Čtečka RNA M6 A YTHDF2 kontroluje NK buněčnou protinádorovou a antivirovou imunitu, část 6

Model metastatického melanomu a provokace MCMV

Buňky B16F10 (105) byly iv injikovány myším. 14 dní po injekci byly myši usmrceny pro postmortální analýzu. Metastatické uzliny v plicích byly analyzovány makroskopicky a spočítány. Buněčná linie B16F10 byla poskytnuta Hua Yu (City ofHope, Los Angeles, CA). Myši Ythdf2ANK a Ythdf2WT byly infikovány ip injekcí kmene Smith MCMV (2,5 x 104 PFU), který byl zakoupen od American Type Culture Collection (VR-1399). Vzorky periferní krve byly získány submandibulární punkcí ve dnech 0, 4 a 7 po infekci.

Uzly plicních metastáz se týkají uzlů tvořených maligními nádorovými buňkami z jiných míst, které migrují do plic krevním nebo lymfatickým systémem. U mnoha pacientů jde o běžný projev rakoviny plic.

Ačkoli však uzliny s metastázami v plicích představují hrozbu pro fyzické zdraví pacientů, neexistuje žádný přímý vztah mezi nimi a pamětí. Proto bychom měli aktivně čelit výzvám rakoviny plic a plicních metastáz a nenechat negativní emoce a úzkost ovlivnit naše fyzické a duševní zdraví.

Zároveň si pomocí některých pozitivních metod můžeme paměť udržovat a zlepšovat. Proveďte například nějaký trénink paměti, jako jsou matematické výpočty, čtení, poslech hudby, hraní her atd. Kromě toho může také dodržování správných životních návyků, jako je pravidelné cvičení, dostatek spánku, zdravé stravování atd. zlepšit naši paměť.

Nejdůležitější je udržet si pozitivní přístup. Bez ohledu na to, jakým potížím čelíte, musíte věřit ve svou sílu a flexibilitu svého nervového systému a prostřednictvím pozitivních úprav a reakcí nakonec obtíže úspěšně překonáte.

Stručně řečeno, ačkoli metastatické uzliny v plicích představují hrozbu pro fyzické zdraví, nemají přímou souvislost s pamětí. Měli bychom tomu čelit pozitivně a udržovat a zlepšovat si paměť úpravou životního stylu a udržováním dobrého přístupu. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche deserticola dokáže výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola dokáže regulovat i rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů. Tyto látky jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může Cistanche deserticola také zlepšit průtok krve a podpořit dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek dostává dostatek živin a energie, a tím zlepšuje mozkovou vitalitu a vytrvalost. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche deserticola dokáže výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola dokáže regulovat i rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů. Tyto látky jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může Cistanche deserticola také zlepšit průtok krve a podpořit dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek dostává dostatek živin a energie, a tím zlepšuje mozkovou vitalitu a vytrvalost.

Klikněte na vědět doplňky pro posílení paměti

Pro měření virové zátěže v periferní krvi, slezině a játrech byla DNA izolována pomocí QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit pro analýzu qPCR. Byly použity následující primery: MCMV-IE1,59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (vpřed) a MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (reverzní).

Léčba myší in vivo pomocí IL-15

Pro in vivo léčbu myší pomocí IL-15 byly myši Ythdf2ANK a Ythdf2WT injikovány 2 ug ip rekombinantního lidského IL-15 (kat. č. 745101; National Cancer Institute) po dobu 5 dnů. Ošetřené a kontrolní myši byly poté usmrceny pro analýzu průtokovou cytometrií.

Průtoková cytometrie

Jednobuněčné suspenze byly připraveny z BM, krve, sleziny, jater a plic myší Ythdf2ANK a Ythdf2WT, jak bylo popsáno dříve (Wang et al., 2018b). Analýza průtokovou cytometrií a třídění buněk byly provedeny na LSRFortessa X-20 a FACSAriaFusion Flow Cytometer (BD Biosciences), v daném pořadí.

Data byla analyzována pomocí softwaru NovoExpress (Agilent Technologies).

Byly použity následující protilátky značené fluorescenčním barvivem od BD Biosciences, BioLegend, Invitrogen nebo Cell Signaling Technology: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ),TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7),CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70), CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1), KLRG1 (2F1), CD45 ({{46) }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), granzym B (QA16A02), perforin (S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226 (TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT (1G9), PD-1 (J43), annexin V, Ki67 (b56), Tbet (4b10) a Eomes (WD1928), fosfo-p44/42 Erkl/2 (Thr202/Tyr204, #9101), fosfo-Akt (Ser473, #5315), fosfo-S6 ribozomální protein ,fosfo-Stat3 (Tyr705, #9145) a fosfo-Stat5 (Tyr694, #9539).

