Účinnost a bezpečnost Pinocembrinu u ovčího modelu plicní fibrózy vyvolané bleomycinem

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní

Primárníflavonoid, pinocembrin, se předpokládá, že má různé lékařské použití, které souvisí s jeho uváděným antioxidantem,protizánětlivé, antimikrobiální a protirakovinné vlastnosti. Některé studie uvádějí, že tento flavonoid má antifibrotické účinky. V této studii jsme zkoumali, zda by pinocembrin bránil fibróze, tlumil zánět a zlepšovalplícefunkce ve velkém zvířecím modelu plicní fibrózy. Fibróza byla indukována ve dvou lokalizovaných plicních segmentech u každé z 10 ovcí účastnících se studie. Toho bylo dosaženo pomocí dvou infuzí bleomycinu podávaných bronchoskopicky ve dvoutýdenním intervalu. Další segment plic u stejné ovce byl ponechán neošetřený a byl použit jako zdravá kontrola. Zvířata byla držena po dobu o něco více než 5 týdnů po poslední infuzi bleomycinu. Pino-cembrin, izolovaný z listů eukalyptu, byl podáván do jednoho ze dvou segmentů plic poškozených bleomycinem v dávce 7 mg. Tato dávka byla podávána jednou týdně po dobu 4-týdnů, počínaje týden po poslední infuzi bleomycinu. Compliance plic (jako měřítko ztuhlosti) se významně zlepšila po čtyřech týdenních podáváních pinocembrinu do segmentů plic poškozených bleomycinem. V bronchoalveolární laváži segmentů plic s infuzí bleomycinu, které byly léčeny pinocembrinem, byly významně nižší počty neutrofilů a zánětlivých buněk. Ve srovnání s plicními segmenty poškozenými bleomycinem bez medikamentózní léčby bylo podávání pinocembrinu spojeno s významně nižším počtem imunopozitivních CD8t a CD4 plus T buněk v plicním parenchymu. Histopatologické skórovací údaje ukázaly, že léčba pinocembrinem byla spojena s významným zlepšením zánětu a celkového skóre patologie. Hydroxyprolinová analýza ukázala, že podávání pinocembrinu nesnížilo zvýšený obsah kolagenu, který byl v tomto modelu indukován bleomycinem. Analýzy řezů obarvených Massonovým trichromem ukázaly, že léčba pinocembrinem významně snížila obsah pojivové tkáně v segmentech plic vystavených bleomycinu ve srovnání s plícemi s infuzí bleomycinu, které nedostaly pinocembrin. Nápadné protizánětlivé a mírné antifibrotické remodelační účinky podávání pinocembrinu byly pravděpodobně spojeny se schopností sloučeniny zlepšit plicní patologii a funkční komplianci v tomto zvířecím modelu plicní fibrózy.

Kliknutím získáte další informace

Úvod

Primárníflavonoid, pinocembrin, byl identifikován a izolován z řady rostlinných druhů. Předpokládá se, že tato bioaktivní molekula má různé lékařské využití, které souvisí s jejím uváděným antioxidantem,protizánětlivé, antimikrobiální a protirakovinné vlastnosti [1-7]. Důležité je, že pinocembrin má antifibrotické vlastnosti u řady různých zvířecích modelů onemocnění. Například pinocembrin snižuje ventrikulární fibrózu [8] u potkaního modelu deprese a snižuje fibrózu síní u potkaního modelu infarktu myokardu [9]. Podobně v experimentálním potkaním modelu jaterní fibrózy vyvolané chloroformem snížilo orální podávání pinocembrinu expresi kolagenu a alfa-SMA (používaného jako marker diferenciace myofibroblastů) jako měřítka fibrózy [10]. Nedávná studie prokázala

Pinocembrin zmírňuje bleomycinem indukovanou kožní fibrózu u myší a potlačuje proliferaci, migraci a invazi keloidních fibroblastů a myších primárních dermálních fibroblastů in vitro [11]. Pinocembrin indukoval tyto antifibrotické účinky prostřednictvím downregulace signálních drah NF-x a TGF- 1/Smad [10,11].

Vzhledem ke známým antifibrotickým účinkům pinocembrinu jsme se snažili zjistit, zda pinocembrin brání fibróze a zlepšujefunkce plicna velkém zvířecím modelu plicní fibrózy. Fyziologicky a farmakologicky relevantní model plicní fibrózy byl vyvinut jako vehikulum pro zkoumání mechanismu (mechanismů) základního onemocnění pro lidský stav idiopatické plicní fibrózy (IPF) [12,13]. Byl také užitečný pro testování nových způsobů léčby plicní fibrózy [14-16].

Idiopatická plicní fibróza (IPF) je devastující chronické plicní onemocnění charakterizované progresivním zjizvením plic v důsledku bujné akumulace extracelulární matrix (ECM) v plicním parenchymu [17]. Prognóza IPF je velmi špatná, medián přežití pacientů po diagnóze je pouze 3-5 let [18]. Současná dostupná farmakologická léčba je omezena na Pirfenidon a Nintedanib, léky, u kterých bylo prokázáno, že pouze zpomalují progresi onemocnění, aniž by ji zastavily. Kromě toho existují významné nežádoucí vedlejší účinky spojené s těmito dvěma léky. Proto existuje neuspokojená potřeba nových účinných léčebných postupů pro tento stav.

