Ústřední role transformačního růstového faktoru β (TGF-β) ve vývoji renální fibrózy
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
ČÁST I.: Úloha primárního renálního fibroblastu člověka v zařízeních napodobujících fibrózu TGF-β1-zprostředkovaných fibrózou
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee & et al.
1. Úvod
Renální fibróza, konečná společná cesta nesčetných progresivních onemocnění ledvin, je charakterizována zvýšením produkce proteinů extracelulární matrice (ECM), poklesem degradace matrice, dysfunkcí interakce buněčné matrice, transformací rezidentních buněk a zánětlivou infiltrací buněk.Transformace růstového faktoru β(TGF-β) je multifunkční dimerní peptid, který reguluje biologické procesy, jako je proliferace buněk, diferenciace a imunologické odpovědi [1]. Mezi četnými fibrogenními faktory TGF-β(Transformace růstového faktoru β) hraje ústřední roli a má protizánětlivý účinek. TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)-nedostatečné myši umírají na masivní zánět. Transgenní myši nadměrně exprimující TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)jsou prakticky chráněny před rozvojem renální fibrotické patologie, zejména díky své protizánětlivé aktivitě [2]. Profibrotické a protizánětlivé vlastnosti TGF-β(Transformace růstového faktoru β)jsou dvousečné meče, pokud jde o terapeutické použití TGF-β(Transformace růstového faktoru β)zábrana. Bylo vynaloženo pozoruhodné úsilí, aby se zabránilo β TGF(Transformace růstového faktoru β)opatření, která brání progresiledvinovýfibróza[3]. Ačkoli bylo k boji použito mnoho přístupůledvinovýfibróza, experimentální model pro hodnocení v současnosti dostupných léků není ideální.
cistanche bylina zabránitonemocnění ledvin
Obecně platí, že studie na zvířatech hrají klíčovou roli v preklinických testech při předpovídání farmakokinetiky a účinnosti léčiv. Mezi zvířaty a lidmi však existují různé rozdíly, což nás vede ke zpochybnění přesnosti testů účinnosti a bezpečnosti léků na zvířatech 4. Předchozí zprávy závisely na předklinických studiích na zvířatech během vývoje léčiv k posouzení nefrotoxicity a bezpečnosti léků. Funkce ledvin zvířat je více než dvojnásobná oproti lidským ledvinám. Proto jsou léky metabolizovány rychleji u zvířat než u lidí, což ztěžuje objasnění výsledků testů toxicity léčiv pomocí studií na zvířatech. Výsledky pokusů na zvířatech navíc nelze použít k předpovědi lékových reakcí u lidí, protože zvířata mají různé fyziologické funkce. Na zvířecí bázirenální fibrózamodely mají potíže s reprodukcí člověkarenální fibróza; proto probíhá výzkum zaměřený na překonání současných překážek a optimalizaci platforem pro objevování léků [5].
Technologie Organ-on-a-chip (OoC) se ukázala jako nový koncept řešení těchto problémů. Tato platforma byla navržena s ohledem na současné nedostatky a ukázala velký příslib v oblasti nefrologie [6]. Kromě toho mají modely OoC velký potenciál jako náhrada experimentálních zvířecích modelů, poskytují řešení mezidruhových rozdílů a mohou pomoci ukončit krutost vůči zvířatům a etické debaty [7]. Existuje jen málo in vitro modelů, které současně používají primární renální fibroblasty s endoteliálními a epiteliálními buňkami, které jsou důležitými buňkami vledvinafibróza. Úloha každé buňky vfibrózaje studován odděleně; existují však omezené znalosti o interakci buněk.
V této studii jsme vyvinulifibróza-napodobování zařízení používajících lidské primární fibroblasty. Potvrdili jsme, že TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčba má různé účinky narenální fibrózamodel. Zejména fibroblasty hrají klíčovou roli jako efektorové buňky, podporují tvorbu profibrotického mikroprostředí a vylučují růstové faktory a cytokiny. Proto, na základě této nové metody, fibroblasty mohou poskytnout ideální buněčný modelový systém pro studium onemocnění ledvin. Hodnotili jsme, zda fibroblasty odvozené od fibrotického onemocnění ledvin ovlivňují integritu buněk kultivovaných ve třech dimenzích (3D). Nakonec předkládáme studii důkazu principu, která demonstruje potenciál člověkarenální fibróza-napodobování zařízení jako modelu pro předvídání reakce na člověkarenální fibróza.
