Vztah mezi cyklooxygenázou (COX-2) a onemocněním vyvolaným hypoxií

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Intracelulární prostaglandin E2 přispívá k hypoxií indukované smrti proximálních tubulárních buněk

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Proximální tubulární buňky (PTC) jsou zvláště citlivé na apoptózu vyvolanou hypoxií, což je relevantní faktor pronemoc ledvin. Předpokládali jsme zde, že smrt PTC při hypoxii je zprostředkována produkcí prostaglandinu E,(PGE,) závislou na cyklooxygenáze (COX-2), která byla potvrzena v lidských proximálních tubulárních HK-2buňkách kvůli hypoxii (1 procento O,)-indukované apoptóze (i) bylo zabráněno pomocí COX-2(cyklo-inhibitor oxygenázy) a antagonisty prostaglandinových (EP)receptorů a (ii)souvisel se zvýšením intracelulárního PGE,(iPGE,)v důsledku hypoxií indukovatelného faktoru-1 -závislé transkripční up-regulace COX{{3 }}(cyklo-oxygenáza). Apoptóze také zabránily inhibitory transportéru vychytávání prostaglandinu PGT, což naznačovalo, že iPGE přispívá k apoptóze indukované hypoxií (naopak hypoxií/reoxygenací indukovaná smrt PTC byla výhradně způsobena extracelulárním PGE,). IPGE je tedy novým aktérem v patogenezi hypoxií indukovaného tubulárního poškození a PGT může být novým terapeutickým cílem pro prevenci lézí závislých na hypoxii u renálních onemocnění.

Je dobře známo, že tubulární hypoxie je relevantním faktorem pro akutní i chronickounemoc ledvin'2 Proximální tubulární buňky (PTC) jsou vysoce aktivní, pokud jde o spotřebu kyslíku, kvůli jejich energeticky náročným aktivitám reabsorpce, a v důsledku toho jsou náchylné k hypoxii. Bylo ukázáno, že apoptóza hraje relevantní roli v kultivovaných PTC vystavených hypoxii, ale signální dráhy odpovědné za aktivaci apoptotického aparátu nebyly zkoumány. My a další jsme zjistili, že prostaglandin E, (PGE,), důležitý lipidový mediátor řady fyziologických a patologických procesů vledvina, hraje relevantní roli v signalizaci vedoucí k apoptóze PTC po léčbě cisplatinou7, albuminem8 nebo leptinem a gentamycinem. Ve všech případech bylo zjištěno, že zvýšení PGE závisí na zvýšené expresi cyklooxygenázy-2(COX-2)(cyklooxygenáza), indukovatelný enzym, který je spolu s COX-1l ​​krokem omezujícím rychlost syntézy prostaglandinů. V lidskémledvina, bazální COX-2(cyklooxygenáza)výraz je méně intenzivní než u COX-1. COX-2(cyklooxygenáza)byl za fyziologických podmínek identifikován v podocytech a částech Henleovy kličky a renální vaskulatuře10. V patologických stavech však lze imunoreaktivitu COX-2 nalézt v mnoha dalších typech buněk vledvinavčetně PTC a možná přispívá k poškození ledvin. Je zajímavé, že hypoxie zvyšuje expresi COX-2(cyklooxygenáza)a/nebo produkci PGE,12-i7 v mnoha typech buněk. Ve skutečnosti jsme již dříve zjistili, že hypoxie zvyšuje intracelulární obsah v PGE a také jeho uvolňování do extracelulárního média8. Proto je teoreticky možné, že PGE zprostředkovává apoptotický účinek hypoxie na PTC.

Většina studií apoptózy závislé na PGE se v podstatě soustředila na mechanismy zahrnující extracelulární PGE, protože se všeobecně uznává, že PGE uplatňuje své biologické účinky prostřednictvím aktivace receptorů PGE spřažených s plazmatickou membránou G-protein (receptory prostaglandinů řady E EP1-4)1. Nicméně v některých modelech je intracelulární PGE,(iPGE,) relevantní při apoptotické buněčné smrti720-22. To znamená, že pro indukci apoptózy se PGE musí znovu dostat do intracelulárního média a aktivovat podskupinu EP receptorů, které se nacházejí uvnitř buňky (iEP receptory). Vzhledem k tomu, že úkol zachytit PGE je prováděn hlavně transportérem vychytávání prostaglandinu (PGT)23-26, inhibice PGT vede k prevenci apoptotické buněčné smrti zprostředkované iPGE7.

S ohledem na toto pozadí jsme v této práci studovali, zda COX-2(cyklooxygenáza)-závislé zvýšení iPGE, hladiny zprostředkovávají hypoxií indukovanou apoptózu v PTC.

Klikněte na organický Cistanche pro onemocnění ledvin

Metody

Reagencie.

