Epigenetický regulátor BRD4 se podílí na kadmiem spouštěné zánětlivé reakci v ledvinách potkana

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong a kol

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáteprodukty a Cistanche DHT

ABSTRAKTNÍ

Kadmium (Cd) bylo popsáno jako potenciální induktor zánětu, zatímco stále více důkazů ukazuje, že nepřiměřený zánět je faktorem přispívajícím kporanění ledvin. Výzkum zánětlivé reakce spouštěné Cd má tedy velký význam pro objasnění mechanismu nefrotoxicity vyvolané Cd. Bromodoména obsahující 4(BRD4) je důležitým epigenetickým regulátorem zapojeným do rozvoje mnoha zánětlivých onemocnění, ale jeho regulační role v Cd-spouštěnémzánětlivéodpověď zbývá upřesnit. Zde jsme zjistili, že léčba Cd u potkanů ​​Sprague-Dawley (2 mg/kg tělesné hmotnosti, ip, 5 po sobě jdoucích dnů) a u potkanůledvinová buňkalinie (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) indukovala transkripci zánětlivých cytokinů, kterou by mohl snížit JQ1 (inhibitor BRD4, 25 mg/kg ž.hm., ip , 3 po sobě jdoucí dny in vivo, 0,5 μM, 12 h in vitro) nebo BRD4 malá interferující RNA (siRNA, in vitro), což naznačuje, že BRD4 se účastní zánětlivé reakce spouštěné Cd. Dále naše studie objasnila role BRD4 v Cd-spouštěné zánětlivé odpovědi. Inhibice BRD4 snížila Cd-podporovanou nukleární translokaci NF-KB a aktivaci in vivo a in vitro. Cd zvýšil hladinu acetylace RelA K310 a zvýšil vazbu BRD4 na acetylovaný NF-KB RelA in vivo a in vitro, které byly zrušeny inhibicí BRD4. V souhrnu naše studie naznačuje, že BRD4 se podílí na Cd-spouštěné transkripci zánětlivých cytokinů zprostředkováním aktivace signální dráhy NF-KB a zvýšením vlastní vazby na acetylovaný NF-KB RelA u potkanů.ledvina,proto by BRD4 mohl být potenciálním terapeutickým cílem pro onemocnění ledvin vyvolané Cd.

klíčová slova: BRD4KadmiumZánětlivé ledvinycytokiny NF-KB JQ1

1. Úvod

Kadmium (Cd) je znečišťující látka těžkých kovů s vysokou toxicitou a dlouhým poločasem rozpadu. S rozvojem průmyslové výroby vzbuzuje obavy zvýšená hrozba znečištění Cd pro bezpečnost životního prostředí a lidské zdraví (Wang et al., 2020; Horiguchi a Oguma, 2016). Poté, co je Cd vstřebáno tělem, vyvolává multiorgánové poškození aledvinaje hlavním cílovým orgánem (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Dříve jsme systematicky ověřovali, že inhibice autofagie, oxidační stres a apoptóza synergicky přispívají k nefrotoxicitě způsobené Cd u potkanů ​​(Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Zánět je fyziologická reakce, která působí jako obranná reakce proti infekci nebo zranění, ale nekontrolované a nepřiměřené zánětlivé reakce vyvolané Cd mohou způsobit poškození, jako je poškození normální tkáně kolemjdoucích a podpora autoimunitních onemocnění (Hossein-Khannazer a kol., 2020; Zhang a kol. al., 2020). Zánětlivá reakce spouštěná Cd exacerbovala kardiovaskulární onemocnění a poškození jater, což naznačuje, že zánět může hrát důležitou roli v Cd zprostředkovanémledvinapatologických procesů (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigenetika označuje dědičné modifikace v genové expresi založené na ne-DNA sekvenčních změnách a reverzibilita těchto modifikací umožňuje objevování nových terapeutických cílů (Vendetti a Rudin, 2013). Rodina bromodomény a extraterminální domény (BET) zahrnuje bromodoménu obsahující 2 (BRD2), BRD3, BRD4 a bromodoménu specifickou pro varlata (BRDT), která se vyznačuje dvěma bromodoménami a vazbou na acetylované lysiny histonů a nehistonů ( Lochrin a kol., 2014; Chatterjee a Bohmann, 2018). Proteiny BET působí jako transkripční koaktivátor mnoha genů, a tak regulují buněčný cyklus, zánětlivou reakci, oxidační stres a další fyziologické procesy v různých patologických modelech (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 je zvláště dobře prozkoumaným členem rodiny proteinů BET a hromadící se výzkumy jej uvádějí jako nový epigenetický cíl při regulaci různýchonemocnění ledvinvčetně chronické nefritidy, diabetické nefropatie a experimentálního poškození ledvin (Zeng a Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). Bylo potvrzeno, že BRD4 se účastní transkripčního procesu závislého na nukleárním faktoru-κB (NF-κB) k regulaci zánětlivých reakcí u mnoha onemocnění (Xu a Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 může být rekrutován acetylovaným RelA (podjednotka NF-KB, gen kódující protein) na lysinu 310 (RelA-K310ac) přes jeho bromodomény, čímž se aktivuje cyklin-dependentní kináza 9 (CDK9) a fosforyluje se RNA polymeráza II k podpoře transkripce cílových genů NF-κB (Hajmirza et al., 2018). Nedávné studie naznačují, že inhibitory BRD4 by mohly být potenciální terapeutickou možností pro zánětlivá onemocnění. V modelech poranění míchy u potkanů ​​inhibice BRD4 zmírnila zánětlivou reakci a podpořila funkční obnovu mikroglií (Dey et al., 2019). Také inhibice BRD4 zrušila experimentální zánět ledvin u myších modelů unilaterální ureterální obstrukce, antimembránové bazální GN a infuze angiotensinu II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