účinky cistanche: léčba infekce ledvin
2. Výsledky
2.1.Identifikace alfa aktinu hladkého svalstva (a-SMA) a keratinu-8 (KRT-8) pomocí TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)v BUŇKÁCH HK-2
V počáteční fázi jsme zkoumali známé markeryfibrózaa cytoskelet v dvourozměrných (2D) kulturách. Byly provedeny imunofluorescenční barvicí testy pro odhad α-SMA exprese fibrózy a tubulární epiteliálního na mezenchymální přechod (EMT) marker a hladiny KRT8 jako cytoskeletový marker. Imunofluorescenční barvení ukázalo, že exprese α-SMA byla původně slabá a hladiny KRT8 byly vysoké v monovrstvých epiteliálních buňkách HK-2. Nebyla zjištěna žádná významná změna intenzity fluorescence u TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)(5 ng/ml) nebo specifickou inhibitorovou léčbu epiteliálních buněk HK-2 po dobu 24 hodin (obrázek 1).
Obrázek 1. Imunofluorescence ukazuje, že exprese alfa-SMA a keratinu-8(KRT8) byla udržována léčbou TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)nebo inhibitor v buňkách HK-2.(A) Exprese alfa-SMA a (B)CCK-8 neměla žádný vliv na BUŇKY HK-2 pomocí TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)(5ng/ml) nebo inhibitor. Buňky byly původně pokoveny při hustotě 1×10° na jamku (a-c)neošetřenou kontrolní složkou a (d-f)stimulovány5ng/ml TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)nebo(g-i)10 μM inhibitor (SB431542) po dobu 24 hodin a fixovaný 4% paraformaldehydem. Buňky byly poté obarveny anti-α-SMA a anti-cytokeratinem-8 po dobu 20 minut. Bylo provedeno společné barvení s barvivem H33342 Hoechst za účelem identifikace buněčných jader. Měřítkové pruhy v mikrografech označují 200 um.
cistanche prášek zlepšuje funkci ledvin
2.2 Exprese KRT8 snížená o TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)na čipu
Dále jsme hodnotili úrovně exprese α-SMA a KRT8 ve 3D kultivovaném HK-2 a celkovou délku endoteliálních buněk GFP-lidské pupeční žíly (HUVECs) léčených TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)a specifický inhibitor. Abychom toho dosáhli, nejprve jsme vytvořili vzor tkáňového čipu zahrnující dva typy buněk, epiteliální buňky HK-2 a GFP-HUVECs. Po potvrzení konstrukce jsme tkáňový čip vystavili TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)(5 ng/ml) nebo specifický inhibitor (10 um SB431542) po dobu 24 hodin.
Jak je znázorněno na obrázku 2A-C, exprese α-SMA nebyla TGF-β1 specificky změněna(Transformace růstového faktoru β)nebo specifickou léčbu inhibitory. Exprese KRT8 však byla snížena v kokultivovaném čipu dvoubuněčného typu. Navíc přidání inhibitoru TGF-ß1 zvýšilo expresi KRT8.
Zkoumali jsme tvorbu 3D trubkové kapilární sítě pomocí TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčba u HUVECs, protože endoteliální buňky mohou spontánně vytvořit 3D tubulární kapilární síť. V souladu s našimi kulturními podmínkami byla tvorba tlustých čar výrazně snížena. Kapilární tenké čáry však byly zvýšeny v TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčené GFP-HUVECs. V případě TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)inhibitorová léčba na 3D kultivovaném čipu, celková délka tlustých a tlustých čar vykazovala opačnou tendenci k TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčba. Ve srovnání s neléčenou kontrolní skupinou bylo pozorováno zvýšení délky tlusté čáry. Podobný vzorec byl pozorován v průměru tlusté čáry v GFP-HUVEC po TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčba a léčba inhibitory. Průměr GFP-HUVEC byl potlačen TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčba, ale zvýšila se bez ohledu na tloušťku čáry inhibitorem ve srovnání s kontrolami i TGF-β1(Transformace růstového faktoru β). Celková délka a průměr tlusté čáry byly dramaticky zvýšeny léčbou inhibitorem TGF-β1 ve srovnání s neléčenou kontrolní léčbou a léčbou TGF-β1. Získané výsledky zejména naznačovaly zvýšenou hustotu drobných cév v TGF-β(Transformace růstového faktoru β)-léčená skupina ve srovnání s jejich neléčenými protějšky. Naproti tomu hustota tlustých nádob v TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčená skupina byla nižší než v neléčené kontrolní skupině (obr. 2D, E).