AG1478, Bromokresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, krystalová violeť, roztoky trypanové modři, bromosulfoftalein (BRS), 3-(5'-Hydroxymethyl2'-furyl)-1-benzylindazol (YC1), a aktinomycin D byly zakoupeny od Sigma (St. Louis, MO, USA). Z-VAD-FMK a celekoxib byly od Calbiochem (Darmstadt, Německo) a Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA), v daném pořadí. TriReagent byl zakoupen od Vitro (Madrid, Španělsko) a PVDF membrány a Western blotting luminolové činidlo byly získány od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. USA). ProLong Gold antifade reagent se 4,6-diamidino{{14 }}fenylindol (DAPI), annexin-V-FITC (fluorescein isothiokyanát)/propidium jodid (PI) detekční souprava apoptózy a 2',7'-dichlorfluorescein diacetát (DCFH-DA) sonda byly zakoupeny od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), respektive Molecular Probes (Oregon, USA). Protilátky byly získány z následujících zdrojů: anti-PGE a anti-COX-2(cyklooxygenáza)protilátky byly od Abcam (Cambridge, UK); anti-Bax a anti-Bcl-2 byly od Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA); anti-HIF-la protilátka a -králičí-Alexa-Fluor 488 byly od BD Biosciences (Palo Alto, CA, USA) a Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), v daném pořadí; anti- -aktin a králičí anti-myší IgG peroxidázový konjugát byl zakoupen od Sigma (St.Louis, MO, USA).

Buněčná kultura a experimentální podmínky.

Lidské proximální tubulární HK-2 buňky byly zakoupeny od American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). Buňky byly udržovány v 5% CO, při 37 stupních Cin DMEM/F12 doplněné 10% fetálního skotu. sérum (FBS), 1 procento penicilin/streptomycin/amfotericin B a 1 procento glutaminu (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA) a 1 procento inzulín-transferin-selen (ThermoFisher. Grand Island, NY, USA). Ve všech experimentech buňky byly naneseny při 70-90 procentech konfluence, a když byly zcela připojeny, byly kultivovány za hypoxických (1 procento kyslíku) nebo normoxických podmínek (21 procent kyslíku).Hypoxieexperimenty byly prováděny v In vivo200hypoxiepracovní stanice (Ruskin Technology, West Yorkshire, Velká Británie). Prohypoxie/reoxygenační experimenty byly buňky podrobenyhypoxiepo dobu 24 hodin a poté byly buňky inkubovány v normoxických podmínkách po dobu až 3 hodin (reoxygenační perioda).

Imunofluorescenční analýza iPGE a analýza Western blot COX-2(cyklooxygenáza)a HIF-1

Buňky pro imunofluorescenční analýzu a Western blot analýzu byly rozděleny na skleněná krycí sklíčka (4x104 buněk/sklo) nebo do šestijamkových destiček (15x104 buněk/jamka) a inkubovány, jak je popsáno v "Výsledky". Poté byla provedena imunofluorescence a imunoblotovací analýza v podstatě tak, jak bylo popsáno dříve. Pracovní ředění protilátek bylo: 1/50 pro PGE,,1/1000 pro COX-2(cyklooxygenáza)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 a 1/5000 pro -aktin. Imunofluorescenční detekce byla provedena pomocí konfokálního mikroskopu Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Německo), prostřednictvím služby konfokální mikroskopie (ICTS 'NANBIOSIS'U17) Centra pro síťování biomedicínského výzkumu pro bioinženýrství, biomateriály a nanomedicínu (CIBER-BBN v USA). University of Alcal, Madrid, Španělsko)

Přechodná transfekce.

Přechodná transfekce siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), savčí expresní vektor pcDNA3 obsahující cDNA divokého typu lidské 15-hydroxy-prostaglandin dehydrogenázy (p15-PGDH) nebo konstrukty luciferázového reportérového plazmidu pro lidskou COX-2(cyklooxygenáza)phPES2-Lucu, člověčehypoxieresponzivní element (HRE)p9HIF1-Luc a R. reniformis pRL-CMV (Promega, Madison, WI) a stanovení luciferázové aktivity bylo provedeno tak, jak je popsáno jinde27,28.

Počet buněk a morfologie buňky/jádra.

Počet adherentních buněk byl stanoven spektrofotometricky modifikovanou metodou barvení krystalovou violetí2. Pro detekci důkazů apoptózy byla buněčná morfologie pozorována pomocí mikroskopie s fázovým kontrastem. Buněčná jádra byla vizualizována po barvení DNA pomocí DAPI, jak bylo popsáno dříve0. Typická apoptotická morfologie, která byla zkoumána, zahrnovala smršťování buněk, jadernou kondenzaci a fragmentaci a tvorbu apoptotických tělísek. Pro kvantifikaci bylo v každém experimentálním stavu slepým způsobem zkoumáno šest polí, aby se odhadlo procento jader se vzhledem podobným apoptóze.

Test apoptózy průtokovou cytometrií a test životaschopnosti buněk testem vyloučení barviva trypanovou modří.