Cílem této studie bylo zhodnotit terapeutickou účinnost a bezpečnost pinocembrinu na ovčím modelu plicní fibrózy indukované bleomycinem vyvinutém v naší laboratoři(12). Konkrétně byla provedena studie, aby se zjistilo, zda lokální plicní podávání pinocembrinu významně zmírnilo fibrózu, zánět a histopatologii ve specifických plicních segmentech po indukci fibrózy bleomycinem. Důležité je, že jsme určili, zda lokální podávání pinocembrinu významně zlepšilo fyziologickou funkci specifických plicních segmentů s bleomycinem indukovanou fibrózou.

Materiály a metody

Indukce fibrózy v segmentech ovčích plic

V této studii jsme použili celkem 10 ovcí. Fibrózu jsme indukovali ve dvou plicních segmentech každé ovce podobným způsobem jako v našich předchozích studiích [12,13]. Pomocí tohoto zavedeného postupu (viz podrobnosti níže) byla fibróza omezena na malé, izolované oblasti v plicích, přičemž zbývajících 90-95 procent zdravých nepostižených plic se ujal normální respirační funkce.

Všechny ovce ve studii byly provokovány 2 jednotlivými dávkami bleomycinu (3 jednotky) na plicní segment s odstupem 2 týdnů a zvířata byla držena po dobu něco málo přes 5 týdnů po poslední dávce bleomycinu. Postup podávání zahrnoval vložení bronchoskopu do plicních segmentů v pravé a levé plíci a poté pomalu infuzí přes port pro biopsii bronchoskopu bleomycin do dvou segmentů, jak je znázorněno na Obr.

Načasování infuzí bleomycinu, odběru krve, odběru bronchoalveolární laváže a testování funkce plic a aplikace pinocembrinu jsou podrobně popsány v Eig2. Všechny experimentální postupy na zvířatech byly schváleny etickou komisí pro zvířata University of Melbourne (ID číslo schválení pro etiku zvířat: 2015209.1). Tyto experimentální postupy a časové osy spojené s prací na zvířatech byly navrženy tak, aby zmírnily a minimalizovaly utrpení ovcí použitých ve studii. Zejména počet bronchoskopických výkonů byl snížen na naprosté minimum, které by umožnilo úspěšnou interpretaci dat.

Izolace a strukturální potvrzení pinocembrinu

Pinocembrin byl purifikován z methanolových extraktů listů odebraných z tříletého Eucalyptus pressiana subsp. Sazenice pressiana byly pěstovány na experimentálním pozemku v kampusu University of Melbourne Dookie (36° 23'3"S, 145° 42'52"E). Semena zakoupená od Nindethana Seed Company (King River, Austrálie) byla shromážděna z Woodenellup, Západní Austrálie, a sazenice byly vypěstovány a přesazeny na pozemek, jak je popsáno v [19]. Vzorkované listy byly sušeny v sušárně při 5{{40}} stupních po dobu 48 hodin, než byly rozemlety na jemný prášek pomocí mlýnku IKA MF10 vybaveného sítem 1 mm. Rozemletá tkáň (100 g) byla umístěna do celulózových náprstků Kinesis XK (Antylia Scientific, Chicago, USA) a podrobena Soxhletově extrakci 100% MeOH (200 ml) po dobu 8 hodin. MeOH extrakty byly poté zakoncentrovány na přibližně 50 ml za použití rotační odparky. Alikvoty koncentrovaných extraktů (2 ml) byly podrobeny flash chromatografii na systému Revelers X2 (Buchi AG, Flawil, Švýcarsko) vybaveném FlashPure C18 RP-WP 12g patronou (Buchi). Použitým systémem rozpouštědel byl gradient acetonitrilu (MeCN) a vody z 30-100 procent MeCN během 5 minut s ekvilibračním časem 1 min (obr. S1). Frakce obsahující pinocembrin byla detekována při 283 nm a shromážděna. Frakce z několika Flash běhů byly spojeny, MeCN odstraněn rotačním odpařováním a pinocembrin byl vysušen pomocí lyofilizace. Struktura pinocembrinu byla potvrzena pomocí ESI-LCMS a NMR spektroskopie, jak je popsáno v [19] s porovnáním s komerčním standardem (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Pinocembrin: Světle žluté krystaly z MeCN/H, O.UVXmax MeCN（nm）∶ pás-I325 nm, pás-II289 nm. 'H NMR（600 MHz,CDCI）∶55,36（1H,dd,J13,0,3,0 Hz,H-2）,52,76）(1H,dd,J17,1,3,1Hz,H{ {51}}a）,δ3,02（1H,dd,J17,1,13,1 Hz,H-3b）,δ5,92（1H,d,2,2Hz,H-6）, δ5,94（1H,d,2,2Hz,H-8）.ESI-MS（fragmentor 150V,Skimmer 65V)m/z(rel. int. procenta):255,0673([MH],100),213,0565 ([M-42-H],19), 151,0037([M-104-H],16), 257,0811([M plus H],100), 153,0167([M-104 plus H],2). Čistota izolovaného pinocembrinu na základě hmotnosti byla kvantifikována minimálně na 96 procent pomocí HPLC-PDA ve srovnání s komerčním standardem (obr. S2A a S2B).