Vzhledem k potenciálním prozánětlivým účinkům Cd a regulačním účinkům BRD4 na zánět jsme předpokládali, že BRD4 se účastní zánětlivé reakce spouštěné Cd. Jak se očekávalo, BRD4 zprostředkovává proces transkripce zánětlivých cytokinů v modelech krysích ledvin vystavených Cd. Naše studie odhaluje potenciální mechanismus v Cd-spouštěné zánětlivé odpovědi a poskytuje nový pohled na terapii Cd-indukované nefrotoxicity.

2. Materiály a metody

2.1. Chemikálie a protilátky

Chlorid kademnatý (CdCl2, bezvodý, 439800) byl zakoupen od Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). (plus)-JQ1 (HY-13030) byl získán od MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA). Souprava pro extrakci jaderného proteinu byla zakoupena od Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China, P0027). Účinná chemiluminiscenční souprava (ECL, 32209) a reakční činidlo pro stanovení proteinu kyseliny bicinchoninové (BCA, 23225) byly získány od Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, USA). Byly použity primární protilátky proti následujícím proteinům: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) byly zakoupeny od Proteintech Group (Wuhan, Čína); -aktin (3700 s), Histon H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), normální králičí IgG (IgG, 4394) byly zakoupeny od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); Byly zakoupeny BRD4 (ab128874), K (lysin) acetyltransferáza 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-KB RelA (acetyl K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488 – konjugovaný oslík 707 (anti-králičí anti-konjugovaný oslí 3ab15 z Abcam (Cambridge, Velká Británie). Druhé protilátky: Kozí anti-myší IgG (H plus L) (115-035-003) a kozí anti-králičí IgG (H plus L) (111-035-003) byly zakoupeny od Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA ).

