Theaflavinem regulované Imd kondenzáty kontrolují intestinální homeostázu a stárnutí Drosophila, část 2
Jul 01, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Pozadí:Fibróza je jedním z nejčastějších patologických rysů procesu stárnutí ledvin a fibróza ve stárnoucích ledvinách také zhoršuje proces chronického onemocnění ledvin (CKD). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C. flabellata, CF) je běžně používaná botanická droga v čínském folklóru. Málo studií však uvádí jeho farmakologické účinky. Cílem této studie bylo prozkoumat účinek CF ethanolového extraktu na renální fibrózu u myší SAMP8 a identifikovat potenciálně aktivní sloučeniny.
Metody:Myš náchylná k senescenci 8 (SAMP8) byla použita jako zvířecí modely a různé dávky CF byly podávány sondou po dobu jednoho měsíce. Pozorovat stupeň renálního stárnutí u myší pomocí -galaktosidázového barvení. Massonovo barvení a hladiny exprese Col-ll, a-SMA a FN byly použity k hodnocení renální fibrózy u myší. Byly měřeny hladiny proteinové exprese dráhy Nrf2 a dráhy Wnt/-catenin/RAS v ledvinách. A -galaktosidáza (-gal) indukovala buňky NRK-52E jako in vitro model pro screening aktivních složek CF.
Výsledek:CF ethanolový extrakt významně inhiboval aktivitu renální galaktosidázy a hladiny exprese Coll, a-SMA a FNin SAMP8 myší a zlepšil Massonovo barvení u SAMP8 myší. CF pozoruhodně snížila hladinu proteinu v moči, kreatininu, dusíku močoviny a sérové hladiny TNF-a a IL-1 u myší SAMP8 a významně zvýšila hladiny SOD a GSH-Px. Navíc CF aktivovala dráhu Nrf2 a blokovala dráhu Wnt/-catenin/RAS v ledvinách myší. Kromě toho 3,4-dihydroxyfenylethanol (SDC-0-14,16) a (3,4-dihydroxyfenylethanol-8-O-[4-O-trans -caffeoyl- -D-apiofuranosy-(1→3)- -D-glukopyranosyl (1→6)]- -D-glukopyranosid (SDC-1-8) byly izolovány z CF , která snížila stárnutí buněk NRK-52E, a možná aktivní složky CF, které hrají roli proti stárnutí.
Závěry:Naše experimenty ukázaly, že CF ethanolový extrakt může zlepšit renální fibrózu u myší SAMP8 prostřednictvím dráhy Wnt/-catenin/RAS. A SDC-0-14,16 a SDC-1-8 mohou být materiálním základem pro CF pro uplatnění antirenálních účinků souvisejících se stárnutím.
klíčová slova:Stárnutí, Corallodiscus flabellata, Ledviny, Renální fibróza, SAMP8, Senescence, Wnt/-catenin/RAS
Úvod
Globální prevalence chronického onemocnění ledvin (CKD) roste se stárnutím populace a představuje významnou zátěž pro společnost [1-3]. Nejčastějším patologickým projevem CKD je některá forma renální fibrózy[4]. Stejně tak je renální fibróza také jedním z příznaků stárnutí ledvin [2]. Studie ukázaly, že oxidační stres, zánět, Wnt/-catenin, renin-angiotensin-aldosteronový systém (RAS) a signalizace rapamycinu (mTOR) všechny souvisí s CKD vyvolaným stárnutím [5]. Renální fibróza u stárnoucích ledvin úzce souvisí s aktivací Wnt/-kateninu a signální dráhy RAS [6]. Po aktivaci Wnts je -catenin v cytoplazmě translokován do jádra, kde se váže na lymfoidní zesilovač-vazebný faktor (LEF)/rodinu transkripčních faktorů T-buněčného faktoru (TCF) a iniciuje transkripci downstream cílových genů. Je zajímavé, že promotorová oblast genu RAS také obsahuje vazebná místa LEF/TCF, což umožňuje -cateninu podporovat vazbu LEF-1 na tato místa[7].cistanche cholesterol,Zacílení na signální dráhu Wnt/-catenin/RAS by proto mohlo být potenciální terapeutickou strategií pro renální fibrózu [8,9]. V posledních letech přitáhla pozornost mnoha odborníků substituční terapie renální fibrózy přírodními produkty [10]. . Xiaoyan Shen et al. zjistili, že ginsenosid Rgl zlepšil glomerulární fibrózu během stárnutí ledvin inhibicí aktivace zánětu NLRP3 u myší SAMP8 [11]. Tato studie zkoumala účinek extraktu C. flabellate (CF) na renální fibrózu u myší SAMP8 z dráhy Wnt/-catenin/RAS.