Podávání pinocembrinu do segmentů ovčích plic

Každý týden dávkovacího režimu bylo 7 mg pinocembrinu infundováno do jednoho kaudálního plicního segmentu u každé ovce podstupující studii (obr. 1). Tato hmotnost dávky pinocembrinu byla založena na dříve publikované studii, která ukázala, že 50 mg pinocembrinu na kg tělesné hmotnosti byla nejúčinnější dávka pro zmírnění symptomů onemocnění v tomto zvířecím modelu [20]. Dávka 7 mg pinocembrinu umožnila skutečnost, že pouze přibližně 150 g plicního segmentu na ovci bylo ošetřeno při -50 mg/kg. Bioaktivní látka byla rozpuštěna v 10% DMSO a podávána jednou týdně po dobu čtyř týdnů, jak je znázorněno na obr. 2. Pro kontrolní účely byl plicní segment v protilehlé plíci použit jako kontrola pozitivní na bleomycin, bez léčiva. 1. Bioaktivní molekuly ve vehikulu byly podávány jako 5ml infuze přes bioptický port bronchoskopu. Všimněte si, že pro vynulování jakýchkoli malých rozdílů (např. fyziologických nebo anatomických atd.) mezi levou a pravou plící byly infuze pinocembrinu náhodně rozděleny mezi levý a pravý kaudální segment plic. Polovina zvířat (n=5 ovcí) dostala pinocembrin do pravých ocasních plicních segmentů, zatímco druhá (n=5 ovcí) dostala pinocembrin do levých kaudálních plicních segmentů. Pravý mediální segment plic byl ponechán neošetřený a použit pro zdravou plicní kontrolní tkáň, ze které byly odebrány vzorky při pitvě (obr. 1).

Postupy odběru vzorků bronchoalveolární laváže

Pro každý z bronchoalveolárních (BAL) odběrů vzorků v časových bodech uvedených na obr. 2 byl endoskop manipulován do specifického segmentu plic pro odběr vzorků, obvykle procházejících přibližně 3 až 4 větvemi dýchacích cest. Pro odběr vzorků BAL bylo 10 ml sterilního fyziologického roztoku infundováno přes bioptický port endoskopu do specifického plicního segmentu a poté odebráno do injekční stříkačky přes stejný port. Tímto postupem bylo získáno 3 až 5 ml tekutiny BAL. Metoda odběru vzorků odebírala buňky pro analýzy z malých dýchacích cest a alveolárních lumenů specifického segmentu plic, kam byl bronchoskop navigován. Buňky BAL z každého segmentu byly odstředěny na podložní sklíčko a obarveny pro diferenciální počítání buněk zánětu pomocí Hem-Quik, jak bylo popsáno dříve [13].

Testování a analýzy funkce plic

Funkce plic byla měřena v popsaných plicních segmentech v časových bodech uvedených na obr. 2. Funkce plic byla hodnocena ve všech testovaných plicních segmentech (levý a pravý ocasní lalok a mediální lalok u každé ovce). Funkční kapacita plicních segmentů byla měřena pomocí endoskopu pomocí publikovaného postupu [12,13]. Parametr plicní funkce hodnocený v této studii byl označován jako poddajnost v plicním segmentu (zkráceně Cseg). Obecně je poddajnost měřítkem toho, jak snadné je nafouknout plíce. Špatně poddajná plíce se označuje jako ztuhlá plíce, která se obvykle obtížněji nafukuje.

Odběr krve

Plná krev byla odebrána na začátku před indukcí fibrózy a na konci experimentu před eutanazií experimentálních zvířat, jak je znázorněno na obr. 2, odebráním krve z jugulární žíly do zkumavky obsahující heparin. Krev byla zpracována pro analýzu krevního obrazu.

Izolace a analýzy plicní tkáně

Ovce byly usmrceny něco málo přes 5 týdnů po poslední dávce bleomycinu (počátek týdne 12), jak je znázorněno na Obr. Eutanazie byla vyvolána předávkováním barbiturátem podaným IV v ml na 2 kg tělesné hmotnosti podle doporučení výrobce (Lethabarb, Virbac Animal Health Pty Ltd. Jednotlivé segmenty byly poté nafouknuty směsí 1:1 OCT (Optimal Cutting Temperature, Tissue-Tek) a sterilního roztoku PBS pod tlakem přibližně 20 cm/H, O[13]. Několik sériových příčných řezů nafouknutý segment byl fixován v 10% neutrálně pufrovaném formalínu a zpracován v parafínu pro histopatologické hodnocení.Zbývající plicní řezy byly vloženy do OCT a zmrazeny v kryo-formách na hliníkových člunech plovoucích na kapalném dusíku.

Tkáňové řezy zalité v parafínu （5 μm） byly obarveny hematoxylinem a eosinem Y (H&E) pro obecnou histologii a barvením Massonovým trichromem k identifikaci změn obsahu kolagenu v plicním parenchymu.

Imunohistochemie

Na zmrazených řezech byla provedena imunohistochemická lokalizace CD4* a CD8 T lymfocytů. Řezy plicní tkáně （5 μm） byly fixovány ledově studeným ethanolem; endogenní peroxidy byly blokovány pomocí H, O, roztoku a řezy byly poté inkubovány s primárními protilátkami (monoklonální myší anti CD4 (čisté) a monoklonální myší anti CD8 (čisté)) ve vlhké komoře po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Po inkubaci s primárními protilátkami

řezy byly poté třikrát promyty PBS a inkubovány se sekundární protilátkou (králičí antimyší IgG(HRP)(ab6728)) (1:100; Abcam, Melbourne, Austrálie) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Pro kontrolu specificity byly během IHCrun zahrnuty izotypové kontroly s použitím biologicky irelevantní SBU-3 protilátky stejného izotypu. Řezy byly kontrastně obarveny Mayerovým hematoxylinovým roztokem po dobu 20 sekund. Komplex antigen-protilátka byl vizualizován 3,3'-diaminobenzidinem. Nakonec byly řezy dehydratovány ethanolem, vyčištěny v xylenu a upevněny v DPX.

