Funkční vlastnosti proteinů mohou být vylepšeny hydrolýzou určitými proteázami

Prosím kontaktujteosar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Abstraktní:Pro zkoumání metod pro zlepšení zpracování prasečího odpadu byla prasečí kůže hydrolyzována za použití různých komerčně dostupných proteáz (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex a Papain) za několika optimálních podmínek. Po enzymatické hydrolýze byly hydrolyzáty kolagenu (CHs) frakcionovány podle molekulové hmotnosti (3 kDa) pomocí membránové ultrafiltrace. U CHS byly analyzovány fyzikální vlastnosti (pH, obnova proteinů, obsah volných aminoskupin, distribuce molekulové hmotnosti a složení aminů) a také funkční vlastnosti (antioxidační aktivity a aktivity proti stárnutí). Mezi CHs vykazovaly CH hydrolyzované Alcalase (CH-Alcalase) nejvyšší stupeň hydrolýzy ve srovnání s ostatními CH. Oba "CH-Alcalase" a "CH-Alcalase".<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">

klíčová slova:hydrolýza; komerční proteázy; hydrolyzát kolagenu; antioxidant; proti stárnutí

KSL01

Kliknutím sem se dozvíte více

1. Úvod

S rostoucí očekávanou délkou života se procedurám proti stárnutí pleti věnuje velká pozornost. Kolagen, používaný v produktech péče o pleť jako kosmetická složka proti stárnutí, je široce používán na kosmetickém trhu. Kolagen je vysokomolekulární vláknitý protein živočišného původu, který se hojně nachází v pojivové tkáni, kůži, šlachách, chrupavkách, vazech, zubech, nehtech a vlasech lidí a zvířat. Hlavním zdrojem průmyslového kolagenu zůstává hospodářská zvířata [1l. Potravinářský průmysl a masozpracující průmysl každoročně po celém světě vyhazují velké množství vedlejších produktů živočišné výroby jako odpad. Ty však mohou být využity jako důležité zdroje bílkovin pro nové potravinářské materiály nebo přeměněny na produkty s přidanou hodnotou prostřednictvím hydrolýzy, která se široce používá ke zlepšení a vylepšení funkčních a nutričních vlastností bílkovin [2,3].cistanche džingischánKolagen je také stále více považován za zdroj bioaktivních peptidů, které se ukázaly být slibnými jako prospěšné sloučeniny pro použití v nutričních nebo farmaceutických aplikacích. Proto může hydrolýza kolagenu hrát důležitou roli při zlepšování jeho biologické dostupnosti a vhodnosti pro použití v různých komerčních procesech.

Fyziologické aktivity bioaktivních peptidů, které obvykle obsahují 2-20 aminokyselinových zbytků (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms="" [1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="" the="" degree="" of="" hydrolysis="" directly="" affects="" the="" molecular="" weight="" and="" amino="" acid="" composition="" of="" the="" hydrolysates="" [8].="" therefore,="" the="" hydrolysis="" process="" may="" be="" necessary="" for="" producing="" novel="" bioactive="">

KSL02

Cistanche může proti stárnutí

Hydrolýza proteinů vedoucí ke štěpení peptidových vazeb může být provedena enzymatickými nebo chemickými procesy [9]. Chemické procesy, včetně alkalické nebo kyselé hydrolýzy pomocí extrakce rozpouštědlem, jsou škodlivé nejen pro životní prostředí, ale i pro člověka, který výsledné produkty konzumuje [4,10]. Chemické procesy, které je obtížné kontrolovat, poskytují produkty obsahující modifikované aminokyseliny [9]. Naproti tomu enzymatická hydrolýza může být prováděna za mírných podmínek, čímž se vyhnete extrémním prostředím, která jsou vyžadována chemickými úpravami.cistanche prodloužení životnostiNavíc procesy nevyvolávají vedlejší reakce ani nesnižují nutriční hodnotu zdroje bílkovin [8]. Několik proteáz, včetně Alcalase, pepsinu, Protamexu, trypsinu a Neutrase, se běžně používá k hydrolýze proteinů, což vede k různým typům proteinových hydrolyzátů a peptidů s různými biofunkčními aktivitami. Jedna studie uvádí produkci kolagenových hydrolyzátů s antioxidační aktivitou z želatiny vepřové kůže pomocí enzymatické hydrolýzy pepsinem a pankreatinem [11]. Vedlejší produkty z lososa byly hydrolyzovány za vzniku peptických hydrolyzátů pomocí různých proteáz, kde finální peptidy vykazovaly vynikající antioxidační a protizánětlivé vlastnosti [12].