Obrázek 2. KrT8 výraz v HK-2 a celková délka a průměr HUVECs.(A) Imunofluorescence ukazuje, že exprese α-SMA byla zachována a exprese KRT8 byla dramaticky snížena léčbou TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)v HK-2. Buňky byly pokoveny a stimulovány 5ng/ml TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)nebo 10 μm inhibitor (SB 431542) po dobu 24 hodin a fixovaný 4% paraformaldehydem. Buňky byly obarveny anti-α-SMA a anti-cytokeratinem-8 po dobu 20 minut. Bylo provedeno společné barvení s barvivem H33342 Hoechst za účelem identifikace buněčných jader. Exprese α-SMA(a-c) neměla žádnou změnu, ale KRT8(d-f) v buňkách HK-2 a GFP v expresi HUVEC (g-i) byly významně změněny TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)(5 ng/ml) a inhibitor (B, C). V celkové délce HUVEC byla tenká nádoba zvýšena, ale tlustá nádoba byla snížena o TGF-β1(Transformace růstového faktoru β). Průměr byl zvětšen jak v tenkých, tak v tlustých nádobách. Tyto výsledky byly zvráceny inhibitorem SB431542 (D, E). Měřítko v mikrografech indikuje 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
co se cistanche používá pro: léčbu chronických onemocnění ledvin
2.3 TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)Ovlivňuje tři typy buněk čipu s vícekomorovou strukturou
Studium TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)odezvy navrhovaného 3D čipu jsme provedli imunobarvení na každém kompartmentu zvlášť (obrázek 3). V této analýze byly použity primární lidské renální fibroblasty. Vzorky byly analyzovány pomocí FACS a potvrzeny jako pozitivní na protilátku fibroblast markeru. Po inkubaci tří typů buněk S TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)po dobu 24 hodin bylo provedeno imunobarvení k posouzení exprese α-SMA a KRT8. Exprese a-SMA byla upregulována léčbou TGF-1 a opačné výsledky byly pozorovány u TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčba inhibitory. Naopak exprese KRT8 byla snížena TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)a ukázal opačnou reakci na TGF-β(Transformace růstového faktoru β)inhibitor (obrázek 4A-C).
Obrázek 3. Ukázkový obrázek se schematickou ukázkou zařízení výrobního a experimentálního plánu.(A) Horní dva obrázky ukazují rozložení. Levý obrázek ukazuje celkovou fotografii zařízení shora dolů. Spodní obrázky ukazují průřez. Schematický pohled s podrobnostmi o rozměrech vodítek kapaliny. (B) Tento obrázek popisuje experimentální plány profibróza-napodobující zařízení. Čtyřstupňový proces nakládání pro každou jamku. Umístění každé hydrogelové vzorovací plochy, jakož i umístění média v horním a izometrickém průřezu. (1) Celkem 1,5 uL hydrogelu 1 je spontánně vedeno do centrálního kanálu. (2) Centrální kanál je naplněn5uL hydrogelu. (3) Na dně nádrže je vzorováno celkem 10uL hydrogelu 3. (4) Dávkuje se celkem 200 μl médií. Pruh červené stupnice = 9 mm.
Jak je znázorněno na obrázku 4D-G, délka kapilární tenké čáry byla významně zvýšena o TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčba u GFP-HUVECs. Tloušťka tlusté čáry však byla v TGF-β1 snížena(Transformace růstového faktoru β)léčené HUVECs. Průměr byl v průměru snížen pro tenké a tlusté nádoby v HUVEK. V případě TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)inhibitorová léčba na 3D kultivovaném čipu, celková délka tlustých a tlustých čar vykazovala opačný trend než léčba TGF-β1. Dále byla délka tlusté čáry zvýšena ve srovnání s neléčenou kontrolní skupinou.