Adherentní buňky na destičce byly odděleny trypsinizací a společně s oddělenými buňkami dříve získanými z kultivačního média byly použity pro test.

Sada pro detekci apoptózy Annexin-V-FITC/PI umožňovala detekci apoptotických a nekrotických HK-2 buněk průtokovou cytometrií, jak bylo popsáno dříve7. Časné a pozdní apoptotické buňky byly pozitivní na barvení annexinem V a oba a annexin V barvení. Nekrotické buňky byly pozitivní pouze na PI a živé HK-2 buňky nevykazovaly žádné barvení.

K hodnocení životaschopnosti buněk byl použit test vylučování barviva trypanovou modří. Životaschopné buňky (bílé) a mrtvé buňky (modré) byly spočítány pomocí světelného mikroskopu a hemocytometru.

Statistická analýza.

Každý experiment byl opakován alespoň třikrát. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Byly podrobeny jednosměrné analýze rozptylu (ANOVA) následované Bonferroniho testem pro vícenásobné srovnání. Hladina významnosti byla nastavena na P Menší nebo rovna 0,05.

Výsledek

Hypoxie indukuje smrt proximálních tubulárních HK-2 buněk.

Hypoxiesnížil počet HK-2 buněk, jak bylo hodnoceno testem krystalové violeti (obr. la), a také vyvolal zakulacení buněk a oddělení od destičky (obr. lb, horní panel). Podle očekávání,hypoxiespustil model buněčné smrti s jasnými morfologickými charakteristikami apoptózy (viz barvení jádra pomocí DAPI na obr. lb, dolní panel, vlevo), jako je smršťování buněk s významnou jadernou kondenzací, fragmentací a tvorbou tělísek podobných apoptóze.Hypoxie-indukovaná apoptóza byla dále potvrzena zvýšením barvení annexinem V-FITC, jak bylo hodnoceno průtokovou cytometrií, a její prevencí inhibitorem pan-kaspázy Z-VAD-FMK (obr. lc).Hypoxietaké určilo snížení počtu životaschopných buněk, ale neindukovalo statisticky významné změny v počtu nekrotických buněk (obr. lc, vložka).

Obrázek 1. Hypoxie indukuje smrt proximálních tubulárních HK-2 buněk.(a) Snížený počet buněk (test krystalové violeti). (b) Morfologické charakteristiky apoptózy. Reprezentativní mikrofotografie s fázovým kontrastem (horní panel, původní zvětšení, 10×) DAPI barvicí mikrofotografie (spodní panel, původní zvětšení, 40×). (c) Zvýšení apoptózy (studie průtokové cytometrie). Buňky Annexin V plus zahrnují buňky Annexin V plus/propidium jodid (tj. časné apoptotické buňky se zachovanou integritou plazmatické membrány) a buňky annexin V plus/propidium jodid plus (tj. pozdní apoptotické buňky). Vložka: Typy buněčných populací (Annexin V-/propidium jodid plus buňky jsou nekrotické buňky a annexin V-/propidium jodid – jsou živé buňky). Výsledky jsou vyjádřeny v procentech vzhledem k celkovému počtu událostí. Obecné informace: (1) Buňky byly inkubovány po dobu 24 hodin v normoxických (21 procent O2) nebo hypoxických (1 procento O,) podmínek, jak je uvedeno v "Metody?". Inhibitor pan-kaspázy Z-VAD-FMK （25 μM） přidáno 1 hodinu před zahájením expozicehypoxie. (2)Mikrofotografie jsou reprezentativní příklady tří nezávislých experimentů. Sloupce a chybové úsečky v grafech: Každý sloupec představuje průměr ± SEM ze 3 různých experimentů *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hypoxie;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hypoxieplus ZVAD.

COX-2(cyklooxygenáza)/iPGE,/EP receptorová dráha zprostředkovává smrt proximálních tubulárních HK-2 buněk vyvolanou hypoxií.

Abychom mohli posoudit roli COX-2(cyklooxygenáza)/iPGE2/EP receptorová dráha vhypoxie- indukovala smrt buněk HK-2, nejprve jsme buňky preinkubovali celekoxibem, COX-2(cyklooxygenáza)inhibitor1; AH6809, antagonista receptorů EP1, EP2 a EP3 nebo GW627368X, antagonista receptoru EP433; nebo s bromokresolovou zelení nebo bromosul-foftalem v obou z nich inhibitory PGT435. PGT byl také sražen prostřednictvím transfekce siRNA.