Cílem výzkumu bylo: (a) identifikovat nejaktivnější kolagenové hydrolyzáty produkované enzymatickou hydrolýzou za použití různých komerčně dostupných proteáz (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Bromelain a Papain); (b) potvrdit frakcionační účinek hydrolyzáty kolagenu získané enzymatickou hydrolýzou a (c) ke stanovení jejich in vitro antioxidačních a anti-aging aktivit.

2. Výsledky a diskuse

2.1. Vliv enzymatické hydrolýzy na hydrolyzáty kolagenu

2.1.1. pH

Funkční vlastnosti proteinů lze zlepšit hydrolýzou určitými proteázami. V této studii bylo použito šest různých proteáz (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex a Papain) k hydrolýze kolagenu z prasečí kůže za účelem získání aktivních hydrolyzátů kolagenu s nízkou molekulovou hmotností. Změna pH v kolagenových hydrolyzátech (CH) je znázorněna na obrázku 1. Hodnota pH kolagenové suspenze (5% směs prasečí kůže) byla zpočátku 6.39-6,55 (v 0h). CH-Alcalase a CH-Flavorzyme dosáhly optimálního pH (pH 8.0) po 12 hodinách inkubace. CH-Protamex, CH-Bromelain a CH-Papain dosáhly optimálního pH (pH 7.0) po 6 hodinách inkubace, zatímco CH-Flavorzyme pokračoval v poklesu z pH 6,39 na pH 5,69 po dobu 24 inkubací (obrázek 1 ). pH proteinového hydrolyzátu je důležitým faktorem, který reguluje enzymatické hydrolyzační reakce [13].cistanche nzProto tvorba kolagenových hydrolyzátů za podmínek různého pH může být způsobena změnami v konformaci enzymů závislými na pH, které mohou ovlivnit jejich bioaktivaci a fyzikálně-chemické vlastnosti.

2.1.2. Elektroforéza na dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE)

Jsou znázorněny profily elektroforézy na gelu s dodecylsulfátem a polyakrylamidovým gelem (SDS-PAGE) CHs ošetřených různými proteázami po dobu 24 hodin (obrázek 2). Peptidový profil kolagenové suspenze (v 0 h) ukázal viditelný pás v rozmezí od nízké do vysoké molekulové hmotnosti. Výsledky ukázaly rychlou hydrolýzu v CH-Alcalase, CH-Neutrase, CH-Bromelain a CH-Protamex, protože po 3 hodinách inkubace nebyly žádné pruhy. Pásy s vysokou molekulovou hmotností CH-Alcalase, CH-Neutrase a CH-Protamex se snižovaly časově závislým inkubačním způsobem. Nicméně CH-bromelin se neměnil s inkubační dobou, protože byl zcela hydrolyzován již po 1 hodině inkubace. Zajímavé je, že CH úplně zmizely, když vzorek reagoval s Alcalase nebo Neutrase po dobu 6 hodin, což naznačuje, že kolagen působil jako vhodný substrát pro některé další testované enzymy. Pásy CH-Flavorzymu a CH-Papainu se však objevily v rozmezí nízké až vysoké molekulové hmotnosti po 24 hodinách. Proteiny mohou být částečně hydrolyzovány na peptidy nebo aminokyseliny enzymatickou hydrolýzou v závislosti na typu proteázy, inkubační době a poměru proteázy k substrátu (množství proteinu) [14]. Proces enzymatické hydrolýzy je určen především tím, zda se jedná o typ proteázy endopeptidáza nebo exopeptidáza [15,16]. Protože Alcalase, Neutrase a Protamex jsou endopeptidázy, lze očekávat, že jejich hydrolytické procesy náhodně rozbijí peptidové vazby z neterminálních aminokyselin, čímž usnadní další hydrolýzu proteinů. Na druhou stranu je Flavorzyme jak endo-, tak exopeptidáza, která štěpí ne- nebo N-konec peptidových řetězců. V této studii kolagenový protein obsahoval vazebná místa, která byla citlivější na aktivitu exopeptidázy než na aktivitu endopeptidázy Flavorzymu. V důsledku exopeptidázové aktivity tedy hydrolýza kolagenových proteinů Flavorzym zahrnovala postupné štěpení peptidových vazeb z N-konce aminokyselin, což zpomalilo hydrolýzu proteinu.