Histopatologické skóre

Histopatologie plicního parenchymu byla hodnocena pomocí semikvantitativního skórovacího systému, jak bylo popsáno dříve [12,13]. Stručně, histologická sklíčka byla všechna zaslepena, takže posuzovatel neznal léčebné skupiny. U každého řezu obarveného H&E bylo hodnoceno 10 po sobě jdoucích nepřekrývajících se polí při 200násobném zvětšení na základě hodnotících kritérií pro fibrózu, zánět a celkové skóre patologie, jak bylo uvedeno dříve [12,13]. Oblasti byly vybrány mimo velké dýchací cesty a velké krevní cévy. Skóre ze všech deseti polí pak byla zprůměrována, aby se získala reprezentativní skóre pro parametry hodnocené v řezu segmentu plic.

Analýza koncentrace kolagenového proteinu pomocí hydroxyprolinového testu byla použita k extrapolaci obsahu kolagenu a koncentrace každého segmentu, jak bylo popsáno dříve (4,5). Stručně řečeno, zmrazené plicní tkáně z každého segmentu byly lyofilizovány na suchou hmotnost, hydrolyzovány v 6M HCl a hodnoceny na obsah hydroxyprolinu měřením absorbance rekonstituovaných vzorků (v 0,1M HCl) při 558 nm pomocí Beckmanova přístroje. DU-64 spektrofotometr (Beckman Coulter Inc, Brea, CA). Obsah hydroxyprolinu byl stanoven ze standardní křivky trans-L-hydroxy-L-prolinu (Sigma-Aldrich). Obsah kolagenu byl extrapolován vynásobením měření hydroxyprolinu číslem 6,94 (založeno na hydroxyprolinu představujícím ~14,4 procenta aminokyselinového složení kolagenu ve většině tkání [21]) a poté vyjádřen jako podíl suché hmotnosti tkáně, aby se získala koncentrace kolagenu (která byla vyjádřena v procentech).

Analýza obsahu pojivové tkáně pro hodnocení stupně fibrózy byla kvantifikována hodnocením změn v celkovém obsahu pojivové tkáně v parenchymální tkáni pomocí dříve popsané metody [13]. K provedení této analýzy byly parafinové řezy ovčích plicních tkání obarveny pomocí Massonova trichromového barviva, které barví pojivovou tkáň modře. Následně byly pomocí digitální kamery spojené s mikroskopem a počítačem pořízeny snímky Massonových řezů plic obarvených trichromem. Deset polí bylo náhodně zachyceno při 400násobném zvětšení s výjimkou velkých krevních cév a průdušek. Snímky byly poté analyzovány pomocí Image-Pro Plus (verze 6.3 pro Windows, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA) s použitím nástroje pro výběr barvy k měření oblasti modře zbarvených tkání (kolagen a další pojivové tkáně) v každém poli. pohledu. Hodnoty pro každý z deseti snímků byly poté pro každý snímek zprůměrovány. Frakce modře zbarvené plochy tkáně byla vyjádřena jako procento na celkovou plochu pole (procento modře zbarvené plochy tkáně na celkovou plochu pole). Snímání a analýza obrazu byly prováděny zaslepeným způsobem na kódovaných preparátech.

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí GraphPad Prism pro Windows verze 5.01 (Graph-Pad Software Inc., La Jolla, CA, Spojené státy americké). Parametry byly hodnoceny pro Gaussovu hodnotu

distribuce pomocí D'Agostinova normality a Pearsonova omnibus testu. Pro parametrická data byly provedeny párové dvoustranné t-testy pro srovnání mezi segmenty plic, kterým byl podáván pouze bleomycin, s kontrolními segmenty s infuzí fyziologického roztoku a segmenty plic, které obdržely infuzi bleomycinu plus pinocembrin. Pro data, která nesplňovala předpoklady pro Gaussovu distribuci, byl použit Wilcoxonův párový test se znaménkem. Ve všech případech byla p-hodnota menší než 0,05 definována jako významný rozdíl. Všechny hodnoty jsou uvedeny jako průměry (± SEM).

Výsledek

Zdraví zvířat a bezpečnost podávání pinocembrinu

Zdravotní kontroly byly rutinně prováděny během léčebných období a studie až do eutanazie. Cílem bylo ujistit se, že léčba pinocembrinem nezpůsobuje žádné nežádoucí zdravotní problémy nebo nepříznivé vedlejší účinky u ovcí podstupujících test. Všechna zvířata zůstala zdravá po celou dobu léčby pinocembrinem (týden 8 až týden 12, obr. 2). Během tohoto období zvířata nadále přibírala na váze v očekávaném normálním rozmezí pro tyto ovce, měla normální počet bílých krvinek a nevyskytly se žádné jinak nepříznivé zdravotní účinky.