2.2. Zvířata a pokusy

Dvacet čtyři krys Sprague-Dawley (samci, 6 týdnů staří, 110–120 g) bylo zakoupeno od Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, Čína). Krysám byl umožněn volný přístup k potravě a vodě v místnosti s kontrolovaným prostředím (24 ± 5 ​​stupňů, cyklus světlo/tma 12 hodin). Experimentální postupy byly použitelné pro Směrnici Rady Evropských společenství 2010/63/EU pro pokusy na zvířatech a všechny postupy byly schváleny Výborem pro péči o zvířata a použití na univerzitě v Yangzhou. Po jednom týdnu aklimatizace byly krysy náhodně rozděleny do čtyř skupin: (1) Kontrolní skupina: intraperitoneální injekce odpovídajícího rozpouštědla (fyziologický roztok nebo roztok 2-hydroxypropyl- -cyklodextrinu). (2) Skupina Cd: CdCl2 (2 mg/kg tělesné hmotnosti, rozpuštěný ve fyziologickém roztoku) podávaný intraperitoneální injekcí po dobu 5 po sobě jdoucích dnů pro vytvoření modelu intoxikace Cd. (3) Skupina Cd plus JQ1: CdCl2 (2 mg/kg tělesné hmotnosti) injekčně intraperitoneálně po dobu 5 po sobě jdoucích dnů k vytvoření modelu intoxikace Cd a JQ1 (25 mg/kg tělesné hmotnosti, rozpuštěný v 2-hydroxypropyl{{ 25}} roztok cyklodextrinu) injikovaný intraperitoneálně 6.–8. (4) Skupina JQ1: JQ1 (25 mg/kg tělesné hmotnosti) aplikovaný intraperitoneálně ve dnech 6.–8. Statistiky obsahu Cd v krysích sérech a tkáních ledvin byly uvedeny v tabulce S1, což odráží úspěšné zavedení krysích modelů vystavených Cd.

Po 8 dnech léčby byly krysy usmrceny cervikální dislokací v hluboké anestezii po 12 hodinách hladovění. Tkáně ledvin byly vyříznuty a 1 g tkáně z každé ledviny byl rychle uložen při -80 °C pro následnou analýzu Western blot a kvantitativní PCR (qPCR). Zbývající množství tkáně bylo rychle fixováno ve 4% paraformaldehydu (PFA) pro imunohistochemické (IHC) barvení.

2.3. Buněčná kultura a léčba

Buněčná linie potkaních ledvin (NRK{{0}}}E) byla získána od Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences. Buňky NRK-52E byly kultivovány na Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM, Gibco, 12800-017) obsahujícím 5 procent fetálního bovinního séra (FBS, Gibco, 10437-028), penicilin a streptomycin (1 00 U/mL) ve zvlhčeném stavu s 5 procenty CO2 a 95 procenty vzduchu při 37 stupních . CdCl2 (ultračistý ve vodě rozpuštěný) a JQ1 (rozpuštěný v dimethylsulfoxidu) byly odděleně skladovány při 4 stupních a -20 stupních a před použitím zředěny na pracovní roztoky. Experimentální design byl následující: (1) Buňky byly ošetřeny 0, 2,5, 5, 10 uM Cd po dobu 12 hodin nebo 5 uM Cd po dobu 0, 6, 12, 24 hodin pro provedení následných testů. (2) Buňky byly ošetřeny 5 μM Cd a/nebo 0,5 μM JQ1 po dobu 12 hodin pro provedení následných testů. (3) Buňky byly transfekovány siBRD4 a/nebo ošetřeny 5 μM Cd po dobu dalších 12 hodin, aby se provedly následné testy.

2.4. Malá interferující transfekce RNA

Transfekovali jsme 20 nM BRD4 malé interferující RNA (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) do buněk NRK-52E transfekčním činidlem Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, kat. č. 13778150) po dobu 24 hodin podle příruček k produktu. Byly použity následující sense siRNA:

siBRD4, s cílovou sekvencí 5'-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (siRNA negativní kontrola), s cílovou sekvencí 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western blotting

Vzorky ledvinové tkáně a NRK-52E buňky byly lyžovány v RIPA pufru obsahujícím inhibitory proteázy za účelem extrahování celkového proteinu. Jaderný protein byl předem připraven z čerstvých tkání a buněk a skladován při -80 stupních. Vzorky proteinů (20–30 ug na vzorek) byly separovány elektroforézou SDS-PAGE a poté přeneseny na polyvinylidenfluoridové membrány (Millipore, ISEQ00010). Membrány byly blokovány 5% odstředěným mlékem po dobu 90 minut a inkubovány 12 hodin při 4 stupních s následujícími primárními protilátkami: -aktin (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Poté byly membrány promyty TBST a inkubovány s odpovídajícími sekundárními protilátkami (1:10000) po dobu 90 minut při teplotě místnosti (RT). Membrány byly inkubovány elektrochemiluminiscencí (ECL, ThermoFisher Scientific) a stanoveny na Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Francie) a optická hustota byla analyzována pomocí ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).