2.1.3. Obnova bílkovin a obsah volných aminokyselin

Je ukázáno získávání proteinů z CH získaných prostřednictvím různých komerčních proteáz (obrázek 3A). Kontrola (kolagenová suspenze) měla obsah regenerace proteinu 1,19 mg/ml. Získávání proteinů je parametrem účinnosti enzymatické hydrolýzy. Nízký obsah obnovitelných bílkovin v CH svědčí o zvýšeném odbourávání bílkovin. Kromě toho regenerace proteinu dobře koreluje s rozpustností proteinu. Vyšší hydrolytická aktivita může být způsobena zvýšením exponovaných hydrofobních postranních řetězců, což vede ke zvýšeným hydrofobním interakcím mezi proteiny a/nebo peptidy.velikost penisu cistancheTyto hydrofobní postranní řetězce mohou vést ke snížené rozpustnosti proteinu, což má za následek zvýšenou regeneraci proteinu z hydrolyzátů. V naší studii obsah regenerace proteinu dobře koreloval se změnami ve vzorcích SDS-PAGE. Nejnižší a nejvyšší hladiny výtěžku proteinu byly zaznamenány pro hydrolýzu Alcalase a Flavorzyme, v daném pořadí. Pro účinnost hydrolýzy související s inkubační dobou se CH-Alcalase, CH-Bromelain a CH-Protamex drasticky snížily během jedné hodiny po inkubaci ve srovnání s kontrolou. Snížení obsahu regenerovaného proteinu v důsledku hydrolýzy proteinu ukázalo inverzní vztah k obsahu aminoskupin. Kromě toho většina CH, s výjimkou CH-Neutrase, vykazovala nízký obsah proteinů mezi 3 a 12 hodinami. Po 24 hodinách inkubace se jejich obsah proteinů znovu zvýšil v CH-Alcalase, CH-Flavorzyme, CH-Neutrase, CH-bromelin, CH-Protamex a CH-Papain následovně:0,83 mg/ml, 1,29 mg/ml,0,75 mg/ml,0,97 mg/ml, 0,77 mg/ml, respektive 1,11 mg/ml. Některé zprávy naznačují, že optimální doba hydrolýzy závisí na několika faktorech, jako je zvolený druh, surovina, použitý enzym, rychlost suroviny/enzymu, koncentrace enzymu a stupeň hydrolýzy atd. [16] ]. Některé zprávy naznačují, že prodloužená enzymatická hydrolýza (přes 24 hodin) může vést ke snížení aktivity proteázy; enzymatická hydrolýza by tedy měla být provedena do 24 hodin od enzymatické hydrolýzy [17,18].

KSL03

The free amino group content of CH, which is an indicator of enzymatic hydrolysis efficiency, was estimated (Figure 3B). The expected outcome of protein breakdown is that protein may be hydrolyzed into shorter peptide products. The free amino group content of the control was initially 0.14 mg/mL. The free amino group content of all CHs dramatically increased with increasing incubation time. After 24 h incubation, the free amino group content by descending order was: CH-Alcalase(1.00 mg/mL)> CH-Protamex(0.70 mg/mL)> CH-Neutrase(0.68 mg/mL)>CH-Bromeline (0.67 mg/mL)>CH-Flavorzyme(0.53mg/mL)>CH-Papain (0,40 mg/ml). Rozdíly v obsahu celkového proteinu nebo volných aminoskupin v enzymaticky hydrolyzovaných vzorcích mohou obvykle souviset se specificitou enzymu. Je závislá na vlastnostech enzymu během procesu enzymatické hydrolýzy [16,17].cistanche prášek,Například alkalické proteázy (jako je Alcalase) vykazují vyšší hydrolytické aktivity ve srovnání s kyselými nebo neutrálními proteázami.

Obrázek 3. Změna ve výtěžnosti proteinu (A) a volných aminoskupin (B) kolagenových hydrolyzátů (CH) v závislosti na době inkubace. Data vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (SD). Údaje označené různými písmeny (ad) vykazují statisticky významné rozdíly v závislosti na inkubační době (str<>

KSL04