Role renálních makrofágů, AIM a exprese TGF-b1 v progresi renální fibrózy u pacientů s IgAN

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Objektivní: Analyzovat expresi makrofágů, AlM a TGF- 1 v ledvinách pacientů s lgAN a prozkoumat roli makrofágů, AlM a TGF- 1 v progresi renální fibrózy u pacientů s lgAN .

Metody: Jako pozorovací skupina byly vybrány parafínové vzorky renální tkáně od 40 pacientů s lgAN. Současně byly jako normální kontrolní skupina vybrány parafínové vzorky normální renální tkáně od 11 pacientů léčených nefrektomií. Sledovali jsme distribuci makrofágů a expresi AlM a TGF- 1 imunohistochemickým barvením a/nebo imunofluorescencí.

Výsledek: Bylo zjištěno, že u pacientů s lgAN se zvýšil počet makrofágů MO, M1 a M2. Makrofágy M0 jsou převážně polarizované směrem k makrofágům M2. Exprese AlM a TGF- 1 byla významně vyšší u pacientů s lgAN než u NC. Makrofág M2, AlM a TGF- 1 pozitivně korelovaly se sérovým kreatininem a 24-hodinovou proteinurií, ale negativně korelovaly s eGFR. Makrofágy M2, AlM a TGF- 1 pozitivně korelovaly s fibrotickou oblastí.

Závěr: Makrofágy M2, AlM a TGF- 1 hrají důležitou roli v procesu fibrózy lgAN a tyto tři se vzájemně ovlivňují.

Klíčová slova: IgAN, renální fibróza, makrofágy, AlM, TGF- 1

Poznejte cistanche kde koupit a účinek cistanche podle odkazu 

ÚVOD

IgA nefropatie (IgAN) je běžná systémová imunitní glomerulonefritida, která je charakterizována ukládáním imunitních komplexů na bázi IgA nebo IgA v mezangiální oblasti s proliferací mezangiálních buněk a expanzí mezangiální matrix(1,2). Přestože IgAN postupuje pomalu, až u 50 procent pacientů se vyvine do konečného stadia a je to hlavní typ, který způsobuje ESRD(3).Renální fibrózaje běžnou cestou v progresichronické onemocnění ledvin(CKD) (4). V posledních letech bylo zjištěno, že makrofágy, inhibitor apoptózy makrofágů (AIM) a transformující růstový faktor - 1 (TGF- 1), všechny hrají důležitou roli v renální fibróze.

Makrofágy se podílejí na vzniku mnoha onemocnění ledvin. Někteří vědci se domnívají, že ukládání makrofágů v ledvinách může být použito jako důležitý ukazatel pro posouzení vývoje a prognózy onemocnění ledvin. Makrofágy se dělí na typy M0, M1 a M2(5). Makrofágy Ml podporují zánětlivou odpověď typu a odstraňují bakterie nebo nádorové buňky sekrecí zánětlivých faktorů, jako jsou IL-1, IL-6, IL-12, TNF-, reaktivní formy kyslíku (ROS), a žádná. Pokud však zánět přetrvává, bude se dále šířit a nakonec povede k tkáňové fibróze (6). Expresí arginázy 1 (Argl), proteinu podobného chitináze 3 (Yml) a mitogenního faktoru indukovaného hypoxií (HIMF), aby odolávaly stimulaci patogenních mikroorganismů a alergenů, makrofágy M2 omezují zánětlivou odpověď a adaptivní typ I.imunitaeliminují rezidua, podporují angiogenezi, hrají protizánětlivou roli, snižují buněčnou apoptózu, podporují buněčnou proliferaci a podporují opravu tkání (7,8). Jaký typ makrofágů hraje hlavní roli v renální fibróze IgAN, je stále kontroverzní . Studie ukázaly, že CD68 a CD80 mohou být použity jako specifické povrchové markery makrofágů MO a M1(9); CD163 je vysoce specifický manózový receptor exprimovaný v makrofázích M2, který není exprimován v makrofázích M1. CD68, CD80 a CD163 tedy mohou být použity jako markery k reprezentaci přítomnosti různých typů makrofágů (10-12).