Cistanche může proti stárnutí
CF jako léčivá rostlina v Číně byla poprvé zaznamenána v "Dian Nan Ben Cao. Celá rostlina se běžně používá k léčbě úplavice, předčasné ejakulace, onemocnění semenných váčků a onemocnění ledvin v oblastech etnických menšin v Číně [12]. V současnosti , v moderním výzkumu existuje jen málo zpráv o CF. Farmakologické studie v naší laboratoři zjistily, že extrakt CF měl diuretické účinky a zlepšil jaterní selhání a poškození mozku u potkanů vyvolané lipopolysacharidem/D-galaktosaminem [13, 14] a fytochemické studie na odhalila, že fenylethanoidové glykosidy a flavonoidy byly hlavními chemickými složkami CF [15,16].Cílem této studie bylo prozkoumat účinek extraktu CF na renální fibrózu u myší SAMP8 a objasnit její možný mechanismus, aby bylo možné poskytnout experimentální důkazy pro léčbu onemocnění ledvin pomocí CF popsané ve starých knihách.
Materiály a metody
Sběr a extrakce rostlinného materiálu
"Yunnan Chinese Herbal Medicine" zaznamenává, že CF lze sklízet po celý rok. CF rostliny použité v tomto experimentu byly sklizeny v Xixia County, provincie Henan, Čína v září. Identifikoval ji profesor Suiqing Chen z Henan University of Chinese Medicine a vzorky byly uloženy v knihovně laboratorních vzorků.vedlejší účinky cistanche deserticolaRostliny (1 kg) byly refluxovány s 50% ethanolem (3 x 12 1, každou 1 hodinu) a směs byla přefiltrována přes 16 vrstev gázy. Spojené filtráty byly vysušeny rotačním odpařováním za použití vymrazovací sušárny. Nakonec byl procentní výtěžek 50% ethanolového surového extraktu CF 15,5 %. Vysušený extrakt byl do dalšího použití uchováván v lednici. V doplňkových materiálech jsou uvedeny příslušné údaje o označení složky extraktu CF.
Jiný dříve uvedený separační proces byl v této studii použit k získání frakce eluce vody, 20 procent ethanolové eluční frakce, 30 procent ethanolové eluční frakce a 40 procent ethanolové eluční frakce z CF [13]. Frakce 40 procent ethanolu byla oddělena pomocí Sephadexu LH-20 a silikagelové kolony a čištěna semipreparativní vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC), aby se nakonec získaly sloučeniny jako SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60 (p-hydroxybenzylalkohol).
Zvířata a podávání
V této studii byli použiti šestiměsíční samci SAMP8 a myši 1(SAMR1) odolné vůči stárnutí s akcelerovanou myší z First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine (Tianjin, Čína). Zvířata byla chována za podmínek kontrolovaného světla (cyklus 12-h světlo/tma), teploty (23-25 stupňů C) a vlhkosti (45-55 procent) a dostávala standardní stravu a vodu. libitum. Celkem 48 myší SAMP8 bylo rozděleno do čtyř experimentálních skupin (n=12/skupina): Modelové myši SAMP8 (M), myši SAMP8 léčené nízkou dávkou CF ethanolového extraktu (CF-L, 387,5 mg/kg, intragastricky), myši SAMP8 léčené střední dávkou CF ethanolového extraktu (CF-M, 775 mg/kg, intragastricky) a myši SAMP8 léčené vysokou dávkou CF ethanolového extraktu (CF-H, 1550 mg/ kg, intragastricky). Myši v kontrolní SAMRI (Con, n=10) a modelových skupinách SAMP8 (M) byly léčeny fyziologickým roztokem (0,9 procenta). Všechny myši byly léčeny orálně po dobu 1 měsíce. Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny etickou komisí Univerzity čínské medicíny v Henan a byly provedeny podle institucionálních směrnic (Henan, číslo schválení v Číně: HACTCM-2018009060-19). Během experimentu došlo k jednomu úmrtí myši v každé ze skupin Con a M a dvě myši zemřely ve skupině CF-H.