Obrázek 2. COX-2(cyklooxygenáza)/iPGE,/EP receptorová dráha zprostředkovává hypoxií indukovanou smrt proximálních tubulárních HK-2 buněk.(a) Prevence buněčné smrti inhibitory dráhy. Horní panel; Sloupce ukazují procento celkové buněčné smrti (vlevo) nebo procento apoptotických buněk annexinu V plus (vpravo). Před vystavenímhypoxiebuňky byly preinkubovány po dobu 1 hodiny s 3 μM celecoxibu（COX-2(cyklooxygenáza)inhibitor）;10 μuM AH6809, (antagonista receptorů EP1-3), 10 μM GW627368X (antagonista receptoru EP4）); nebo s 50 μM bromokresolovou zelení (BG) nebo 25 μM bromosulfoftaleinem (BrS), dvěma inhibitory PGT. Spodní panel: Vlevo: Prevence buněčné smrti snížením PGT prostřednictvím transfekce siRNA (vylučovací test trypanové modři). Vložka: Účinnost knockdownu PGT (analýza Western blot) Vpravo: Koncentrační závislost preventivního účinku bromokresolové zeleně (BG). (b) Prevence buněčné smrti transfekcí savčím expresním vektorem obsahujícím prostaglandin inaktivující enzym 15-hydroxy-prostaglandin dehydrogenáza (15-PGDH) cDNA (test vylučování barviva trypanové modři). Vložka: Exprese {{ 11}} PGDH (analýza Western blot) v transfekovaných buňkách. (C)Hypoxieindukuje PGT-senzitivní zvýšení iPGE, Vlevo: PGE, je zobrazena samotná imunofluorescence závislá nebo spojená s barvením jader pomocí DAPI (původní zvětšení, 40×) Vpravo: Kvantitativní přístup k obrázkům prezentovaným na levém panelu pomocí softwaru Image J. (d) Inhibitor aktivace EGFR AG1478 nezabraňuje smrti HK-2 buněk EGFR. Buňky byly preinkubovány po dobu 1 hodiny s 1 μM AG1478 před vystavenímhypoxie. （e） PGT inhibitor BG nemodifikuje expresi Bax a Bcl-2 v HK-2 buňkách podhypoxie(analýza Western blot). (f) Prevencehypoxie/reoxygenací indukovaná buněčná smrt inhibitory dráhy (test vyloučení barviva trypanovou modří). Buňky byly předem inkubovány s inhibitory dráhy a podrobenyhypoxiejako v (a). Poté byly buňky vystaveny normoxii po dobu 3 hodin. Obecné informace: (1) Buňky byly inkubovány po dobu 24 hodin v normoxických (21 procent O,) nebo hypoxických (1 procent O,) podmínek, jak je uvedeno v "Metody". (2)Mikrofotografie jsou reprezentativní příklady tří nezávislých experimentů. (3) Rozpouštědla inhibitorů (ml/ml médium) nemodifikovala účinekhypoxiena buněčnou smrt (výsledky nejsou uvedeny). (4) Analýza Western blot: Stejný protein byl potvrzen sondováním anti- -aktinem nebo anti-GAPDH protilátkou. (5)Sloupce a sloupec chyb v grafech: Každý sloupec představuje průměr ± SEM ze 3 různých experimentů.*P<0.01><0.01>hypoxienebohypoxie/reoxygenace.

Jak je znázorněno na obr. 2a,hypoxieVe všech případech bylo zabráněno odumírání proximálních tubulárních buněk. Inhibice apoptózy celekoxibem ukázala, že COX-2(cyklooxygenáza)hraje relevantní rolihypoxie- indukovaná apoptotická buněčná smrt (obr. 2a, horní panel, vpravo). Přesněji, skutečnost, že apoptóze bylo zabráněno antagonismem EP receptorů, svědčí o tom, že apoptóza je zprostředkována COX-2(cyklooxygenáza)-závislá produkce PGE. Na druhou stranu je nejpravděpodobnější, že iPGE přispívá khypoxie-vyvolala smrt HK-2 buněk, protože tomu bylo zabráněno oxidace25 (za zmínku, samotný postup transfekce zvýšil citlivost buněk HK-2 nahypoxie: buněčná smrt byla 45-55 procent pro transfekci v kontrolních podmínkách ve srovnání s 15-20 procenty u netransfekovaných buněk). Další podpora příspěvku iPGE, dohypoxie-indukovaná HK-2 buněčná smrt, jsou naše předchozí zjištěníhypoxieurčuje zvýšení obsahu buněk iPGE1 a že tomuto zvýšení bylo zabráněno inhibitory PGT (obr. 2c).

Signální dráhy MAPK mohou indukovat apoptózu, protože iEP receptory transaktivují receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR)36, což vede k aktivaci MAP kináz ERK1/2 a p38 v HK-2 buňkách0, zeptali jsme se, zda pre -zabráněno inkubaci HK-2 buněk s inhibitorem aktivace EGFR AG1478hypoxie- indukovaná buněčná smrt. Našli jsme negativní výsledky (obr. 2d), a proto je nepravděpodobné, že by transaktivace EGFR zprostředkovávala smrt HK-2 buněk podhypoxie.