Pro hodnocení proliferace NK buněk byly buňky před přenesením do recipientních myší označeny 5 uM CTV (Invitrogen) podle protokolu výrobce. Intracelulární barvení Ki67, Tbet a Eomes bylo provedeno fixací a permeabilizací pomocí Foxp3/Transcription Factor Stained Kit (eBioscience).

Pro detekci fosforylovaných proteinů byly purifikované slezinné NK buňky předem ošetřeny rekombinantním lidským IL-15 (50 ng/ml) po dobu 1 hodiny a poté fixovány Phosflow Fix Buffer I s následnou permeabilizací Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) a barvením protilátky.

Adoptivní přenos buněk

Pro posouzení vlivu deficitu Ythdf2 na zrání NK buněk byla směs 5 × 106 BM buněk v poměru 1:1 z myší CD45.1 nebo Ythdf2ANK CD45.2 kotransferována do myší Rag2-/-Il2rg-/-. Rekonstituce příjemců byla hodnocena průtokovou cytometrií 8 týdnů po transplantaci.

Pro experimenty s homeostatickou proliferací vyvolanou lymfopenií byl stejný počet vyčištěných slezinných NK buněk z myší CD45.1 nebo Ythdf2ANK CD45.2 společně přenesen do myší Rag2-/-Il2rg-/- s následným hodnocením relativních procent přenesených buněk WT a Ythdf2ANK NKens v slezinných buňkách příjemců Rag2−/−Il2rg−/− průtokovou cytometrií v uvedených časových bodech.

U modelu metastatického melanomu bylo 106 IL-2-expandovaných NK buněk z myší Ythdf2ΔNK nebo Ythdf2WT injikováno iv do myší Rag2−/−Il2rg−/−. O 1 den později byly B16F10 buňky (105) injikovány iv myším. 14 d po injekci byly myši usmrceny pro postmortální analýzu. V některých experimentech byly buňky značeny CTV (5 uM, Invitrogen), aby bylo možné sledovat buněčnou proliferaci před přenosem.

Test obchodování in vivo

Pro detekci přenosu NK buněk z BM do periferní krve byl 1 ug iv APC-značené anti-CD45 protilátky injikován do C57BL/6 myší. Dvě minuty po injekci protilátky byly myši okamžitě usmrceny a buňky BM byly shromážděny pro průtokovou cytometrii poté, co byly buňky obarveny protilátkami CD3 a NK1.1. Parenchymální NK buňky byly identifikovány nedostatkem barvení CD45, zatímco sinusové NK buňky byly identifikovány přítomností značení CD45. Poměr NK buněk v sinusoidách (CD45+) k NK buňkám v parenchymálních oblastech (CD45−) tedy ukazuje na přenos NK buněk z toperiferní krve BM v ustáleném stavu.

RT-qPCR v reálném čase a imunoblotování

RNA byla izolována pomocí RNeasy Mini Kit (QIAGEN) a poté reverzně transkribována na cDNA pomocí PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser (Takara Bio) podle instrukcí výrobce. Hladiny exprese mRNA byly analyzovány pomocí SYBRGreen PCR Master Mix a systému QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR (oba od Thermo Fisher Scientific). Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce S1.

Imunoblotování bylo prováděno podle standardních postupů, jak bylo popsáno dříve (Denget al., 2015; Yu et al., 2006). Byly použity následující protilátky: METTL3 (kat. č. 15073-1-AP; Proteintech), METTL14 (kat. č..26158-1-AP; Proteintech), YTHDF1 (kat. č. 17479-1-AP ; Proteintech), YTHDF2 (kat. č. RN123PW; MBL), YTHDF3 (kat. č..25537-1-AP; Proteintech), ALKBH5 (kat. č. ab195377; Abcam),FTO (kat. č. ab124892; Abcam), MDM2 (kat. č. 33-7100; Invitrogen), TDP-43 (kat. č. PA5-29949; Invitrogen) a -actin (kat. č. {{20 }}Ig; Proteintech).

siRNA knockdown test

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90 % měřeno průtokovou cytometrií. Účinnost geneknockdownu byla stanovena pomocí qPCR a imunoblotu. 3 dny po transfekci byla buněčná apoptóza a proliferace analyzovány průtokovou cytometrií, jak je popsáno výše.