Kolekce vzorků
Na konci experimentu byly myši umístěny jednotlivě do metabolických klecí na 12-h odběry moči. Myši byly poté anestetizovány isofluranem a vzorky krve byly odebrány retroorbitálním krvácením. Ledviny z každé myši byly poté chirurgicky odstraněny a udržovány při 80 stupních až do analýzy.
Buněčné kultury a studie in vitro
Buňky NRK-52E zakoupené od buněčné banky Čínské akademie věd (Shanghai, Čína) byly kultivovány, aby se prozkoumal účinek extraktu CF na stárnutí buněk způsobené D-galaktózou (D-gal, S11050, Yuanye, Šanghaj, Čína). Buňky NRK-52E byly pěstovány v Dulbeccově modifikaci Eagleova média Dulbecco (DMEM,12,100,046, Thermo Fisher, Massachusetts, USA) s 10% fetálním bovinním sérem v inkubátoru při 37 °C a v přítomnosti 5 procent , CO. Buňky byly pěstovány na 96-jamkových destičkách nebo 6-jamkových destičkách do 80-85 procenta konfluence a poté ošetřeny růstovým médiem obsahujícím různé kombinace léčiv: Médium plus D-gal ( 20 mg/ml）, médium plus D-gal plus CF（10, 25,50, 100 ug/ml）nebo médium plus D-gal plus monomerní sloučenina） (10 μM） v tomto pořadí po dobu 48 h. Následně se methyl thiazolyl tetrazolium( MTT) test byl použit pro detekci buněčné životaschopnosti a -galaktosidázové barvení bylo použito pro pozorování buněčné stárnutí.
Barvení galaktozidázou spojené se stárnutím
Zmrazené ledviny myší nakrájené na řezy o tloušťce 10-μm a buňky NRK-52E byly obarveny galaktozidázou spojenou se stárnutím (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Čína) podle protokolů výrobce.
Histologická analýza
Řezy ledvin byly fixovány 4% pufrovaným paraformaldehydem a řezy o tloušťce 10-μm zalité v parafínu byly obarveny Massonovým trichromem (G10}06, Service, Wuhan, Čína) a pozorovány mikroskopicky. Modře zbarvené oblasti v Massonových řezech obarvených trichromem byly měřeny kvantitativně ze šesti náhodně vybraných polí a analyzovány softwarem Image-Pro Plus 6.0.
Biochemická měření
Vzorky homogenátu séra a ledvin byly rozmraženy na pokojovou teplotu a byly zjištěny hladiny superoxiddismutázy (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, Čína), glutathionperoxidázy (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Čína), interleukin-1 (IL-1, RK00006, ABClonal, Wuhan, Čína), tumor nekrotizující faktor- (TNF-, RK00027, ABklonal, Wuhan, Čína), močovinový dusík (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Čína), kreatinin (Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Čína) v myším séru, celkový protein v moči (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , Čína) v moči myší a hladin exprese kolagenu typu I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, Čína), -aktinu hladkého svalstva (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, Čína), fibronektinu (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, Čína) v myších ledvinových tkáních byly měřeny postupně podle protokolu výrobce testovací soupravy.
Imunohistochemická analýza
Imunohistochemická analýza byla provedena rutinní metodou [17]. Použité protilátky zahrnovaly následující: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), -catenin (17565-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), receptory angiotenzinu II typu 1 (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, USA), p-nukleární faktor erytroidního 2-faktoru 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, UK), pc-Fos(ab27793,Abcam,Cambridge, UK ), růstový faktor pojivové tkáně (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, Čína). Řezy byly pozorovány pod mikroskopem (Olympus, Tokio, Japonsko).cistanche dávkování redditZměřte plochu a integrovanou optickou hustotu (IOD) oblasti s výrazem opálení pomocí softwaru Image-Pro Plus 6.0 a vypočítejte střední optickou hustotu (MOD, MOD=IOD/plocha) pro polo -kvantitativní analýza.