Navíc byl AIM původně objeven jako secernovaný protein makrofágů, a proto byl pojmenován Spa(13). Později byl pojmenován AIM po zjištění jeho antiapoptotického účinku na bílé krvinky(14), nebo CD5L podle nomenklatury organizace lidského genomu. AIM má širokou škálu funkcí a hraje důležitou roli v regulaci migrační rovnováhy leukocytů, metabolismu azánětlivéOdezva. Mnoho druhů literatury uvádí, že AIM hraje roli v imunitní-zánětlivé odpovědi(15), lipidové homeostáze, nealkoholickémnemoc jater(16), autoimunitní onemocnění, ateroskleróza(17) a další onemocnění. V posledních letech byla provedena řada studií o úloze AIM při onemocnění ledvin. Například Tadashi Uramat a kol. (18) zjistili na modelu hypertenzní náchylné myši, že snížení exprese AIM a oxLDL (oxidovaný lipoprotein s nízkou hustotou, který má vliv na upregulaci exprese AIM) může účinně snížit fibrózu renální tkáně. Podobně Megumi Oshima et al. (19) zjistili, že oblast AIM a ukládání makrofágů v renální tkáni pozitivně koreluje se závažností proteinurie a poklesem eGFR u pacientů s CKD. Všechny výše uvedené studie naznačují, že AIM hraje také důležitou roli v procesu renální fibrózy. V současnosti však existují opačné výsledky: V modelu akutního poškození ledvin bylo zjištěno, že AIM může podporovat odstranění apoptotických buněčných zbytků renálními tubulárními epiteliálními buňkami (20).

V současnosti je mnoho studií rozpracováno o úloze makrofágů, AIM a TGF- 1 při onemocnění ledvin, ale existuje jen málo studií o úloze těchto tří v progresi IgAN, procesu fibrózy a korelaci mezi strom. Pokud se podaří objasnit patogenezi progrese IgAN fibrózy, může to otevřít nové okno pro léčbu a prognózu IgAN. Abychom prozkoumali roli makrofágů, AIM a TGF- 1 v progresi fibrózy IgAN, detekovali jsme infiltraci makrofágů v renálních tkáních pacientů s IgAN a úroveň exprese a charakteristiky AIM a TGF- 1 a poté analyzoval vztah mezi třemi a klinicky souvisejícími indikátory a oblastí renální fibrózy pacientů s IgAN.

METODY

Předměty

Čtyřicet pacientů s IgAN potvrzeným renální biopsií bylo přijato z nemocnice Subei People. Pacienti s chronickými systémovými onemocněními (systémový lupus erythematodes, diabetes mellitus, Henochova-Schönleinova purpura, jaterní cirhóza atd.) (léčba glukokortikoidy, imunosuprese, ACEI, ARB atd.), nebo s pokročilým selháním ledvin (odhadovaná rychlost glomerulární filtrace) eGFR) Méně než nebo rovné 15 ml/min/1,73 m2) byly vyloučeny. Hladiny eGFR byly vypočteny pomocí rovnice Modifikace diety při onemocnění ledvin (MDRD). Klinické informace (pohlaví, věk, hmotnost, historie onemocnění) a laboratorní údaje ( sérový albumin, sérový kreatinin, červené krvinky v moči, 24hodinový protein v moči a hladiny eGFR) byly odebrány v době biopsie. Od všech subjektů byl získán písemný informovaný souhlas a studie byla schválena etickou komisí nemocnice Subei People.