Luciferázový reportérový test

Oblast promotoru Ythdf2 v rozsahu od –2,000 bp do +100 bpof TSS byla amplifikována z myších NK buněk a klonována do apGL4-Basic Luciferase Reporter Vector (Promega) za účelem generování apGL{ {5}}Reportérový plazmid Ythdf2. Buňky HEK293T zakoupené od ATCC byly kotransfekovány reportérovými plasmidy pGL4-Ythdf2 a také plasmidy s nadměrnou expresí STAT5a nebo STAT5b nebo anemptním vektorem, společně s reportérovým plazmidem pRL-TK Renilla (Promega) pro normalizaci účinnosti transfekce. Buňky byly sklizeny pro lýzu 24 hodin po transfekci a aktivita luciferázy byla kvantifikována fluorimetricky pomocí Dual-Luciferase System (Promega). Sekvence primerů pro klonování promotoru Ythdf2 a plasmidů s nadměrnou expresí STAT5a a STAT5b jsou uvedeny v tabulce SI.

ChIP testy

ChIP testy byly provedeny za použití Pierce Magnetic ChIP Kit (kat. č. 26157; Thermo Fisher Scientific) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, stejné množství ananti-anti-fosfo-Stat5 (Tyr694, kat. č. 9351; Cell Signaling Technologies) nebo odpovídající kontrolní normální králičí IgG bylo odděleně použito k vysrážení zesíťovaných komplexů DNA-protein odvozených z 5× 106 purifikovaných myších primárních NK buněk, které byly předem ošetřeny IL-15 (50 ng/ml) po dobu 1 hodiny. Po zrušení síťování byla DNA imunoprecipitovaná indikovanou protilátkou testována pomocí qPCR. Sekvence všech primerů jsou uvedeny v tabulce S1.

Ex vivo test cytotoxicity

Ex vivo cytotoxicita NK buněk byla hodnocena standardními testy 51Crrrelease. Jako cílové buňky byly použity buněčné linie myšího lymfomu RMA-S (MHC třída Ideficient) a RMA (MHC třída I dostačující), dar Andre´Veillette (McGill University, Montreal, Kanada). Myši byly ošetřeny ip injekcí polyinosin:polycytidylová kyselina [poly (I: C); 200 ug/myš] po dobu 18 hodin. Poly(I:C)-aktivované NK buňky byly izolovány ze sleziny pomocí EasySepMouse NK Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies). Purifikované NK buňky byly společně kultivovány s cílovými buňkami v poměru 5:1, 2,5:1 a 1,25:1 v přítomnosti IL-2 (50 U/ml).

m6A-sekv

Purifikované NK buňky sleziny byly expandovány pomocí IL-2 (1,000 U/ml, kat. č. Bulk Ro 23-6019; National Cancer Institute) in vitro po dobu 7 dnů. Celková RNA byla izolována reagencií TRIzol (Thermo FisherScientific) z 50 milionů IL-2-expandovaných NK buněk. Polyadenylovaná RNA byla dále obohacena z celkové RNA pomocí soupravy Dynabeads mRNA Purification Kit (Invitrogen). Vzorky mRNA byly fragmentovány na fragmenty dlouhé 100-nt pomocí činidel pro fragmentaci RNA (Invitrogen).

Fragmentovaná mRNA (5 ugmRNA) byla použita pro imunoprecipitaci m6A pomocí protilátky m6A (202003; Synaptic) podle standardního protokolu soupravy Magna MeRIP m6A Kit (Merck Millipore). RNA byla obohacena pomocí RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) pro generování knihovny pomocí KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche). Sekvenování bylo provedeno v genomickém zařízení City of Hope na stroji Illumina HiSeq 2500 s režimem jednoho čtení 50-bp. Sekvenační čtení byla mapována do myšího genomu pomocí softwaru HISAT2 v101 (Kim et al., 2015).

Mapované čtení imunoprecipitace a vstupní knihovny byly poskytnuty pomocí R balíčku exomePeak (Meng et al., 2014). m6Apeaks byly vizualizovány pomocí softwaru Integrative Genomics Viewer (http://www.igv.org). Motiv vázající m6A byl analyzován pomocí MEME (https://meme-suite.org) a HOMER (http://homer.ucsd.edu/homer/motif). Volané píky byly anotovány průnikem s genovou architekturou pomocí Rpackage ChIPseeker (Yu et al., 2015).