Western blot analýza
Western blot test byl proveden tak, jak je popsáno v předchozí studii [18]. Stručně řečeno, tkáně ledvin byly homogenizovány v lyzačním pufru a kvantifikovány pomocí soupravy Bradford Protein Assay Kit (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, Čína). Homogenáty byly poté podrobeny elektroforéze na dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu sodného, přeneseny na polyvinylidenfluoridovou membránu a blokovány v blokovacím pufru (4% odtučněné sušené mléko) po dobu 90 minut. Poté byly inkubovány s primárními protilátkami (Wnt4; renin; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; Kelch-like ECH související protein 1 (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, Čína); -aktin (AC026, Abclonal, Wuhan, Čína); a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, Čína)) přes noc při 4 stupních a následuje inkubace s vhodnou sekundární protilátkou konjugovanou s fluo-přítomností po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě . Požadované proteiny byly skenovány IR skenerem Odyssey (LI-COR Biosciences, Nebraska, USA) a intenzity signálu byly kvantifikovány pomocí softwaru Image Studio. Hladiny proteinu byly normalizovány proti -aktinu nebo GAPDH.
UPLC-Q-TOF-MS analýza vzorků ledvin
Renální tkáně byly zváženy a homogenizovány v ledově studeném fyziologickém roztoku (w/v =1:1). Poté byl 1 ml acetonitrilu přidán do 200 μl vzorků tkáňového homogenátu a následovala ultrazvuková extrakce po dobu 30 minut. Extrakt byl centrifugován při 12,{7}} g a 4 stupních po dobu 10 minut. Supernatant byl odebrán do lahvičky pro analýzu. Chromatografická separace byla provedena pomocí ultravýkonné kapalinové chromatografie (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, USA), s LC systémem obsahujícím kolonu Acclaim RSLC 120 C18 （2,2 μm, 2,1 × 100 mm; Thermo Scientific).výhody extraktu z cistancheMobilní fáze se skládala z rozpouštědla A (acetonitril) a vody s {{0}},1 procenta kyseliny mravenčí (B). Separace byla provedena gradientovou elucí následovně:10-70 procento A od 0 do 3 minut, 70-78 procento A od 4 do 13 minut, 78-90 procento A od 14 do 15 minut, 90 procent -10 procent A od 15 do 16 minut a 10 procent A od 16 do 20 minut. Nástřikový objem testovaného vzorku byl 2 μl. Analýza hmotnostní spektrometrie (MS) byla provedena za použití zdroje ESI za následujících podmínek: kapilární napětí v kladném módu bylo 3,5 kV a kapilární napětí v záporném módu bylo 3,2 kV. Tlak nebulizéru byl 2,0 bar, teplota suchého plynu byla 230 stupňů a průtok byl 8 l/min.
Statistická analýza
The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; pro srovnání mezi skupinami byla použita jednosměrná analýza rozptylu. Hodnota AP menší než 0,05 byla považována za statisticky významnou.
Výsledek
CF zlepšila stárnutí a fibrózu ledvin u myší SAMP8
Ke zkoumání účinku CF na ledviny myší SAMP8 byla měřena aktivita SA- -gal v ledvinách. Na obr. la je aktivita SA- -gal v ledvinových tkáních významně zvýšena ve skupině M (modré zesílení). Podávání CF-L a CF-M významně inhibovalo aktivitu -galaktosidázy v ledvinách myší SAMP8, zatímco zlepšení pomocí CF-H nebylo významné. Také ledvinový index modelové skupiny byl významně nižší než u kontrolní skupiny (obr. 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>
CF zlepšila funkci ledvin, oxidační stres a hladiny zánětu u myší SAMP8
Kromě toho byly testovány ukazatele renálních funkcí každé skupiny myší, které zahrnovaly objem moči u myší po dobu 12 hodin, hladiny Cr a dusíku močoviny v séru a hladiny bílkovin v moči. Jak je znázorněno na obr. 2a-d, hladiny proteinu v moči, sérového Cr a sérového dusíku močoviny u modelové skupiny byly významně vyšší než u kontrolní skupiny (obr. 2a, P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche džingischánDále bylo zkoumáno, zda CF příznivě moduluje oxidační stres a zánět v ledvinách rychle stárnoucích myší. Jak je znázorněno na obr. 2e-h, hladiny SOD a GSH-Pxin v ledvinách u skupiny M byly významně nižší než u skupiny Con a hladiny IL-1 byly významně vyšší než u skupina Con. Po léčbě CF došlo ke zlepšení výše uvedených ukazatelů, zejména zlepšení efektu CF-L a CF-M je lepší.