Imunofluorescenční a imunohistochemické barvení

Řezy lidské ledvinové tkáně byly analyzovány imunohistochemickým a imunofluorescenčním barvením. Massonovo barvení bylo provedeno na všech řezech lidské ledvinové tkáně. Řezy byly zbaveny parafinu a ošetřeny 3% oxidem vodíku. Po získání a zablokování antigenu byly řezy přes noc inkubovány s lidskou protilátkou CD68 (zředěnou 1:600, Abcam), lidskou protilátkou CD80 (zředěnou 1:600, Abcam), lidskou protilátkou CD163 (zředěnou 1:600, Abcam), lidskou AIM protilátka (zředěná 1:150, Abcam) nebo lidská protilátka TGF- 1 (zředěná 1:500, Abcam). Po ošetření sekundární protilátkou konjugovanou s biotinem značenou křenovou peroxidázou (zředěnou 1:200, Biosynthesis Biotechnology, Čína) a barvení DAB (ZSGB-Bio, Čína) byly řezy pozorovány pod mikroskopem. V každém řezu bylo zobrazeno 10 náhodně vybraných polí (400×). Exprese makrofágů v glomerulech a tubulech byla kvantifikována pomocí Image-Pro Plus Image Analysis Software (Meyer Instruments, Inc., Houston, TX, USA); exprese AIM a TGF- 1 v glomerulech byly kvantifikovány stejným způsobem. Integrovaná optická hustota (IOD) byla měřena pro každý snímek dvěma patologickými odborníky nezávisle. Poté byla vypočtena průměrná IOD/pozitivně obarvená plocha (AIOD). Hladiny exprese makrofágů, AIM a TGF- 1 v IgAN renálních biopsiích a normálních ledvinových biopsiích byly porovnány výpočtem AIOD. Jádra byla obarvena DAPI při teplotě místnosti po dobu 5 minut. Snímky fluorescenčně značených řezů byly získány pomocí fluorescenčního mikroskopu (ZEISS, Axioimager.Z2).

Massonovo barvení pro posouzení fibrózy

Oblast fibrózy byla zelená a vypočítali jsme procento zelené plochy v oblasti zorného pole, aby odráželo stupeň fibrózy. Pro každý řez byla náhodně vybrána tři pole s vysokým zvětšením (všechny vzorky byly vyfotografovány za stejných podmínek), aby se zabránilo velkým cévám. IPP6.0 systém analýzy obrazu byl použit ke statistické analýze poměru ploch oblasti fibrózy (všechny vzorky byly analyzovány stejným způsobem).

Statistické analýzy

Statistická analýza byla provedena pomocí SPSS 22.0. Data byla vyjádřena jako průměr ± SD nebo jako mediány (rozmezí). Významné rozdíly byly hodnoceny buď pomocí at-testu nebo jednocestné ANOVA. Pro porovnání integrované optické hustoty mezi experimentálními skupinami byl proveden neparametrický Mann-Whitney U test. Dvouocasý P<0.05 was="" considered="" statistically="">

VÝSLEDEK

Distribuce makrofágů v ledvinách Imunofluorescence a imunohistochemie (obrázky 1,2) ukázaly, že makrofágy ve skupině IgAN byly distribuovány hlavně v renálním tubulárním intersticiálním a příležitostně v glomerulárním kapilárním plexu a renálním tubulárním lumen, zatímco makrofágy nebyly distribuovány v normálním ledvinové tkáně.

Navíc počet makrofágů M{{0}}, Ml a M2 v renálním intersticiu IgAN byl odlišný a došlo k větší polarizaci M0 směrem k M2(P<0.05, figure="">

Exprese AIM, TGF- 1 v renální tkáni Ve skupině IgAN je AIM exprimován hlavně v glomerulárních kapilárních kličkách a renálních tubulárních epiteliálních buňkách, stejně jako v lumenu ledvinných tubulů; TGF- 1 je exprimován hlavně v renálních tubulárních epiteliálních buňkách, ale také v renálním intersticiu. Exprese AIM a TGF- 1 však byla v normálních renálních tkáních vzácná nebo chyběla (obrázky 4,5).