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2 (násobná změna)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP-seq

50 milionů IL-2-expandovaných NK buněk bylo sklizeno a dvakrát promyto studeným PBS a buněčná peleta byla lyžována 2 objemy lyzačního pufru (10 mM Hepes, pH 7,6, 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 0,5 mM dithiothreitol, 1:100 koktejl inhibitoru proteázy [Thermo Fisher Scientific] a 400 U/ml inhibitoru SUPERase-In RNase [Thermo Fisher Scientific]).

Lyzát byl inkubován na ledu po dobu 5 minut a centrifugován po dobu 15 minut, aby se lyzát vyčistil. Jedna desetina objemu buněčného lyzátu byla uložena jako vstup. Zbytek buněčného lyzátu byl inkubován s 5 ug anti-YTHDF2 (kat. č. RN123PW; MBL), který byl spojen s Protein A Magnetic Beads (kat. č. 10001D; Invitrogen) při 4 stupních po dobu 2 hodin s mírným otáčením. Poté byly kuličky pětkrát promyty 1 ml ledově chladného promývacího pufru (50 mM HEPES, pH 7,6, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,05 % NP-40, 0,5 mM dithiothreitolu a 200 U/ml RNázy inhibitor).

Imunoprecipitované vzorky byly podrobeny štěpení proteinázou K v promývacím pufru doplněném 1% SDS a 2 mg/ml proteinázy K (ThermoFisher Scientific) inkubovány za třepání při 1200 otáčkách za minutu při 55 stupních po dobu 1 hodiny. Celková RNA byla extrahována ze vstupní i imunoprecipitované RNA přidáním 5 obj. činidla TRIzol a následně Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research).

Knihovna cDNA byla vytvořena pomocí soupravy KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche) a sekvenována na platformě Illumina HiSeq 2500. Špičkové výsledky volání s imunoprecipitací a vstupními knihovnami byly generovány balíkem R RIPSeeker (Li et al., 2013). HOMER byl použit k nalezení motivů distribuce dat v oblastech píku. Nazývané píky byly anotovány průnikem s genovou a transkriptovou architekturou pomocí ChIPpeakAnno (Zhu et al., 2010).

test stability mRNA

Purifikované slezinné NK buňky z Ythdf2ANK a Ythdf2WT myší byly kultivovány s IL-15 (50 ng/ml). 3 dny po kultivaci byly buňky ošetřeny aktinomycinem D (5 ug/ml, kat. č. A9415; Sigma) po uvedenou dobu. Buňky bez ošetření byly použity v 0 h. Buňky byly odebrány v uvedeném čase a celková RNA byla extrahována z buněk pro qPCR. Poločas mRNA byl vypočítán pomocí metody dříve popsané Weng et al. (2018). Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce S1.

Online analýza databáze

K analýze tkáňově specifické exprese Ythdf2 jsme použili online zdroj BioGPS (http://biogps.org). Soubory RNA-seqdata byly od GEO pod přístupovými č. GSE106138, GSE113214 a GSE25672. Normalizovaná data z analýz RNA-seq byla exportována a z-skóre genové exprese bylo vizualizováno pomocí funkce Heatmap.2 v rámci knihovny gplots Rlibrary.

Statistika

Nepárové Studentovy t-testy (dvoustranné) byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism. Jednosměrná nebo dvoucestná ANOVA byla provedena, když byly porovnány tři nebo více nezávislých skupin. Hodnoty P byly upraveny pro vícenásobné srovnání za použití postupu Holm-S´ıdak. P < 0.05 bylo považováno za významné. *, P < {{10}}.05; **, P < 0,01; a***, P < 0,001.

Online doplňkový materiál

Obr. S1 ukazuje hladiny proteinu YTHDF2 v imunitních buňkách, včetně NK buněk v reakci na stimulaci IL-15, infekci MCMV a progresi nádoru; generování myší s NKcell-specifickou delecí Ythdf2. Obr. S2 ukazuje virové titry ve slezině a játrech od myší infikovaných MCMV a procento a absolutní počet Ly49H+ a/nebo Ly49D+ NK buněk u myší infikovaných MCMV. Obr. S3 ukazuje proliferaci, přežívání, zrání a expresi aktivačních a inhibičních receptorů NK buněk z myší Ythdf2WT a Ythdf2ANK. Obr. S4 ukazuje regulaci exprese YTHDF2 pomocí IL-15-STAT5 signalizace a expresi složek IL-15 receptorů, dráhy PI3K–AKT a dráhy MEK–ERK v buňkách NK z Ythdf2WT a Ythdf2ΔNK myši. Obr. S5 ukazuje testy RNA-seq, m6A-seq a RIP-seq pro celý stranscriptom v NK buňkách. Tabulka S1 uvádí primery použité ve studii.