2.6. Imunofluorescenční (IF) barvení

NRK{{0}}E buňky nasazené v 24-jamkové destičce byly pěstovány do asi 60 procent konfluence. Buňky byly ošetřeny 5 μM Cd a/nebo 0,5 μM JQ1 po dobu 12 hodin, poté fixovány PFA (4 procenta, 10 minut), permeabilizovány Tritonem X- 100 (0,1 procenta, 15 minut), blokovány BSA (2 procenta, 90 minut) při teplotě místnosti a inkubovány s primární protilátkou (NF-kB p65, ředění 1:50) přes noc při 4 stupních. Poté, co byly třikrát promyty PBS, byly buňky inkubovány se sekundární protilátkou (ředění 1:500) po dobu 90 minut as DAPI po dobu 5 minut při teplotě místnosti, poté byly buňky pozorovány pod konfokálním mikroskopem. NF-κB jaderná translokace byla analyzována ve třech nezávislých studiích.

2.7. qPCR

Celková RNA z ledvinových tkání a NRK-52E buněk byla extrahována pomocí soupravy RNAiso Plus (Takara Bio, Shiga, Japonsko). 1 ug celkové RNA byl použit k syntéze cDNA 1. řetězce podle manuálu výrobce (Roche, Basel, Švýcarsko). Byly odebrány 2 μl komplementární DNA (cDNA) na jamku k detekci relativních hladin mRNA pomocí systému LightCycler® 96 Real-Time PCR System (Roche). Vypočítejte relativní hladiny mRNA podle rovnice 2-△△CT. Primery byly uvedeny v tabulce S2. -aktin byl potkaní referenční gen.

2.8. Koimunoprecipitace (Co-IP)

Tkáně ledvin a buňky NRK{0}}E byly lyžovány v čerstvě připraveném pufru pro lýzu buněk (20 mM HEPES–KOH pH 7,5, 150 mmol/l NaCl, 2 mmol/l EDTA, 1 procento Triton X{{8} }) obsahující PMSF. Proteinové G kuličky (100 ul na vzorek, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) byly smíchány s 2 ug BRD4, RelA-K310ac nebo IgG protilátky na vzorek a rotovány po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Poté byly celkové proteinové lyzáty inkubovány s komplexem kuličky-protilátka přes noc při 4 stupních. Po trojnásobném promytí pufrem pro lýzu buněk byly imunoprecipitáty resuspendovány ve vzorkovém pufru 1 x SDS PAGE pro konfiguraci vzorků. Cílové proteiny byly detekovány pomocí western blotu s primárními protilátkami anti-BRD4 a anti-RelA K310ac.

2.9. Statistická analýza

Všechna data byla získána z alespoň tří nezávislých experimentů a vyjádřena jako průměr ± SEM, pokud není uvedeno jinak. Experimentální skupiny byly porovnány nepárovým dvoustranným Studentovým t-testem nebo jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA) pomocí SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Významnost byla stanovena na p <>

3. Výsledky

3.1. Cd indukuje expresi zánětlivých cytokinů in vivo a in vitro

Bylo prokázáno, že Cd jako látka znečišťující životní prostředí způsobuje poškození ledvin regulací řady biologických procesů (Wang et al., 2019c). V této studii byly zkoumány změny v hladinách transkripce zánětlivých cytokinů po expozici Cd, aby se zjistilo, zda se zánět podílí na nefrotoxicitě vyvolané Cd. Data ukázala, že expozice Cd významně zvýšila hladiny interleukinu (IL)-1 a proteinu tumor nekrotizujícího faktoru (TNF) v buňkách NRK-52E (obr. 1A-B) a tkáních ledvin potkana (obr. 1C -D). Mezitím, jak je znázorněno na obr. 1E-F, expozice Cd zvýšila transkripční hladiny zánětlivých cytokinů (IL-1, IL-6, TNF- a (protein chemoatraktant monocytů-1) MCP -1) in vivo a in vitro. Tato zjištění naznačují, že Cd indukuje expresi zánětlivých cytokinů v ledvinách potkana.