V několika experimentálních modelech byla redukce mitochondriálního ATP běhemhypoxiezpůsobuje zvýšení poměru exprese proapoptotického proteinu Bax k antiapoptotickému proteinu Bcl-2, což vede k uvolnění cytochromu C do cytosolu, aktivaci kaspázy 9 a následnému štěpení a aktivaci downstream efektoru kaspázy37,38. Nicméně preinkubace s PGT inhibitorem BG v HK-2 buňkách podhypoxienevedlo ke změnám kompatibilním s antiapoptickým posunem v rovnováze mezi expresí Bc-2 a Bax(obr.2e), což nepodporuje roli těchto proteinů v HK-2 buňce smrt podhypoxie.

Po hypoxické expozici mohou epizody reoxygenace (ischemické/reperfuzní poškození) vyvolat další poškození buněk. „Paradox“ reoxygenačního poškození lze pochopit, vezmeme-li v úvahu, že buňky procházejí specifickými změnami v enzymových aktivitách, mitochondriální funkci, cytoskeletální struktuře, membránovém transportu a antioxidační obraně v reakci nahypoxie, které pak kolektivně predisponují k reoxygenačnímu poškození39. Reoxygenace přispívá k akutnímu poškození ledvin při ischemické cévní mozkové příhodě, transplantaci ledviny, oběhovém selhání nebo renální a kardiovaskulární chirurgii. V této souvislosti je potenciální terapeutická hodnota inhibicehypoxie/reoxygenací indukovaná smrt proximálních tubulárních buněk prostřednictvím zásahu do COX-2(cyklooxygenáza)/iPGE,/iEP receptorová dráha je evidentní. Proto jsme se zeptali, zda iPGE konkrétně zprostředkováváhypoxie-vyvolává buněčnou smrt nebo také zprostředkováváhypoxie/reoxygenací indukovaná buněčná smrt (model in vitro, který napodobuje in vivo renální ischemii/reperfuzní poškození). Jak je znázorněno na obr. 2f, buněčné smrti (jak bylo hodnoceno testem vyloučení trypanové modři) bylo zabráněno pomocí COX-2(cyklooxygenáza)inhibitor celekoxib, jakož i antagonisté receptoru EP AH6809 nebo GW627368X. Stejně jako u obr. 2a tyto výsledky naznačují, že COX-2 hraje relevantní rolihypoxie/reoxygenací indukovaná buněčná smrt a konkrétněji, že buněčná smrt je zprostředkována COX-2(cyklooxygenáza)-závislá produkce PGE, protože tomu bylo zabráněno antagonismem EP receptorů. Protože však buněčné smrti nezabránily inhibitory PGT bromokresolová zeleň nebo bromosulfoftalein (obr. 2f a doplňkový obrázek 2d), je pravděpodobnější, žehypoxie/reoxygenací indukovaná HK-2 buněčná smrt je zprostředkována výhradně extracelulárním PGE.

HIF-1 -závislá transkripční regulace COX-2(cyklooxygenáza)genová exprese přispívá k ahypoxie-indukované zvýšení iPGE v proximálních tubulárních HK-2 buňkách. PGE, biosyntéza zahrnuje uvolnění z membránových glycerofosfolipidů kyseliny arachidonové fosfolipázou A, následovanou konverzí COX izoenzymů kyseliny arachidonové na prostaglandin H a nakonec izomerizací prostaty v H, na PGE, prostaglandin E syntázami jako je mikrozomální PGE syntáza-1 (mPGES-1)19. To jsme zjistilihypoxie-indukovaná apoptóza v HK-2 buňkách je s největší pravděpodobností zprostředkována COX-2(cyklooxygenáza)-závislé zvýšení produkce PGE,(obr.2). Vzhledem k tomu, že COX-2(cyklooxygenáza)je enzym, jehož exprese může být indukovánahypoxie, předpokládali jsme, že ahypoxie-indukované zvýšení PGE, produkce v HK-2 buňkách může být důsledkem zvýšení exprese COX-2(cyklooxygenáza). Abychom potvrdili naši hypotézu, studovali jsme (i)efekthypoxieo výrazu COX-2(cyklooxygenáza)protein a mRNA a (ii) účinek COX-2(cyklooxygenáza)inhibitor celekoxib nahypoxie-indukované zvýšení iPGE, naše výsledky to ukázalyhypoxiepřechodným způsobem stanovena transkripční up-regulace COX-2(cyklooxygenáza)výraz (obr. 3a,b)a ten COX-2(cyklooxygenáza)inhibice omezila nárůst iPGE v HK-2 buňkách podhypoxie(Obr. 3c). Zajímavě,hypoxietaké určil přechodnou up-regulaci exprese proteinu mPGES-1 (obr. 3a, vložka), ale neovlivnil expresi mRNA mPGES-1 (obr. 3b. vložka). Tyto výsledky ukázaly, že zvýšená exprese COX-2(cyklooxygenáza)a mPGES-1 je odpovědná zahypoxie-indukované zvýšení iPGE.