CF aktivovala dráhu Nrf2 v ledvinách myší SAMP8
Hladina exprese p-Nrf2 byla měřena v ledvinových tkáních, aby se zjistilo, zda se dráha Nrf2 podílela na ochranném účinku CF (obr. 3a-c) v této studii. Hladina exprese p-Nrf2 se významně snížila ve skupině samotné SAMP8 (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">
CF zeslabila aktivaci signalizace Wnt/-catenin/RAS v ledvinách myší SAMP8
Abychom dále prozkoumali potenciální mechanismus CF s antifibrózou. Lokalizace proteinu byla provedena pomocí imunohistochemie. Jak je znázorněno na obr. 4a, úroveň exprese Wnt4 a
-catenin byl indukován převážně v renálních tubulárních buňkách. Podobné výsledky byly pozorovány, když byly hodnoceny AGTR1, cíle downstream dráhy signalizace Wnt (obr. 4a). Poté byla kvantifikována hladina proteinové exprese a výsledky ukázaly, že proteiny Wnt4, -catenin, renin a AGTR1 byly akumulovány v ledvinové tkáni myší v modelové skupině, zatímco CF tyto změny významně inhibovala (obr. 4b-f ). Dále byla také lokalizována a kvantitativně analyzována hladina exprese CTGF. V souladu s výše uvedenými výsledky byl CTGF exprimován hlavně v renálních tubulech a CF výrazně inhibovala aktivitu CTGF (obr. 4d g).
CF a jeho sloučeniny inhibovaly stárnutí buněk NRK-52E vyvolané D-gal
D-gal indukované NRK-52E buňky byly použity ke screeningu určitých aktivních složek v CF, aby se určil materiálový základ pro léčbu senilních ledvin extraktem z CF. Výsledky ukázaly, že CF zvýšila životaschopnost buněk v závislosti na dávce a sloučeninách
SDC-0-14,16 a SDC-1-8 izolované z CF měly lepší účinky na buněčnou proliferaci. Kromě toho, 25 ug/ml CF a sloučeniny SDC-0-14,16 a SDC-1-8 všechny vykazovaly účinek inhibice -galaktosidázové aktivity (obr. 5).
Analýza PCA ledvinové tkáně u myší SAMP8 se zlepšenou CF Byla provedena analýza hlavních složek (PCA), aby se prozkoumaly účinky CF na myši SAMP8. Jak ukazuje obr. 6a, mezi kontrolní a modelovou skupinou bylo zřejmé seskupení (R2X=0.542; Q2=0.38), což naznačuje, že endogenní metabolity myší SAMP8 byly odlišné od SAMR1 myši, což způsobuje, že se odchylují od skupiny SAMR1. Jak je znázorněno na obr. 6b, různé skupiny CF se také seskupily do různých tříd z kontrolní a modelové skupiny a skupiny CF se posunuly blíže ke kontrolní skupině, což naznačuje, že
endogenní metabolity myší SAMP8 intervenovaných CF byly podobné metabolitům myší SAMR1.
Diskuse
V progresi CKD hraje důležitou roli stárnutí [19]. Jak fibróza CKD postupuje, senescentní buňky exprimují a vylučují profibrotické faktory (TGF-, CTGF atd.) a prozánětlivé faktory (IL-1, IL-6, TNF- atd. ), což jsou faktory sekrečního fenotypu spojené se stárnutím, a tím urychlují renální fibrózu [20, 21]. V současné době dosahuje tradiční čínská medicína dobrých výsledků v léčbě renální fibrózy s menším počtem nežádoucích účinků [22]. Tato studie zkoumala intervenční účinky extraktu CF na renální fibrózu u myší SAMP8. Myší kmen vybraný pro tuto studii byl SAMP8, který byl vyvinut na základě délky života, stárnutí a skóre patologického fenotypového gradingu AKR/ myší a byl modelem zrychleného stárnutí výhradně genetického původu [23,24]. Studie ukázaly, že změny v renální patologii myší SAMP8 (9 měsíců) zahrnují tubulointersticiální fibrózu a fokální segmentální glomerulosklerózu [25]. Bylo zjištěno, že renální fibróza u myší SAMP8 souvisela s věkem [6]. Proto jsme testovali aktivitu -galaktosidázy a
úroveň renální fibrózy u myší SAMP8 a zjistili, že CF-L a CF-M zlepšily fibrózu ledvin a aktivitu -galaktosidázy u myší SAMP8 (obr. 1). A také jsme testovali výdej moči myší. V souladu s dříve publikovanými studiemi, které naznačovaly, že CF získaná dvěma různými procesy měla diuretické účinky [13], extrakt významně zvýšil objem moči myší SAMP8. Tato studie také ukázala, že suplementace CF zlepšila renální funkci, aktivitu antioxidačních enzymů a hladiny zánětlivých faktorů u myší SAMP8 (obr. 2).