Dostupnost dat

Data RNA-seq, m6A-seq a RIP-seq byla uložena v Národním centru pro biotechnologické informace GEO pod přírůstkovým číslem. GSE174027. Zbývající data, která podporují zjištění této studie, jsou na vyžádání k dispozici od příslušných autorů.

Poděkování

Tato práce byla podpořena National Institutes of Health (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458 a CA210087), Leukemia and Lymphoma Society ({1364-19), California Institute for Regenerative Medicine Institute for Regenerative Medicine Institute (1364-19) 9}}) a cenu Breast Cancer Alliance 2021 za výjimečný projekt. Tato práce byla také částečně podpořena cenou USDAaward (USDA/NIFA 2020-67017-30843).

Příspěvky autorů: S. Ma, J. Yu a MA Caligiuri projekt vymysleli a navrhli. S. Ma, J. Yan, J. Zhang a J. Yu prováděl experimenty a/nebo analýzy dat. Z. Chen, L.-S.Wang, JC Sun a J. Chen přispěli činidly a materiální podporou. S. Ma, J. Yu, J. Chen a MA Caligiuri tento článek napsali, zkontrolovali a/nebo revidovali. Všichni autoři výsledky diskutovali a rukopis komentovali.

Zveřejnění: J. Chen oznámil „jiné“ od Genovel BiotechCorp. mimo předloženou práci a je vědeckým zakladatelem Genovel Biotech Corp. a vědeckým poradcem pro rasovou onkologii. Žádné další odhalení nebyly hlášeny.

Reference

1.Arase, H., ES Mocarski, AE Campbell, AB Hill a LL Lanier. 2002. Přímé rozpoznání cytomegaloviru aktivací a inhibicí receptorů NK buněk. Věda. 296:1323–1326.

2.Ayala, YM, T. Misteli a FE Baralle. 2008. TDP-43 reguluje fosforylaci proteinu retinoblastomu prostřednictvím represe exprese cyklin-dependentní kinázy 6. Proč. Natl. Akad. Sci. USA. 105:3785–3789.

3.Barbieri, I., K. Tzelepis, L. Pandolfini, J. Shi, G. Millan-Zambrano, SC Robson, ´D. Aspris, V. Migliori, AJ Bannister, N. Han a kol. 2017. METTL3 vázaný na promotor udržuje myeloidní leukémii pomocí kontroly translace závislé na m6A. Příroda. 552:126–131.

4. Becknell, B. a MA Caligiuri. 2005. Interleukin-2, interleukin-15 a jejich role v lidských přirozených zabíječských buňkách. Adv. Immunol. 86:209–239.

5.Bertoli, C., JM Skotheim a RA de Bruin. 2013. Kontrola transkripce buněčného cyklu během G1 a S fáze. Nat. Mol. Cell Biol. 14:518–528.

6.Bezman, NA, CC Kim, JC Sun, G. Min-Oo, DW Hendricks, Y. Kamimura, JA Best, AW Goldrath a LL Lanier. Konsorcium projektu imunologického genomu. 2012. Molekulární definice identity a aktivace přirozených zabíječských buněk. Nat. Immunol. 13:1000–1009.

7.Carson, WE, JG Giri, MJ Lindemann, ML Linett, M. Ahdieh, R. Paxton, D. Anderson, J. Eisenmann, K. Grabstein a MA Caligiuri. 1994. Interleukin (IL) 15 je nový cytokin, který aktivuje lidské přirozené zabijácké buňky prostřednictvím složek IL-2 receptoru. J. Exp. Med. 180:1395–1403.

8.Carson, WE, TA Fehniger, S. Haldar, K. Eckhert, MJ Lindemann, CF Lai, CM Croce, H. Baumann a MA Caligiuri. 1997. Potenciální role interleukinu-15 v regulaci přežití lidských přirozených zabíječských buněk.J. Clin. Investovat. 99:937-943.

9. Chan, CJ, MJ Smyth a L. Martinet. 2014. Molekulární mechanismy aktivace přirozených zabíječských buněk v reakci na buněčný stres. Cell DeathDiffer. 21:5–14.

10. Chen, X., J. Han, J. Chu, L. Zhang, J. Zhang, C. Chen, L. Chen, Y. Wang, H. Wang, L. Yi a kol. 2016. Kombinovaná terapie EGFR-CAR NK buněk a onkolytického viru herpes simplex 1 pro mozkové metastázy karcinomu prsu. Oncotarget. 7:27764–27777.

For more information:1950477648nn@gmail.com