Podávání pinocembrinu zlepšuje pokles funkce plic spojený s rozvojem plicní fibrózy vyvolané bleomycinem

Obr. 3 ukazuje plicní funkce různých plicních segmentů po léčbě jednou týdně pinocembrinem po dobu čtyř týdnů. Měřeným parametrem plicní funkce byla poddajnost v lokálních plicních segmentech a je označována jako segmentální poddajnost (Cseg). Obecně platí, že nižší úrovně poddajnosti znamenají horší funkci v segmentu plic (tj. obtížnější nafouknutí a plíce jsou tužší). Jak se očekávalo, segmenty plic, které dostaly poškozující činidlo bleomycin samotný, bez pinocembrinu, měly významně nižší střední segmentální poddajnost než neošetřené zdravé kontrolní segmenty plic (obr. 3A). Plicní segmenty, které dostaly poškozující činidlo bleomycin s podáváním pinocembrinu, měly vyšší průměrnou segmentální poddajnost, která se významně nelišila od neošetřených zdravých kontrolních plicních segmentů (obr. 3A). Dalším použitým hodnocením funkce plic byla procentní změna poddajnosti od výchozí hodnoty (Eig 3C). To měřilo změnu v souladu od začátku studie (před ošetřením bleomycinem a pinocembrinem) do po dokončení konečného ošetření pinocembrinem. Hodnocení ukázalo, že compliance v segmentech plic léčených pinocembrinem se významně zlepšila po podávání pinocembrinu jednou týdně během 4-týdenního období léčby (obr. 3C).

Podávání pinocembrinu snižuje bleomycinem indukovanou akumulaci zánětlivých buněk v tekutině BAL

Obr. 4 ukazuje data BAL buněk po infuzích jednou týdně pinocembrinem po dobu 4-týdenní léčby. BAL buňky byly odebrány z plicních segmentů během týdne 12 pokusu, dva dny před vyřazením ovcí. Počty buněk hodnocené v tekutině BAL byly samotné neutrofily a součet hlavních zánětlivých buněk, které zahrnovaly neutrofily, eozinofily a lymfocyty. Jak se očekávalo, zdravé kontrolní segmenty plic, které nebyly ošetřeny, měly relativně nízký počet zánětlivých buněk v tekutině BAL (obr. 4).

Naproti tomu segmenty plic poraněné bleomycinem bez pinocembrinu měly významně vysoký počet neutrofilů a jiných zánětlivých buněk v tekutině BAL ve srovnání se zdravými kontrolními segmenty (Eig 4). Segmenty plic, které dostaly poškozující činidlo bleomycin, a které byly ošetřeny pinocembrinem, vykazovaly významně nižší počet neutrofilů a zánětlivých buněk ve srovnání s počty buněk odebraných ze segmentů plic, které dostávaly samotný bleomycin bez pinocembrinu (obr. 4).

Účinek pinocembrinu na T buňky plicního parenchymu

Obr. 5 ukazuje data T lymfocytů po čtyřech infúzních ošetřeních pinocembrinem, podávaným jednou týdně. T lymfocyty byly hodnoceny v parenchymu různě ošetřených plicních segmentů, ze kterých byly odebírány vzorky po smrti (týden 12). Jak se očekávalo, zdravé kontrolní plicní segmenty, které nebyly ošetřeny, měly relativně nízké počty CD8t a CD4* T buněk v plicním parenchymu (obr. 5).

Naproti tomu segmenty plic poraněné bleomycinem bez ošetření pinocembrinem měly významně vyšší počet CD8 a CD4* T buněk v plicním parenchymu ve srovnání se zdravými kontrolními segmenty (Eig 5). Segmenty plic, které dostaly škodlivé činidlo bleomycin a byly ošetřeny pinocembrinem, vykazovaly významně nižší počet CD8t a CD4 plus T buněk v plicním parenchymu ve srovnání s počty buněk odebraných z plicních segmentů, které dostávaly samotný bleomycin bez pinocembrinu (Eig 5 ).

každý testovaný parametr (Eig⑥). Důležité je, že plicní segmenty, které dostávaly poškozující činidlo bleomycin a byly léčeny pinocembrinem, měly nižší průměrné skóre pro každý hodnocený parametr (Eig ⑥). Léčba pinocembrinem významně snížila zánětlivé a celkové skóre patologie ve srovnání se segmenty, které dostávaly pouze infuzi bleomycinu (obr. 6). Zatímco segmenty plic, které dostávaly infuzi bleomycinu a pinocembrinu, měly nižší skóre fibrózy ve srovnání se segmenty, které dostávaly pouze infuzi bleomycinu, rozdíl nebyl statisticky významný (obr. 6).

Účinky pinocembrinu na obsah pojivové tkáně

Mikroskopická pozorování Massonových řezů obarvených trichromem ukázala, že léčba pinocembrinem snížila množství pojivové tkáně, které bylo indukováno infuzí bleomycinu (obr. 7A). EigZB ukazuje údaje pro procento plochy pojivové tkáně obarvené Massonovou trichromem po čtyřech ošetřeních pinocembrinem jednou týdně. Data na obr. 7B ukázala, že léčba pinocembrinem významně snížila procento modrého zbarvení v plicních segmentech vystavených bleomycinu ve srovnání s plícemi s infuzí bleomycinu, které nebyly léčeny pinocembrinem (obr. 7B). Obr. ZC ukazuje data pro hydroxyprolinový test na obsah kolagenu po čtyřech týdenních ošetřeních pinocembrinem. Údaje na obr. 7C byly shromážděny od všech 10 zvířat v testu a ukázaly, že infuze bleomycinu samotná (bez pinocembrinu) významně zvýšila koncentraci proteinu kolagenu ve srovnání s příslušnými měřeními ze zdravých plicních kontrolních segmentů, které nedostaly ani bleomycin, ani pinocembrin. Podávání pinocembrinu však nesnížilo zvýšení koncentrace kolagenu vyvolané bleomycinem (obr. 7C).