Obrázek 3. HIF-la-dependentní transkripční regulace COX-2(cyklooxygenáza)exprese genu přispívá k hypoxií indukovanému zvýšení iPGE v proximálních tubulárních HK-2 buňkách.(a)Výraz COX-2(cyklooxygenáza)bílkovin se přechodně zvýší ohypoxie(analýza Western blot). Vložka: Exprese mPGES-1 proteinu je také přechodně upregulovánahypoxie. (b)Výraz COX-2(cyklooxygenáza)mRNA je přechodně zvýšena ohypoxie. Vložka: Exprese mPGES-1 mRNA není ovlivněnahypoxie. (c)Prevence celecoxibem, COX-2(cyklooxygenáza)inhibitoru zvýšení iPGE, vyvolanéhohypoxie. Buňky byly preinkubovány po dobu 1 hodiny s 3 uM celecoxibu. Je zobrazena levá∶PGE, závislá imunofluorescence samotná nebo spojená s barvením jádra pomocí DAPI (původní zvětšení, 40×). Vpravo: Kvantitativní přístup k obrázkům prezentovaným na levém panelu pomocí softwaru Image J. (d) Příspěvek transkripčních mechanismů. Vlevo: Transkripční inhibitor aktinomycin D (Akt. D) zabraňuje ahypoxie-indukované zvýšení COX-2(cyklooxygenáza)proteinová exprese (analýza Western blot). Buňky byly předem ošetřeny po dobu 1 hodiny s 1 ug/ml Act. D před vystavenímhypoxiena 3 hodiny. Vpravo: Zvýšení aktivity COX-2(cyklooxygenáza)reportérská konstrukce. (e) Inhibitor HIF-la YC-1 zabraňujehypoxie-indukovaná transkripční COX-2(cyklooxygenáza)up-regulace. Buňky byly preinkubovány po dobu 1 hodiny s 0,5 uM YC-1. Vlevo: Prevence COX-2(cyklooxygenáza)up-regulace. Buňky byly vystavenyhypoxiena 8 h. Centrum: Prevence nárůstu aktivity COX-2(cyklooxygenáza)reportérská konstrukce. Vpravo: Inhibice aktivity reportérového konstruktu řízeného HRE. Buňky byly vystavenyhypoxiepo dobu 8 h.(f) Inhibitor HIF-la YC-1 zvyšuje apoptotickou buněčnou smrt (studie průtokové cytometrie). Před vystavenímhypoxiebuňky byly preinkubovány po dobu 1 hodiny s 0,5 μM YC-1. Inset∶ YC-1 inhibujehypoxie-indukované zvýšení exprese HIF-1a (analýza Western blot). Obecné informace: (1) Buňky byly inkubovány po dobu 24 hodin v normoxických (21 procent O,) nebo hypoxických (1 procent O,) podmínek, jak je uvedeno v "Metody". (2)Mikrofotografie jsou reprezentativní příklady tří nezávislých experimentů. (3) Analýza Western blot: Stejný protein byl potvrzen sondováním anti- -aktinovou protilátkou (4) Sloupce a chybové sloupce v grafech: Každý sloupec představuje průměr ± SEM ze 3 různých experimentů *P<0.01 vs.="" other="">

Abychom dále prozkoumali příspěvek transkripčních mechanismů ke zvýšení COX-2(cyklooxygenáza)proteinová exprese podhypoxie, výraz COX-2(cyklooxygenáza)byla hodnocena v HK-2 buňkách, které byly preinkubovány s inhibitorem transkripce aktinomycinem D, než byly podrobenyhypoxiepo dobu 5 hodin. Jak je znázorněno na obr. 3d,hypoxie-indukované zvýšení COX-2(cyklooxygenáza)expresi proteinu zabránil aktinomycin D.hypoxietaké určil zvýšení aktivity COX-2(cyklooxygenáza)konstrukt promotoru dříve transfekovaný v buňkách HK{0}} (obr. 3d vpravo). Celkově vzato výsledky uvedené na Obr. 3d naznačují, že transkripční mechanismy přispívají k ahypoxie-indukované zvýšení COX-2(cyklooxygenáza)proteinová exprese. Nicméně mezi načasováním aktivace promotoru COX-2 a načasováním maximálního COX-2 došlo k rozporu(cyklooxygenáza)exprese mRNA: zatímco přechodné zvýšení COX-2(cyklooxygenáza)Exprese mRNA byla maximální po 2 hodinách (obr. 3b), promotor COX-2 byl aktivován po 3 hodinách (obr.3d), což pravděpodobně odráží příspěvek post-transkripčních mechanismů ke zvýšení COX{{6 }}(cyklooxygenáza)výraz4. V souladu s tím se domníváme, že COX-2(cyklooxygenáza)mRNA je stabilizována podhypoxie, což by vedlo ke zvýšení úrovně COX-2(cyklooxygenáza)exprese mRNA bez jakéhokoli příspěvku (v tu chvíli) zvýšené aktivity COX-2(cyklooxygenáza)promotér. Je však také možné, že časová prodleva mezi aktivací promotoru a akumulací měřitelného substrátu může také přispět k nesouladu mezi načasováním aktivace promotoru COX-2 a načasováním maximální COX{{1 }}(cyklooxygenáza)exprese mRNA.