Exprese makrofágů, AlM, TGF- 1 s klinickým projevem lgAN

The infiltration of MO and M1 macrophages in the renal tissue of the IgAN group was not significantly correlated with age, sex, urinary red blood cell count,24-hour proteinuria, and eGFR (P>{{0}}.05). Počet infiltrací makrofágů M2 pozitivně koreloval se sérovým kreatininem a 24-hodinovou proteinurií (r=0.447, P=0.004; r=0.436, P{ {10}}.005) a negativně koreluje s eGFR(r=-0.332, P=0.004)(obrázek 6).24-hodinový protein v moči, sérový kreatinin a eGFR korelovaly s AIM a TGF- 1, mezi nimiž 24-hodinový močový protein a sérový kreatinin pozitivně korelovaly s AIM a TGF- 1, zatímco eGFR negativně korelovaly s AIM a TGF-B1 (Stůl 1). Protože neexistovala žádná významná korelace mezi makrofágy M0 a M1 a klinickými indikátory, následná data počítala pouze makrofágy M2. Další statistická analýza ukázala, že exprese makrofágů M2, AIM a TGF-B1 byly různé u různých patologických typů a existovala korelace mezi makrofágy M2, AIM a TGF- 1 (tabulka 2).

Korelace makrofágů M2, AlM, TGF- 1 a fibrotické oblasti

Statistická analýza korelace mezi fibrotickou oblastí a makrofágy typu M, AIM a TGF- 1 ve tkáních pacientů s IgAN ukázala, že makrofágy M2 pozitivně korelovaly s fibrotickou oblastí (obrázek 7,r{ {4}}.777, P<0.01);aim was="" positively="" correlated="" with="" the="" fibrotic="" area(figure="" 8,r="0.768,"><0.01); tgf-β1="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" fibrotic="" area="" (figure="" 9,="" r="0.853,"><>

DISKUSE

IgAN je nejčastější primární glomerulonefritida a přibližně u 40 procent pacientů se rozvine konečné stadium renálního onemocnění (ESRD) do 20-30 let (21). Renální fibróza je nezbytným procesem, aby se všechny CKD rozvinuly do ESRD. Patologickými projevy je tvorba velkého počtu fibroblastů a myofibroblastů a akumulace velkého počtu extracelulární matrix, vedoucí ke glomeruloskleróze a renální tubulární intersticiální fibróze. V konečném důsledku dochází ke ztrátě funkce ledvin v důsledku ztráty velkého počtu normálních nefronů(4). V současnosti se renální fibróza dělí především do čtyř stádií:1. Aktivace renálních tubulárních epiteliálních buněk a infiltrace monocytů/makrofágů v důsledku zánětu. 2.Uvolňování cytokinů, růstových faktorů a dalších profibrogenních faktorů.3. Vznik fibrózy se projevuje především ukládáním matricových proteinů. 4. Ukládání extracelulární matrix (ECM) je hlavním stádiem strukturálního a funkčního poškození ledviny (významné snížení účinných nefronů a další pokles rychlosti glomerulární filtrace).

Myeloidní kmenové buňky se diferencují na monocyty a vstupují do oběhu z kostní dřeně. Monocyty v oběhu migrují a infiltrují do tkání pod různými podněty, jako je zánět a trauma, a poté se diferencují na makrofágy. Makrofágy jsou heterogenní buňky v přirozeném imunitním systému, které mohou dynamicky regulovat své fenotypy, aby se přizpůsobily místnímu mikroprostředí. Monocyty v oběhu, poháněné zánětlivými signály, vstupují do ledvin a připojují se k vaskulárním endoteliálním buňkám, čímž současně indukují uvolňování chemokinů a chronických zánětlivých faktorů. To má za následek rozsáhlou lokální agregaci monocytů v renálním intersticiálu, které se různými cestami diferencují na klasicky aktivované makrofágy (M1) nebo selektivně aktivované makrofágy (M2). Nejprve patogeny a nekrotické buňky aktivují Toll-like receptory a další vrozené imunitní receptory, čímž podporují polarizaci M0 makrofágů na M1 makrofágy. Makrofágy M1 se ukládají přes bazální membránu v časném stadiu poškození ledvin, což podporuje řadu zánětlivých reakcí a vede k dalšímu poškození ledvin. S rozvojem poškození podporují apoptotické a nekrotické buňky fagocytované makrofágy, stejně jako následná generace protizánětlivých faktorů, polarizaci makrofágů směrem k makrofágům M2. Makrofágy M2 hrají hlavně protizánětlivou roli, podporují opravu ledvin a způsobují fibrózu(6,22-26). Dynamická rovnováha makrofágů M1 a M2 tedy ukazuje na proces zánětu a reparace tkáně, který určuje prognózu ledvin a pohání úsilí k terapiím cíleným na makrofágy.