Diskuse

Tato studie využívala fyziologicky a farmakologicky relevantní model ovcí pro plicní fibrózu [12,13] ke zjištění účinnosti pinocembrinu. Celkově jsme zjistili, že léčba pinocembrinem byla účinná při zmírňování experimentálně vyvolané plicní patologie a nezpůsobila žádné nežádoucí účinky na zdraví u všech deseti ovcí podstupujících test.

každý testovaný parametr (obr.⑥). Důležité je, že plicní segmenty, které dostávaly poškozující činidlo bleomycin a byly léčeny pinocembrinem, měly nižší průměrné skóre pro každý hodnocený parametr (Eig ⑥). Léčba pinocembrinem významně snížila zánětlivé a celkové skóre patologie ve srovnání se segmenty, které dostávaly pouze infuzi bleomycinu (obr. 6). Zatímco segmenty plic, které dostávaly infuzi bleomycinu a pinocembrinu, měly nižší skóre fibrózy ve srovnání se segmenty, které dostávaly pouze infuzi bleomycinu, rozdíl nebyl statisticky významný (obr. 6).

Účinky pinocembrinu na obsah pojivové tkáně

Mikroskopická pozorování Massonových řezů obarvených trichromem ukázala, že léčba pinocembrinem snížila množství pojivové tkáně, které bylo indukováno infuzí bleomycinu (obr. 7A). EigZB ukazuje údaje pro procento plochy pojivové tkáně obarvené Massonovou trichromem po čtyřech ošetřeních pinocembrinem jednou týdně. Data na obr. 7B ukázala, že léčba pinocembrinem významně snížila procento modrého zbarvení v plicních segmentech vystavených bleomycinu ve srovnání s plícemi s infuzí bleomycinu, které nebyly léčeny pinocembrinem (obr. 7B). Obr. ZC ukazuje data pro hydroxyprolinový test na obsah kolagenu po čtyřech týdenních ošetřeních pinocembrinem. Údaje na obr. 7C byly shromážděny od všech 10 zvířat v testu a ukázaly, že infuze bleomycinu samotná (bez pinocembrinu) významně zvýšila koncentraci proteinu kolagenu ve srovnání s příslušnými měřeními ze zdravých plicních kontrolních segmentů, které nedostaly ani bleomycin, ani pinocembrin. Podávání pinocembrinu však nesnížilo zvýšení koncentrace kolagenu vyvolané bleomycinem (obr. 7C).

Diskuse

Tato studie využívala fyziologicky a farmakologicky relevantní model ovcí pro plicní fibrózu [12,13] ke zjištění účinnosti pinocembrinu. Celkově jsme zjistili, že léčba pinocembrinem byla účinná při zmírňování experimentálně vyvolané plicní patologie a nezpůsobila žádné nežádoucí účinky na zdraví u všech deseti ovcí podstupujících test.

Účinky pinocembrinu na histopatologii

Eig6 ukazuje data histopatologického skóre po čtyřech ošetřeních jednou týdně pinocembrinem. Sledované histopatologické parametry byly zánět, fibróza a celková patologie. Jak se očekávalo pro normální zdravé plíce, kontrolní segmenty plic, které byly ponechány neléčené, měly nízké skóre pro každý hodnocený patologický parametr (obr. 6). Naproti tomu segmenty plic poraněné bleomycinem bez léčby pinocembrinem měly významně vysoké průměrné skóre

každý testovaný parametr (Eig⑥). Důležité je, že plicní segmenty, které dostávaly poškozující činidlo bleomycin a byly léčeny pinocembrinem, měly nižší průměrné skóre pro každý hodnocený parametr (Eig ⑥). Léčba pinocembrinem významně snížila zánětlivé a celkové skóre patologie ve srovnání se segmenty, které dostávaly pouze infuzi bleomycinu (obr. 6). Zatímco segmenty plic, které dostávaly infuzi bleomycinu a pinocembrinu, měly nižší skóre fibrózy ve srovnání se segmenty, které dostávaly pouze infuzi bleomycinu, rozdíl nebyl statisticky významný (obr. 6).

Účinky pinocembrinu na obsah pojivové tkáně

Mikroskopická pozorování Massonových řezů obarvených trichromem ukázala, že léčba pinocembrinem snížila množství pojivové tkáně, které bylo indukováno infuzí bleomycinu (obr. 7A). EigZB ukazuje údaje pro procento plochy pojivové tkáně obarvené Massonovou trichromem po čtyřech ošetřeních pinocembrinem jednou týdně. Data na obr. 7B ukázala, že léčba pinocembrinem významně snížila procento modrého zbarvení v plicních segmentech vystavených bleomycinu ve srovnání s plícemi s infuzí bleomycinu, které nebyly léčeny pinocembrinem (obr. 7B). Obr. ZC ukazuje data pro hydroxyprolinový test na obsah kolagenu po čtyřech týdenních ošetřeních pinocembrinem. Údaje na obr. 7C byly shromážděny od všech 10 zvířat v testu a ukázaly, že infuze bleomycinu samotná (bez pinocembrinu) významně zvýšila koncentraci proteinu kolagenu ve srovnání s příslušnými měřeními ze zdravých plicních kontrolních segmentů, které nedostaly ani bleomycin, ani pinocembrin. Podávání pinocembrinu však nesnížilo zvýšení koncentrace kolagenu vyvolané bleomycinem (obr. 7C).