HIF-1 je heterodimerní transkripční faktor složený z podjednotky závislé na kyslíku a konstitutivně exprimované podjednotky. Podhypoxie, HIF-l se hromadí a vstupuje do jádra, kde po dimerizaci pomocí HIF-1 generuje transkripční faktor HIF-1. HIF-1 pak podporuje expresi svých cílových genů vazbou nahypoxie-responzivní prvky (HRE) přítomné v jejich regulační oblasti a následně organizují buněčné adaptivní reakce k bojihypoxie 3. Vzhledem k tomuhypoxiemůže aktivovat COX-2(cyklooxygenáza)expresi HIF-1-závislým způsobem prostřednictvím funkční HRE přítomné v sekvenci promotoru COX-22 jsme zkoumali roli HIF-1 vhypoxie-indukované zvýšení COX-2(cyklooxygenáza)výraz. Také jsme sledovali aktivitu konstruktu promotoru COX-2 transfekovaného v buňkách HK-2. Jak je znázorněno na obr. 3e, předinkubace s inhibitorem HIF-1a YC-1, který otupilhypoxie-indukované zvýšení exprese HIF-la a aktivity reportérového konstruktu HRE, což vedlo k prevenci zvýšení obou exprese COX-2(cyklooxygenáza)a činnost COX-2(cyklooxygenáza)konstrukt promotoru v HK-2 podrobenhypoxie. Stručně řečeno, výsledky jsou znázorněny na obr. 3a-e podporují názor, že transkripční up-regulace COX závisí na HIF-1 --2(cyklooxygenáza)je zodpovědný zahypoxie-indukované zvýšení iPGE2.

Ačkoli důsledky aktivace HIF-1a nahypoxie-indukovaná apoptóza jsou kontroverzní (pravděpodobně proto, že mohou být závislé na kontextu), analyzovali jsme (předběžně) roli HIF-1a v našem experimentálním systému. Protože jsme již dříve zjistili, že zásah do COX-2(cyklooxygenáza)/iPGE, dráha EP receptoru inhibuje zvýšení exprese HIF-la vyvolanéhypoxie8,56 jsme se zeptali, zda inhibice HIF-la vede k prevencihypoxie-indukovaná apoptóza HK-2 buněk. Jak je znázorněno na obr. 3f, předinkubace s YC-1, inhibitorem HIF-1, ve skutečnosti zvýšilahypoxie- indukovaná apoptóza. Proto je nepravděpodobné, že HIF-la

Diskuse

Tkáňhypoxiese považuje za kriticky relevantní v patofyziologii jak chronického onemocnění ledvin, tak akutního poškození ledvin, protože PTC je nejcitlivější částí renálních tubulů protihypoxie. Zde jsme zkoumali roli PGE při škodách způsobenýchhypoxiena lidské PTC a zjistili, že zvýšená produkce iPGE pochází z HIF-la-dependentní up-regulace COX-2(cyklooxygenáza)genová exprese a zvýšená exprese mPGES-1 přispívá khypoxie- indukoval apoptotickou buněčnou smrt v HK-2 buňkách. Vzhledem k tomu, že tubulární hypoxie je relevantním faktorem pro akutní i chronické onemocnění ledvin-2, tyto výsledky poukazují na transportér prostaglandinů PGT jako na nový terapeutický cíl u onemocnění ledvin.

Hypoxienejen zvyšuje iPGE, ale také jeho uvolňování do extracelulárního média8, takže sekretovaný (extracelulární) PGE může také hrát roli vhypoxie-indukovaná apoptóza (například spouštění apoptotických kaskád prostřednictvím kanonické aktivace EP receptorů umístěných na buněčné membráně). Dvě předchozí studie ukázaly, že buněčná smrt podhypoxiebylo také kvůli COX-2(cyklooxygenáza)-závislá výroba PGE,1345. Na druhé straně u určitých typů buněk (fibroblasty, mikroglie, neurony a buněčné linie akutní lymfoblastické leukémie) je apoptóza indukovaná PGE zprostředkována PGE závislou aktivací EP-receptorů46-48. Tady jsme to našlihypoxie-indukované apoptóze HK-2 buněk bylo zabráněno také antagonismem EP receptorů (obr. 2a, horní panel, vpravo). Ale protože EP receptory byly klasicky popsány jako receptory plazmatické membrány – takže jsou pro iPGE nepřístupné2-, spekulujeme, že EP receptory, které zprostředkovávají apoptotický účinek iPGE, v hypoxických HK-2 buňkách jsou podskupina lokalizovaná intracelulárně (tj. iEP receptory).