V této studii jsme vybrali renální patologické tkáně pacientů, u kterých byl diagnostikován IgAN, a pozorovali jsme polarizaci různých makrofágů. Vybrali jsme CD68 pro reprezentaci M0, CD80 pro reprezentaci M1 a CD163 pro reprezentaci M2. Naše výsledky ukázaly, že počet M0(CD68*)makrofágů, M1(CD80*)makrofágů a M2(CD163*)makrofágů byl v tomto pořadí významně zvýšen ve srovnání s normální ledvinou, což naznačuje, že došlo k relativně zřejmé infiltraci makrofágů v ledvinové tkáně pacientů s lgAN.

It was not only found that the infiltration of macrophages in the renal tissue of IgAN patients increased significantly, but also found that there were differences in the number of M0, Ml, and M2 macrophages in the interstitium of lgAN patients, with more polarization of M0 towards M2. In other words, the infiltration of M2 macrophages is mainly found in the renal tissue of IgAN patients. There was a positive correlation between M2 macrophages and fibrotic area; The distribution of M0 and M1 macrophages in the lgAN group had no significant correlation with age, sex, urinary red blood cell count, 24-hour proteinuria, and eGFR(P>0.05); Počet infiltrací makrofágy M2 však pozitivně koreluje se sérovým kreatininem a 24-hodinovou proteinurií; Je prokázáno, že M2 makrofágy hrají důležitější roli v progresi IgAN fibrózy.

AIM hraje důležitou roli i u mnoha onemocnění, jako je ateroskleróza, nealkoholické onemocnění jater(16), inzulinová rezistence (27), autoimunitní onemocnění aj. AIM přitom úzce souvisí s renální fibrózou. Megumi Oshima et al.(19) odebrali renální tkáň od 43 pacientů s renální biopsií a zjistili, že oblast ukládání AIM a makrofágů pozitivně koreluje se závažností proteinurie a poklesem eGFR u pacientů. To naznačuje, že AIM může zhoršit poškození ledvin. Tadashi Uramat et al.(18) stanovili závažnou hypertenzi a indukovali poškození ledvin pomocí modelu spontánní hypertenzní tendence (SHRsp) u myší. Po léčbě hypertenze příbuznými léky bylo zjištěno, že se výrazně snížil počet makrofágů infiltrujících glomeruly a intersticium. Ve srovnání s kontrolní skupinou byly exprese AIM a oxLDL významně sníženy. Kromě toho byl stupeň fibrózy v renální tkáni nižší než u neléčené skupiny.

V naší studii byly signifikantní rozdíly v expresi AIM v každém patologickém stupni a jeho exprese významně pozitivně korelovala s M2 makrofágy, TGF- 1 a stupněm renální fibrózy. Tento experiment a výše uvedené podmínky naznačují, že AIM souvisí s procesem renální fibrózy CKD, což může souviset s antiapoptickým účinkem AIM na makrofágy, a pak kontinuální zánětlivé signály podporují další rozvoj fibrózy. Takako Tomita et al.(28) extrahovali nekrotické buňky z myší s peritonitidou vyvolanou kvasinkovými polysacharidy in vitro a zjistili, že AIM může podporovat fagocytózu makrofágů Ml a M2a na nekrotické buňky. V modelu IgAN a modelu akutního renálního poškození ischemie-reperfuze (IRI) bylo také zjištěno, že AIM může podporovat clearance IgAl a apoptotických buněk způsobujících nefritidu makrofágy. Z výše uvedených studií je zjištěno, že AIM, stejně jako makrofágy, může hrát různé role v různých stádiích onemocnění, zatímco role AIM u onemocnění ledvin může být podobná jako u makrofágů.