Účinnost pinocembrinu ke zlepšení několika parametrů onemocnění na ovčím modelu experimentálního plicního onemocnění

V současné studii jsme zjistili, že pinocembrin byl schopen zlepšit několik parametrů onemocnění na ovčím modelu plicní fibrózy. Naším hlavním zjištěním bylo, že podávání pinocembrinu bylo schopno zlepšit funkci plic, zmírnit zánět plic a snížit celkové skóre patologie, které bylo indukováno poškozením bleomycinem. Důležité je, že statistické analýzy dat odhalily, že tyto hodnoty onemocnění byly významně zlepšeny u segmentů plic ošetřených pinocembrinem ve srovnání s odpovídajícími údaji z segmentů plic poraněných bleomycinem a neléčených.

V ovčím modelu plicní fibrózy vyvolané bleomycinem způsobuje poškození bleomycinem ztrátu lokalizované plicní poddajnosti (míra tuhosti plic) v segmentech plic s infuzí bleomycinu [12-14,16,22,23]. V současné studii zjistili jsme, že léčba pinocembrinem významně zlepšila funkční poddajnost v segmentech plic poraněných bleomycinem. To prokázalo, že léčba pinocembrinem v poraněných segmentech plic vedla k tomu, že tyto segmenty fungovaly na vyšších úrovních, než kdyby byly ponechány bez léčby.

V současné studii identifikace zánětlivých buněk z plicní laváže získaných z plicních segmentů ukázala, že léčba pinocembrinem významně snížila počet zánětlivých buněk, které zabírají liminální prostory alveol a malých dýchacích cest. Hlavním typem zánětlivých buněk, který byl redukován v tekutině z výplachu plic, byly neutrofily, které klesly ze 7,4 procenta z celkového počtu buněk BAL v plicních segmentech bleomycinu bez medikamentózní léčby na 3,7 procenta v segmentech plic poraněných bleomycinem ošetřeným pinocembrinem. Snížení počtu CD4 a CD8 T buněk v plicním parenchymu spojené s pinocembrinem bylo zcela konzistentní se snížením počtu zánětlivých buněk získaných z plicní laváže segmentů plic vystavených pinocembrinu a bleomycinu. CD4 a CD8 plus T buňky jsou důležitými složkami v buněčných ramenech mnoha imunitních reakcí. Celkově tato data podporují názor, že pinocembrin měl ve studovaném modelu onemocnění silné protizánětlivé vlastnosti.

Pokud jde o histopatologické skóre, průměrné skóre zánětu a celkové patologie se zlepšilo v poraněných segmentech plic po léčbě pinocembrinem. Důležité je, že tyto hodnoty byly statisticky nižší u poškozených plic ošetřených pinocembrinem ve srovnání s experimentálně poškozenými plícemi bez léčby pinocembrinem. Zatímco průměrné skóre patologie fibrózy bylo nižší u poškozených plic ošetřených pinocembrinem ve srovnání s experimentálně poraněnými plícemi bez léčby pinocembrinem, nedosáhly statistické významnosti.

Protože údaje o skóre patologie fibrózy nebyly pro pinocembrin definitivní, byl test hydroxyprolinu proveden na vzorcích tkáně z různě ošetřených segmentů plic. Hydroxyprolinový test měří hladinu kolagenu ve vzorku proteinu a je zlatým standardním měřítkem pro kvantifikaci hladin fibrózy ve tkáních. Tento test ukázal, že pinocembrin nesnižuje ukládání extracelulárního kolagenu spojeného s poškozením bleomycinem. Massonův trichromový test (další odečet, který se často používá k posouzení rozsahu fibrózy) ukázal, že procento modrého zbarvení (tj. míra obsahu pojivové tkáně) bylo významně nižší v řezech plic vystavených bleomycinu a pinocembrinu ve srovnání s exponovanými bleomycinem. plicní řezy, které nebyly léčeny léky. Celkově vzato, data z hydroxyprolinových a Massonových trichromových testů naznačovala, že pinocembrin měl schopnost redukovat některé proteiny extracelulární matrix (ukázáno Massonovými údaji o trichromu), ale ne nutně kolagen (jak potvrzují údaje o hydroxyprolinu). Celkově data ze skóre fibrózy, Massonova trichromu a hydroxyprolinových testů naznačovala, že pinocembrin měl pouze mírné antifibrotické a antiremodelační vlastnosti.