3.2. BRD4 se účastní Cd-indukovaného transkripčního procesu zánětlivých cytokinů

BRD4 je nově popsaný epigenetický regulátor, který se váže na acetylované histony nebo nehistony a reguluje zánětlivé procesy u mnoha onemocnění. Zde byly použity inhibitory BRD4 JQ1 a BRD4-siRNA ke zkoumání role BRD4 na zánětlivou reakci spouštěnou Cd. Data ukázala, že Cd-zvýšený IL -1 a TNF-proteinové hladiny byly down-regulovány ošetřením JQ1 in vivo a in vitro (obr. 2A–D) a knockdownem BRD4 in vitro (obr. S1A-B). Mezitím léčba JQ1 významně inhibovala hladiny transkripce IL-1, IL-6, TNF- a MCP-1 v buňkách NRK-52E zesílené Cd (obr. 2E) a tkáně krysích ledvin (obr. 2F). Také, BRD4 knockdown významně snížil Cd-zvýšené transkripční hladiny zánětlivých cytokinů v NRK-52E buňkách (obr. S1C). Souhrnně tato zjištění naznačují, že BRD4 je kritickým regulátorem Cd-spouštěné zánětlivé reakce v ledvinách potkana.

3.3. Hladiny exprese BRD4 zůstávají po expozici Cd nezměněny

Dále byly detekovány změny v hladinách exprese BRD4 po expozici Cd. Buňky NRK-52E byly ošetřeny Cd v koncentračním gradientu a krysám byl intraperitoneálně injikován Cd po dobu 5 dnů, aby se objasnil účinek Cd na expresi BRD4 v ledvinách in vivo a in vitro. Výsledky ukázaly, že hladiny proteinu BRD4 byly nezměněny jak v buňkách NRK-52E vystavených Cd (obr. 3A-B), tak v tkáních ledvin potkana (obr. 3C-D). Také hladiny BRD4 mRNA byly po expozici Cd nezměněny (obr. 3E-F). Tyto výsledky ukazují, že BRD4 zprostředkovává Cd-spouštěnou zánětlivou odpověď nezávisí na změnách v úrovni exprese.

3.4. BRD4 reguluje Cd-podporovanou jadernou translokaci NF-KB

V naší studii byly zkoumány role BRD4 v Cd-spouštěné zánětlivé odpovědi. Změna signální dráhy NF-κB úzce souvisí s transkripcí zánětlivých cytokinů (Chi et al., 2021). Naše studie zjistila, že BRD4 se podílí na Cd-regulované jaderné translokaci a aktivaci NF-KB. Nejprve byla stanovena subcelulární lokalizace NF-KB barvením IF a barvením IHC. Data na obr. 4A a D ukázala, že JQ1 inhibuje Cd-podporovanou NF-KB jadernou translokaci v NRK-52E buňkách a tkáních krysích ledvin. Mezitím výsledky western blotu ukázaly, že JQ1 významně snížil hladiny jaderného proteinu NF-KB in vivo (obr. 4B-C) a in vitro (obr. 4E-F) zvýšené Cd. Podobně BRD4 knockdown také významně inhiboval Cd-podporovanou NF-κB jadernou translokaci (obr. S2A) a snížil Cd-zvýšené hladiny jaderného proteinu NF-KB (obr. S2B-C) v NRK-52E buňkách. Celkově vzato, inhibice BRD4 může snížit Cd-podporovanou jadernou translokaci NF-KB, což naznačuje, že BRD4 zprostředkovává aktivaci signální dráhy NF-KB v ledvinách po expozici Cd.

3.5. Cd zvyšuje hladiny acetylace RelA K310

Studie potvrdily, že BRD4 se váže na acetylovaný RelA K310 prostřednictvím svých bromových domén, aby reguloval transkripci závislou na NF-κB (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). Tak byla detekována hladina acetylace RelA K310 a exprese dvou enzymů. Data ukázala, že hladiny proteinu RelA-K310ac a acetylázy Ep300 kontinuálně klesaly se zvýšenou koncentrací Cd, zatímco hladina proteinu deacetylázy Sirt1 se postupně zvyšovala v buňkách NRK-52E (obr. 5A-B) a tkáních ledvin potkana (obr. 5C-D). Také hladiny mRNA Ep300 a Sirt1 vykazovaly stejné trendy (obr. 5E-F). Tyto výsledky naznačují, že Cd podporuje hladinu acetylace RelA K310, takže BRD4 se může podílet na transkripci zánětlivých cytokinů spouštěných Cd v ledvinách.

