). Dále jsme pomocí fluorescenčního testu pozorovali aktivaci kaspázy-3 v senescentních buňkách A549 ošetřených ouabainem (obr. 7d). Celkově vzato jsou tyto výsledky zcela v souladu s údaji popsanými jinými autory a potvrzují hemolytickou aktivitu ouabainu vůči A549.

Také jsme použili doxorubicin místo etoposidu k vyvolání stárnutí u A549 (obr. 8a-e). Jak se očekávalo, senescentní A549 ošetřený doxorubicinem, stejně jako ošetřený etoposidem, vykazoval vyšší citlivost jak na ouabain, tak na bufalin ve srovnání s jejich kontrolními protějšky (obr. 8g a doplňkový obr. S6). Posledně uvedené potvrzuje, že senolytické účinky srdečních glykosidů jsou nezávislé na stimulech indukujících stárnutí. Srdeční glykosidy tedy skutečně mají senolytické

Obr. 3 Ouabain není schopen vyvolat senolýzu u senescentních END-MSC léčených etoposidem. Validace modelu stárnutí vyvolaného epizodou pro END-MSC: schopnost proliferace, velikost b buněk, c úrovně autofluorescence a d SA- -Gal aktivita, e úroveň fosforylace Rb a úrovně exprese proteinů p21 a HMGBI. f Relativní buněčná životaschopnost (procento) kontrolních a senescentních buněk po ošetření 10-6 ouabainem. Hodnoty jsou střední ± SD. Pro více skupin byla použita srovnání na jednosměrné ANOVA, n=3, ns nevýznamné,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Nakonec jsme se rozhodli reprodukovat analytické experimenty na buňkách rakoviny jater ošetřených etoposidem SK-Help, dalším buněčném modelu s prokázanými senolytickými účinky srdečních glykosidů podle Guerrera et al. studie [25] (obr.9a-e). Senescentní SK-Help ošetřený etoposidem prokázal vyšší citlivost na obě látky ve srovnání s jejich kontrolními protějšky, což prokázalo hemolytické působení srdečních glykosidů vůči tomuto typu buněk (obr. 9f a doplňkový obr. S7).

Tyto údaje společně dokazují, že selektivita hemolýzy vyvolané srdečními glykosidy závisí více na povaze buňky než na konkrétním spouštěči stárnutí.

Tento článek je převzat z Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x