Systém Keap1-Nrf2 si v posledních letech získal pozornost mnoha vědců díky svým antioxidačním a protizánětlivým vlastnostem. Jeho farmakologický potenciál v léčbě onemocnění ledvin byl rozsáhle studován v neklinických a klinických studiích [26]. Nrf2 je hlavní transkripční regulátor pro geny související s redoxním stavem a antioxidačními účinky [27]. Studie ukázaly, že pro aktivaci Nrf2 a indukci cílového genu je nutná fosforylace [28]. Aktivace Nrf2 zlepšila progresi CKD prevencí oxidačního stresu a udržením buněčné redoxní homeostázy [29]. Jako klíčový transkripční faktor hraje Nrf2 klíčovou roli v obraně proti oxidativnímu stresu regulací jeho downstream antioxidantů a detoxikačních enzymů [30]. Kim a kol. uvedli, že resveratrol jako silný aktivátor Nrf2 zmírnil progresivní poškození ledvin související se stárnutím [31]. V této studii zlepšil CF útlum Nrf2 v ledvinách myší SAMP8 bez ovlivnění úrovně exprese Keapl, což naznačuje, že surový extrakt CF by mohl zlepšit oxidační poškození v ledvinách aktivací dráhy Nrf2 (obr. 3).
Renální fibróza je charakterizována nadměrným ukládáním extracelulární matrix (ECM), což vede k tvorbě jizev v renálním parenchymu [32]. Transformující růstový faktor- (TGF-) je považován za klíčový cytokin při nadměrné aktivaci fibroblastů [33, 34]. Zacílení pouze na signální dráhu TGF samozřejmě nestačí ke snížení renální fibrózy. Některé studie ukázaly, že CTGF, Wnt/-catenin, renin-angiotensinový systém, oxidační stres atd. se podílejí na renální fibróze [35-37]. Wnt/-catenin je evolučně konzervovaná signální dráha zapojená do regulace tkáňové homeostázy, vývoje orgánů a opravy poranění[38]. Cisternas a kol. diskutovali o profibrotickém účinku Wnt signalizace v kosterním svalu i ledvinách [39]. Přibývající důkazy prokázaly, že signální dráha Wnt/-catenin hraje klíčovou roli v regulaci rozvoje a progrese renálních fibrotických lézí po poranění [40-42]. Signál Wnt/-catenin je v ledvinách zdravých dospělých relativně tichý a aktivuje se, jakmile jsou ledviny vystaveny různým druhům poškození [43].
U savců má rodina Wnt alespoň 19 členů rodiny, kteří jsou kritickí pro vývoj ledvin. A nejméně 15 z těchto členů rodiny je ve stárnoucích ledvinách diferencovaně upregulováno, včetně Wnt4 [6]. Výsledky této studie ukázaly, že hladina exprese proteinu Wnt4 v ledvinách myší SAMP8 byla významně vyšší než u myší SAMR1, což bylo ověřeno jak Western blotem, tak imunohistochemickými analýzami (obr. 4a, d, af). Shodou okolností byla hladina exprese proteinu -catenin také zvýšena. Také Wnt4 a -catenin byly exprimovány v renálních tubulárních epiteliálních buňkách, jak ukázala imunohistochemická analýza (obr. 4a a f). Wnt/-catenin vyvolal renální fibrózu indukcí více fibrogenních genů, jako jsou složky RAS, matrix metaloproteináza-7 (MMP-7), inhibitor aktivátoru plazminogenu 1 (PAI-1) a hlemýžď [37 ]. Zhou a kol. popsali Wnt/-catenin jako hlavní upstream regulátor, který řídí expresi všech testovaných složek RAS v ledvinách [44]. Zhou et al. použili krysí model 5/6 nefrektomie (5/6 NX), aby ukázali úrovně exprese hlavních složek RAS v mozku a ledvinách, jako je angiotenzinogen, angiotenzin-konvertující enzym a angiotenzin II AT{{25 }}receptor byl významně upregulován. Zvýšená hladina exprese byla inhibována centrálním blokátorem Wnt, což byl adeno-asociovaný virový vektor nadměrně exprimující gen DKK1 [45]. Podobně tato studie zjistila, že AGTR1 byl stále exprimován v renálním tubulárním epitelu a hladiny exprese reninu a AGTRl v ledvinových tkáních myší SAMP8 byly významně vyšší než u myší SAMR1 (obr. 4a a dg). Tyto výsledky ukázaly, že signální dráha Wnt/-catenin/RAS byla aktivována v ledvinách myší SAMP8 a CF účinně inhibovala aktivaci této dráhy.