3.6. Cd zvyšuje vazbu BRD4 na RelA-K310ac pro zvýšení jeho transkripční funkce

Vazba na acetylační místa je základem pro regulaci transkripce BRD4 (Huang et al., 2009). Pro ověření, zda Cd reguluje funkci BRD4 zvýšením vazby BRD4 na RelA-K310ac, byla interakce mezi RelA-K310ac a BRD4 detekována prostřednictvím Co-IP. Data na obr. 6A ukázala, že Cd významně zvýšilo interakci mezi RelA-K310ac a BRD4 v buňkách NRK-52E, která byla zmírněna ošetřením JQ1 nebo knockdownem BRD4. Stejný trend byl také pozorován u tkání krysích ledvin (obr. 6B). Tyto výsledky ukazují, že Cd zvyšuje vazbu BRD4 na RelA-K310ac, což podporuje transkripci závislou na NF-κB a následně přispívá k zánětlivé reakci spouštěné Cd.

4. Diskuze

Cd bylo hlášeno jako potenciální spouštěč zánětu kvůli své vysoké toxicitě, zatímco přesný mechanismus stále není plně objasněn (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Naše studie potvrdila, že Cd indukuje expresi zánětlivých cytokinů v renálních buňkách potkana, a zjistila, že BRD4, epigenetický cíl, který má kritické funkce v řadě buněčných procesů včetně zánětu, přispívá k zánětlivé odpovědi spouštěné Cd. Další experimenty ukázaly, že BRD4 se podílí na aktivaci signální dráhy NF-KB podporované Cd. Cd také zvýšil hladinu acetylace RelA K310, čímž zvýšil vazbu BRD4 na acetylovaný NF-KB RelA, aby podpořil transkripci zánětlivých cytokinů závislých na NF-KB.

Zánět je jedním z přirozených obranných mechanismů proti exogenním chemikáliím, zatímco nekontrolovaná a nepřiměřená zánětlivá reakce může poškodit normální tkáně a vyvolat autoimunitní onemocnění (Jian et al., 2018). Biologické markery zánětu se zvýšeným Cd byly často spojovány s různými onemocněními. Studie ukázaly, že zánět vyvolaný Cd se podílí na aterogenezi (Tinkov et al., 2018). Cd navíc podporovalo expresi zánětlivých cytokinů, které přispěly k poškození plicní a testikulární tkáně a indukovaly hepatotoxicitu (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Tyto škodlivé účinky jsou v souladu s našimi výsledky, že zánětlivá reakce je zapojena do Cd-indukovaného poškození ledvin. Stále více výzkumů se zaměřuje na mechanismy výskytu Cd-indukovaného zánětu. Jako dobře prostudovaný člen rodiny proteinů BET hraje BRD4 kritickou roli v mnoha biologických procesech včetně zánětu. Zde byly JQ1 (inhibitor BRD4) a siRNA použity k deregulaci funkční aktivity BRD4 a zjistilo se, že inhibice BRD4 snížila Cd-indukovanou transkripci zánětlivých cytokinů v ledvinách potkana, což naznačuje, že BRD4 se účastní zánětlivé reakce spouštěné Cd . Obecně se má za to, že dysregulace exprese BRD4 je klíčovou událostí při výskytu zánětlivé reakce. U poranění míchy, patologické srdeční hypertrofie a dalších onemocnění souvisejících se zánětem přispěla neuspořádaná exprese BRD4 k expresi zánětlivých cytokinů (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). Cd však neměl žádný vliv na hladiny exprese BRD4 za současných experimentálních podmínek, což nás vedlo k úvahám, zda BRD4 zprostředkovává zánětlivou reakci spouštěnou Cd jinými cestami.