Na rozdíl od role iPGE2 vhypoxieindukovanou apoptózou v HK-2 buňkách jsme zjistili, že zprostředkovává pouze extracelulární PGEhypoxie/reoxygenací indukovaná smrt HK-2 buněk, protože jí nezabránily inhibitory PGT (obr. 2f). I když patologické mechanismy buněčného poškození pohypoxie/reoxygenace nejsou zcela pochopeny, předpokládá se, že buněčná smrt z velké části nastává produkcí nadměrného množství reaktivních forem kyslíku (ROS). To platí zejména pro buňky HK-249,50. Nicméně, ačkolihypoxiemůže také zvýšit produkci ROS, pokud je nám známo, neexistuje žádný důkaz, že ROS hraje relevantní vhypoxie- indukovaná smrt buněk HK-2. To naznačuje, že letální účinky hypoxie a hypoxie/reoxygenace v HK-2 buňkách jsou zprostředkovány různými mechanismy, což by mohlo vysvětlovat, proč BG a BS chrání protihypoxieale ne protihypoxie/reoxygenace. V důsledku toho může inhibice PGT poskytnout terapeutické výhody u PTC proti poškození buněk vyvolanému hypoxií, ale ne proti škodlivému účinkuhypoxie/reoxygenace.

HIF-1 -závislá regulace COX-2(cyklooxygenáza)byla kritická událost prohypoxie-indukovaná apoptóza HK-2 buněk (obr. 3e). Naše pozorování, že inhibitor HIF YC-1 zesiloval apoptotickou buněčnou smrt (obr. 3f), je však záhadné, ačkoli předchozí zprávy již ukázaly podobné výsledky1. Jedním z možných vysvětlení je hypotetický scénář, ve kterém HIF-la nejen zprostředkovává proapoptotické zvýšení COX-2(cyklooxygenáza)ale také up-regulace ochranných molekul. HIF-1-reguloval expresi ochranných molekul protihypoxiejako je dlouhá nekódující RNA DARS-AS1' a microRNA-2103 byla specificky nalezena v HK-2 buňkách. I když však tyto důkazy podporují náš hypotetický scénář, měly by být provedeny konkrétní experimenty, které jej potvrdí.

Vyšetření odpovědi ledvinových buněk nahypoxiemůže zlepšit naše chápání renální patologie. Studovali jsme, i když předběžným způsobem, roli zvýšení poměru exprese proapoptotického proteinu Bax k antiapoptotickému proteinu Bcl-2 vhypoxie-indukovaná apoptóza v HK-2 buňkách. Naše výsledky ukázaly, že inhibice PGL nevedla ke změnám kompatibilním s antiapoptickým posunem v rovnováze mezi expresí Bcl-2 a Bax(obr.2e), což nepodporuje roli těchto proteinů v iPGE-dependentní HK-2 buněčná smrt podhypoxie. Pokud je nám známo, existují pouze dvě studie o implikaci osy Bcl{0}}}/Bax v apoptóze indukované hypoxií u PTC a obě zahrnovaly anoxické" nebo téměř anoxické koncentrace O5 Když byl PTC vystaven 0,2 procenta O., exprese Bax zůstala nezměněna a apoptóza byla spojena se sníženým stupněm exprese Bcl-2. Exprese Bcl-2 však nebyla ovlivněna 1 procentem O, navzdory přítomnost apoptózy, která se shoduje s našimi výsledky. Proto by měly být zváženy další mechanismy, které nutně nezahrnují kvantitativní změny v expresi Bcl-2 nebo Bax: například indukce apoptózy v kultivovaných gliomových buňkách pomocí iPGE2 vyžaduje pouze jeho fyzická asociace s Bax, která spouští translokaci Bax do mitochondrií 202. Mechanismus, kterým iPGE přispívá k apoptóze HK-2 buněk, si tedy zaslouží další studium.

Naše skupina zjistila, že COX-2(cyklooxygenáza)-závislé zvýšení iPGE, zprostředkovává apoptotickou smrt v buňkách HK-2 vystavených cisplatině, apoptickým tělískům7" ahypoxie(naše aktuální výsledky). Vzhledem k tomu, že PGE, je rychle uvolňován ven z buňky poté, co byl svntezován2, jeho vnitřní transport pomocí PGl hraje kritickou roli v apoptóze indukované iPGE v buňkách HK-2. Proto kdykoli je poškození PTC zprostředkováno iPGE, léčba inhibitory PGT může být užitečným terapeutickým přístupem s potenciálními aplikacemi, jako je prevence poškození PTC vyvolaného cisplatinou, inhibice propagace tubulárního poškození prostřednictvím apoptotických tělísek nebo omezení škodlivý účinekhypoxiena PTC.