V modelu CKD způsobeného IRI makrofágy M2 úzce korelují s procesem renální fibrózy, který je způsoben hlavně sekrecí TGF- 1 (29). TGF- 1 patří do superrodiny TGF a hraje důležitou roli ve vývoji CKD(30). Transdiferenciace tubulárních epiteliálních myofibroblastů (TEMT) je také důležitým mechanismem renální intersticiální fibrózy a TGF- 1 je důležitým cytokinem regulujícím TEMT (31). Použitím TGF- 1 neutralizačních protilátek, inhibitorů, genového knockoutu a dalších metod konzumace TGF- 1 lze účinně snížit stupeň renální fibrózy (32). Doposud mechanismy TGF- 1 způsobující renální fibrózu zahrnují především následující body: 1. Vyvolat syntézu extracelulární matrix, jako je kolagen I a fibronektin(33). 2. Matrixová metaloproteináza (MMP) a tkáňový inhibitor metaloproteinázy (TIMP) nejsou v rovnováze, a tak snižují degradaci extracelulární matrix.3. Podporují proliferaci mezangiálních buněk a sekreci kolagenu a způsobují poškození epiteliálních a podocytových buněk, čímž podporují zánět a další tkáňovou fibrózu (34).4. Podporovat transdiferenciaci a proliferaci myofibroblastů z různých zdrojů (jako jsou pericyty, epiteliální buňky, endoteliální buňky, fibroblasty, makrofágy atd.), a tím zprostředkovávat rozvoj fibrózy(35). Předchozí studie pozorovaly, že exprese mRNA a proteinu TGF-B1 v IgAN a stupeň infiltrace makrofágů M2 v renální tkáni byly významně zvýšeny ve srovnání s normální renální tkání(31), TGF- 1 byl koexprimován s makrofágy M2 ve tkáni renální biopsie hypertenze indukované CKD. To vše naznačuje, že makrofágy M2 mohou hrát roli v renální fibróze prostřednictvím TGF- 1.

V tomto experimentu jsme zjistili, že se zvyšujícím se patologickým stupněm rostla také infiltrace makrofágů M2 a stupeň exprese AIM a TGF- 1. Mezi různými patologickými skupinami byl významný rozdíl. Všechny tři úzce souvisely s 24-hodinovým proteinem v moči, sérovým kreatininem, eGFR a dalšími klinickými ukazateli pacientů s IgAN a mezi těmito třemi a oblastí renální fibrózy byla signifikantní pozitivní korelace, což naznačuje, že M2 makrofágy, AIM a TGF-B1 se všechny podílely na výskytu a vývoji IgAN a úzce souvisely s procesem fibrózy IgAN. Výsledky tohoto experimentu byly v souladu se studií Braga et al. (36,37), kteří zjistili, že makrofágy M2 se podílejí na renální fibróze unilaterální ureterální obstrukce (UUO) v signální dráze MyD88. Naproti tomu studie zjistily, že makrofágy hrají antihrdinskou roli ve fázi zotavení obstrukční nefropatie. Nishida a kol. (38) prokázali, že receptor angiotenzinu II typu 1 (Agtr1) na intersticiálních makrofázích funguje tak, že snižuje renální fibrózu v pozdější fázi UUO. Lopez-Guisa et al.(39) potvrdili, že makrofágy vykazují úlohu tlumící fibrózu prostřednictvím aktivace dráhy přeměny lysozomálního kolagenu expresí manózového receptoru 2 (Mrc2) v UUO.

Makrofágy M2, AIM a TGF- 1 hrají důležitou roli v procesu fibrózy IgAN a tyto tři se vzájemně ovlivňují. Vzhledem k malé velikosti vzorku tohoto experimentu a mechanismu interakce a vztahu mezi těmito třemi bude však zapotřebí další ověření příslušných experimentů na zvířatech.