NF-κB je důležitým regulačním faktorem v zánětlivých procesech a je zodpovědný za kontrolu exprese mnoha zánětlivých mediátorů (Lawrence, 2009). Studie byly hlášeny, že BRD4 se podílí na regulaci signální dráhy NF-KB. Huang a kol. (2017) navrhli, že BRD4 reguloval aktivaci NF-κB zprostředkovanou IKK prostřednictvím drah p38 a JNK-MAPK. Wang a kol. (2019a) zjistili, že BRD4 knockdown nebo léčba JQ1 blokovala lipopolysacharidem (LPS) aktivovanou NF-KB signální dráhu v mikrogliích. Meng a kol. (2014) prokázali, že léčba JQ1 blokovala expresi zánětlivých cytokinů inhibicí aktivace NF-κB v buňkách RAW 264.7 ošetřených LPS. Tyto zprávy ukázaly, že BRD4 zprostředkovává aktivaci NF-KB v mnoha modelech zánětu, zatímco inhibice BRD4 je účinným terapeutickým přístupem k protizánětlivým účinkům. V současné studii inhibice BRD4 blokovala jadernou translokaci NF-KB v tkáních potkaních ledvin a NRK-52E buňkách vystavených Cd, což naznačuje, že BRD4 zprostředkovává Cd-aktivovanou NF-KB signální dráhu.

Typicky, poté, co byl NF-KB aktivován různými stimuly a translokován do jádra, se BRD4 váže na acetylovaný NF-KB RelA v místě K310, což zvyšuje jeho stabilitu a transkripční aktivitu v jádře (Hajmirza et al., 2018). Hladina acetylace RelA K310 tedy ovlivňuje regulační funkci BRD4 na zánětlivou odpověď. V hipokampálních neuronech zprostředkovávala deacetyláza Sirt1 deacetylaci RelA K310 k regulaci exprese BACE1, která přispěla k produkci neuronálního amyloidu (Flores-Leon et al., 2019). V buňkách glioblastomu stres fotodynamické terapie down-reguloval deacetylázu Sirt1 a aktivoval acetylázu Ep300, což zvýšilo hladiny RelA-K310ac a vedlo ke zvýšené produkci oxidu dusnatého pro přežití (Fahey et al., 2019). Naše studie zjistila, že Cd podporuje hladinu acetylace RelA K310 zvýšením exprese Ep300 a snížením exprese Sirt1, což naznačuje, že Cd ovlivňuje regulační funkci BRD4 zvýšením úrovní acetylace RelA K310.

Naše výsledky ukázaly, že léčba JQ1 byla účinnější než knockdown BRD4 při zmírnění zánětlivé reakce spouštěné Cd. JQ1 má vysokou vazebnou afinitu k BRD4 a může téměř úplně blokovat vazbu BRD4 na chromozom, zatímco siBRD4 může interferovat pouze s expresí proteinu BRD4, aby snížil vazbu BRD4 na cílové místo, což naznačuje, že BRD4 zprostředkovává zánětlivou reakci spouštěnou Cd může záviset na vazba s acetylovaným NF-KB RelA. Nedávné studie ukázaly podobný regulační mechanismus: po jaderné translokaci a aktivaci NF-κB pak BRD4 interagoval s acetylovaným RelA, aby koaktivoval transkripční aktivaci NF-KB (Huang et al., 2009). RelA–BRD4 byl rekrutován do cílových promotorů NF-κB v různých stavech zánětlivé stimulace, zatímco léčba JQ1 působila tak, že zabránila vazbě BRD4 na acetylovaný NF-κB RelA, čímž se snížila transkripční aktivita NF-κB (Zou et al., 2014). Naše výsledky ukázaly, že inhibice BRD4 blokuje Cd zesílenou interakci mezi BRD4 a RelA-K310ac v ledvinách potkana, což podporuje naše výše uvedené výsledky, že inhibice BRD4 potlačuje Cd-indukovanou transkripční aktivitu NF-KB, což naznačuje, že Cd zvyšuje vazbu BRD4 na acetylované NF-KB RelA ke zvýšení transkripce zánětlivých cytokinů.