Již dříve bylo prokázáno, že mnoho bioaktivních sloučenin má protizánětlivé i antifibrotické vlastnosti prostřednictvím modulace několika profibrotických a prozánětlivých biomarkerů, jako je TNF, TGF-endotelin-1, IFN-y, interleukiny, VEGF, FGF -2, PDGF MMP-9, TIMP, NF-kB a kolagen-I [24]. Dále bylo zjištěno, že podávání protizánětlivých sloučenin myším modelům plicní fibrózy s infuzí bleomycinu často vedlo ke snížení fibrotické patologie. To platí zejména tehdy, pokud byly protizánětlivé molekuly aplikovány brzy po expozici bleomycinu během zánětlivého (profibrotického) stadia patologie v těchto modelech [25]. Důležité však je, že když bylo mnoho z těchto protizánětlivých molekul testováno na klinice k léčbě fibrotických stavů, bylo zjištěno, že jsou neúčinné [25]. Na zvířecích modelech, kde bylo zjištěno, že pinocembrin účinně zpomaluje fibrózu, která byla indukována v jiných orgánech, pinocembrin také inhiboval prozánětlivé cytokiny TNF-c, IL-1 a IL-6 a tlumil zánětlivé reakce prostřednictvím deprese NF-K signální dráhy 9, 10. Další studie mechanismu s myším LPS a bleomycinem modely naznačovaly, že TLR4 (toll-like receptor 4) a záněty jsou kauzálně spojeny s pinocembrinovou supresí zánětlivé signalizace NF-K [2]. Stejně jako u všech modelů plicní fibrózy indukované bleomycinem je pro stanovení relativního antifibrotického a protizánětlivého přínosu léčby klíčové načasování lékové intervence [25. Načasování léčby pinocembrinem v současné studii bylo 7 dní po poslední infuzi bleomycinu, což je v tomto modelu na začátku fibrotické fáze [12,13]. Ačkoli byl zánět v tento den-7 mnohem nižší, byl přesto přítomen, takže nemůžeme vyloučit, že některé slabé antifibrotické účinky pinocembrinu byly způsobeny jeho protizánětlivými aktivitami.

Dříve jsme tento ovčí model plicní fibrózy použili k vyhodnocení terapeutického potenciálu dvou dalších léků, jejichž výsledky mohou být užitečné pro srovnání účinků pinocembrinu zjištěných v současné studii. Testovali jsme inhibitor iontového kanálu KCa3.1 zvaný senicapoc [15,16] a také jsme na modelu zkoumali účinnost léku pirfenidonu schváleného FDA[14]. Publikované návrhy studie byly v podstatě podobné současné studii pinocembrinu, přičemž každá studie používala 10 ovcí na skupinu. Období léčby drogami byla podobná doba trvání, čtyři až pět týdnů pro každou drogu. Hlavní rozdíl byl v tom, že ve studiích senicapoc a pirfenidon byly léky podávány perorálně, zatímco pinocembrin byl podáván do plic do lokálních segmentů plic. Navíc celé plíce v současné studii nedostaly pinocembrin, zatímco celé plíce byly vystaveny lékům ve studiích s pirfenidonem a senicapokem. Analýzy dat mezi těmito studiemi odhalují, že úrovně zlepšení markerů onemocnění plic poddajnosti, celkového skóre patologie a zánětu byly na podobné úrovni pro studii s pinocembrinem ve srovnání s jinými studiemi léčiv prováděnými s modelem ovcí. Jedním z hlavních rozdílů mezi těmito studiemi bylo, že v dříve publikovaných studiích vedlo podávání pirfenidonu nebo senicapocu k významnému snížení koncentrace kolagenového proteinu, jak bylo hodnoceno testem na hydroxyprolin [14, 16] Celkově lze říci, že srovnání mezi testovanými léky naznačují, že významné zlepšení funkce a patologie plic je způsobeno především protizánětlivými účinky pinocembrinu a v menší míře díky jeho antifibrotickým účinkům.

V současné studii bylo zjištěno, že čtyři 7mg dávky pinocembrinu podávané do plic v týdenních intervalech byly dobře tolerovány a byly bez jakýchkoli nežádoucích vedlejších účinků. To je v souladu s údaji z randomizované dvojitě zaslepené, placebem kontrolované studie s 58 zdravými pacienty, která ukázala, že intravenózní injekce pinocembrinu byla dobře tolerována až do dávky 120 mg denně [26]. Studie hodnotila režimy s jednou i více dávkami a zjistila, že neexistují žádné zásadní bezpečnostní obavy, které by bránily jakémukoli budoucímu klinickému vývoji injekčního podávání pinocembrinu [26]. Údaje v současné studii ukázaly, že přímé podání pinocembrinu do plic bylo nejen bezpečné a životaschopné, ale také podpořilo názor, že tento flavonoid by mohl být užitečný pro léčbu řady zánětlivých onemocnění plic. Astma je důležité alergické onemocnění dýchacích cest, které by bylo přístupné dodáním pinocembrinu do plic. Předběžné důkazy podporující antiastmatické účinky pinocembrinu byly prokázány ve studii, kde intraperitoneální injekce pinocembrinu inhibovaly alergické onemocnění dýchacích cest u myší [20]. Dalo by se tedy rozumně očekávat, že lokalizované dodávání pinocembrinu pouze do plic by bylo účinnější při léčbě stavů podobných astmatu na klinice.

Závěr

Závěrem lze říci, že silná a významná data odvozená z této studie byla v souladu s tím, že pinocembrin je bioaktivní a zlepšuje klíčové parametry onemocnění na zvířecím modelu. Nápadné protizánětlivé a mírné antifibrotické remodelační účinky podávání pinocembrinu byly pravděpodobně spojeny s jeho schopností zlepšit plicní patologii a funkční komplianci.