CTGF vykonává mnoho biologických funkcí, včetně podpory mitózy chemotaktických buněk, indukce adheze a podpory buněčné proliferace a syntézy ECM [35,46]. CCN2(CTGF) moduloval Wnt signalizaci vazbou na protein 5/6 související s lipoproteinovým receptorem s nízkou hustotou (LRP5/6), aby dále zprostředkovával fibrózu [39, 47]. Jiné studie použily umlčení genu k objevení a potvrzení, že Nrf2 reguluje Wnt dráhu regulací hladiny exprese CTGF, což ovlivňuje renální intersticiální onemocnění. Nrf2 také reguloval hladinu transkripce CTGF především prostřednictvím regulátoru transkripce CTGF c-Fos [48]. Imunohistochemická analýza odhalila, že CTGF a pc-Fos byly exprimovány hlavně v renálních tubulárních epiteliálních buňkách a pc-Fos byly také distribuovány v glomerulech. Kvantitativní analýza ukázala, že hladiny exprese obou proteinů byly inhibovány CF (obr. 3b a ea 4a a c). Nakonec byla analýza PCA použita k dalšímu ověření, že CF zlepšila poškození ledvin u myší SAMP8 (obr. 6). Tato studie poskytla důkaz, že CF nejen aktivovala signalizaci Nrf2, ale také spoléhala na Nrf2, aby vyrovnala oxidační stres a zánět, inhibovala signalizaci Wnt/-catenin/RAS a zlepšila stárnutí ledvin a renální fibrogenezi. V tomto experimentu jsme však také zjistili nekonzistentní zlepšení účinku CF na barvení podle Massona a SA{27}}gal. Spekuluje se, že to může být způsobeno nekonzistentní progresí renálního stárnutí a renální fibrózy u myší SAMP8. Stupeň stárnutí ledvin u myší v tomto experimentu může být závažnější než fibróza. Proto zlepšující účinek CF-H na stárnutí ledvin u myší SAMP8 nebyl tak zřejmý jako u renální fibrózy.
Jako redukující monosacharid je D-galaktóza široce používána u různých onemocnění souvisejících s věkem in vivo a in vitro. Bylo zjištěno, že D-gal způsobuje senescenci a poškození v NRK-52E buňkách [49], indukuje senescenci buněk proximálního tubulárního epitelu lidské ledviny (HKC-8 buňky) a zvyšuje hladiny exprese dvou markerové proteiny fibrózy FN a a-SMA [6]. V této studii byl D-gal použit k indukci NRK-52E buněk in vitro. Pomocí testu MTT a barvení -galaktosidázou k detekci sloučenin izolovaných z CF bylo zjištěno, že SDC-0-14,16 a SDC{13}} zvýšily životaschopnost buněk indukovanou D-gal a inhibovaly D-gal indukovanou stárnutí buněk (obr. 5). Ty naznačovaly, že SDC-0-14,16 a SDC-1-8 mohou být materiálním základem pro CF k oddálení stárnutí ledvin. SDC-1-8 je jedním z fenylethanoidových glykosidů. Bylo zjištěno, že fenylethanoidní glykosidy prodlužují životnost Caenorhabditis Elegans [50] s účinky proti stárnutí [51] a neuroprotektivními účinky [52-54]. Ty poskytují směr naší následné studii o farmakologických účincích CF.
Závěry
Závěrem lze říci, že studie in vivo ukázaly, že CF redukovala renální fibrózu u starších myší. Některé potenciální aktivní složky byly nalezeny in vitro experimenty. Tato zjištění poskytla farmakologickou podporu pro léčbu onemocnění ledvin pomocí CF a směr pro další výzkum aktivních složek CF.
Tento článek je převzat z Cao et al. BMC Complementary Medicine and Therapes (2022) 22:52