V souhrnu naše studie odhalila regulační mechanismy BRD4 v Cd-spouštěné zánětlivé odpovědi v ledvinách potkana: (1) BRD4 zprostředkovává Cd-indukovanou NF-KB jadernou translokaci a aktivaci. (2) Cd zvyšuje hladiny acetylace RelA K310 a zvyšuje vazbu BRD4 na acetylovaný NF-KB RelA, což podporuje transkripci zánětlivých cytokinů závislých na NF-KB. Kromě toho inhibice BRD4 významně zmírnila hladiny zánětlivých cytokinů zvýšené Cd, což naznačuje, že cílený BRD4 má potenciál být vyvinut jako účinný prostředek pro léčbu zánětlivých onemocnění včetně nefritidy vyvolané Cd.

prohlášení o autorském příspěvku CRediT

Zhongguo Gong: Konceptualizace, Metodologie, Vizualizace, Formální analýza, Validace, Vyšetřování, Formální analýza, Správa dat, Psaní – originální návrh. Gang Liu: Konceptualizace, Metodologie, Vizualizace, Správa dat, Psaní – originální návrh, Administrace projektu, Získávání finančních prostředků. Wenjing Liu: Software, zdroje, metodologie, formální analýza. Hui Zou: administrace projektu, supervize. Ruilong Song: Software, Formální analýza, Supervize. Hongyan Zhao: Software, formální analýza, supervize. Yan Yuan: Dohled. Jianhong Gu: Dohled. Jianchun Bian: Financování akvizice, supervize. Jiaqiao Zhu: Psaní – recenze a úpravy, supervize. Zongping Liu: Psaní – recenze a úpravy, supervize,

Administrace projektu, Získávání finančních prostředků, Konceptualizace.

Prohlášení o konkurenčním zájmu

Autoři prohlašují, že nemají žádné známé konkurenční finanční zájmy nebo osobní vztahy, které by se mohly zdát ovlivnit práci uvedenou v tomto článku.

Potvrzení

Tato práce byla podpořena Čínskou národní nadací pro přírodní vědy (č. 31872533, 31902329, 32072933), Čínským národním klíčovým výzkumným a vývojovým programem (č. 2016YFD0501208) a projektem Prioritního akademického programu rozvoje vysokoškolského vzdělávání Jiangsu Instituce (PADP). Rukopis byl upraven pro správný anglický jazyk, gramatiku, interpunkci, pravopis a celkový styl jedním nebo více vysoce kvalifikovanými rodilými anglicky mluvícími editory v ELIXIGEN.

Reference

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Mateří kašička zmírňuje kadmiem indukovanou nefrotoxicitu u samců myší. Sci. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Současná expozice netoxickým hladinám kadmia a fluoridu indukuje hepatotoxicitu u potkanů ​​prostřednictvím spouštění mitochondriálního oxidačního poškození, apoptózy a NF-kB drah. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Prášek ze semen pískavice zmírňuje poškození varlat vyvolané kadmiem a hepatotoxicitu u samců potkanů. Exp. Toxicol. Pathol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting na Nrf2: jak může signalizace Nrf2 ovlivnit terapeutické aktivity inhibitorů proteinu BET. Bioessays 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Role selenoproteinu S při tvorbě neutrofilních extracelulárních pastí závislých na reaktivním kyslíku indukované selenem- nedostatečná arteritida. Redox Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 řídí vývoj hematopoetických kmenových buněk a moduluje zánětlivé reakce makrofágů. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., nar, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Expozice kadmiu je spojena s rozpustným receptorem aktivátoru plazminogenu urokinázy, cirkulujícím markerem zánětu a budoucího kardiovaskulárního onemocnění. Environ. Res. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Upstream signalizační události vedou ke zvýšené produkci oxidu dusnatého pro přežití ve fotodynamicky napadených glioblastomových buňkách. Volný Radic. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Variace různých metabolitů a těžkých kovů v Oryza sativa L., související s chronickým onemocněním ledvin neznámé etiologie na Srí Lance. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon,M.,Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Deplece NAD(plus) vyvolaná kyselinou palmitovou je spojena se sníženou funkcí SIRT1 a zvýšenou expresí BACE1 v hipokampálních neuronech. Neurochem. Res. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. Léčba kadmiem vyvolává echinokokózu, poškození DNA, zánět a apoptózu v srdeční tkáni albínských potkanů ​​Wistar. Environ. Toxicol. Pharmacol. 59, 43–52. zánět a rakovina. Biomedicína 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Akutní expozice kadmiu vyvolává prodlouženou neutrofilii spolu se zpožděnou indukcí faktoru stimulujícího kolonie granulocytů v játrech myší. Oblouk. Toxicol. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Účinky expozice kadmiu při indukci zánětu. Immunopharmacol. Imunotoxikol. 42 (1), 1–8.