Obrázek 4. Změna 3D kultivovaných HK-2 a HUVECs s primárními renálními fibroblasty.Celkové buňky byly pokoveny při hustotě 5×10° na 3D čip a stimulovány 5 ng/ml TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)nebo 10 μm inhibitor (SB 431542) po dobu 24 hodin a fixovaný 4% paraformaldehydem. (A) Buňky ve 3D čipu byly obarveny anti-oα-SMA a anti-cytokeratinem-8. Exprese α-SMA (a-c) byla zvýšena a exprese KRT8(d-f) byla významně snížena o TGF-β1(5 ng/ml). Celková délka HUVEC; tenké cévy byly dramaticky zvýšeny a tlusté cévy byly sníženy o TGF-ß1(Transformace růstového faktoru β)(D, E). Průměr byl snížen pro tenké a tlusté nádoby (F, G). Tyto výsledky byly zvráceny inhibitorem SB431542. Měřítko v mikrografech indikuje 100 μm.*p<><0.01，and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Moduluje zánětlivý mediátor a růstové faktory
Dále jsme zkoumali zánětlivé cytokiny a růstové faktory v supernatantu; IL-1β, FGF-2, TGF-β2(Transformace růstového faktoru β)a TGF-β3(Transformace růstového faktoru β)sekrece proteinů byla dramaticky vyšší u čipů 3D kultivovaných než u dobře kultivovaných 2D fibroblastů, i když měly stejný celkový počet buněk. TGF-β1 však(Transformace růstového faktoru β)byly podobné, protože 2D nebo 3D kultivované modely byly ošetřeny podobnými koncentracemi TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)(Obrázek 5A-E). Zejména uvolňování FGF-2 z lidských primárních renálních fibroblastů bylo 20,9 ± 0,4 pg/den/5× 10° buněk 2D jednovrstvé kultury a 3094,8± 0,2 pg/den/5× 10° buněk včetně HUVEK a HK-2 3D kultivovaného čipu v neošetřené kontrole. Sekrece FGF-2 pomocí TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)stimulace byla 31,0±0,2pg/den/5×10° buněk pro 2D kulturu a 3683,9± 0,8 pg/den/5×10° buněk pro 3D kultivovaný čip. Toto zvýšení produkce proteinu FGF-2 ve 2D monovrstvé kultuře bylo doprovázeno nárůstem modelu čipu 3D kultivovaného pomocí TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčba (obrázek 5B).
Obrázek 5. Srovnání 2D a 3D kultivovaných modelů jako platforem napodobujících renální fibrózu.Buňky byly pokoveny při hustotě 5×10° na 2D jamku nebo 3D čip a stimulovány 5ng/ml TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)nebo inhibitor 10 um (SB 431542) po dobu 24 hodin. Primární lidské renální fibroblasty byly použity ve 2D kultivovaném a 3D kultivovaném modelu. Fibroblasty byly použity v hustotě 8× 10* kultivované s HUVECs a HK-2. Primární poměr lidských renálních fibroblastů k HUVEC nebo poměr F: H byl 1:5 pro hodnocenífibróza. Buňky HK-2 byly použity v hustotě 2×104. Detekce (A)IL-1β,(B)bazického fibroblastového růstového faktoru (FGF-2) a(C-E)TGF-beta 1, 2 a 3 v supernatantu byla provedena multiplexní analýzou cytokinů a multiplexní perličkovou imunotestou. Každý pruh představuje střední hodnotu± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Transformace růstového faktoru β).
cistanche tubolosa přínosy: léčba onemocnění ledvin
Dále jsme odhadli expresi mRNA prozánětlivých cytokinů, jako jsou IL-1β, IL-6, IL-8 a TNF-α. Výsledky byly signifikantně sníženy rekombinantním lidským TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)ošetření v čipu 3D kultivované jako protizánětlivá vlastnost TGF-β(Transformace růstového faktoru β). Zjistili jsme, že exprese mRNA byla upregulována TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)inhibitor (SB431542). Navíc inhibitory zprostředkovaná exprese IL-6, IL-8 a TNF-α byla specificky snížena ve srovnání s neléčenou kontrolou (obrázek 6A-D). Hladina mRNA VEGF, fibrotického faktoru, byla významně zvýšena TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčba. Hladina mRNA ve vegf byla snížena inhibitorem TGF-β1 (obrázek 6E), zatímco exprese mRNA IL-10 s antifibrotickým účinkem byla snížena u fibrotických stavů vyvolaných TGF-β1. Naproti tomu exprese I-10mRNA byla zvýšena léčbou TGF-β1inhibitorem (obrázek 6F).
Obrázek 6. REAL-time PCR ukazuje celkovou expresi mRNA 3D čipu.Buňky byly pokoveny při hustotě 5×10° na 3D čip a stimulovány5ng/ml TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)nebo inhibitor 10 um (SB431542) po dobu 24 hodin. Celková RNA extrahovaná z 3D kultivovaného čipu. Exprese mRNA (A)IL-1 β,(B)TNF-α,(C)IL-6 a (D)IL-8 představuje protizánětlivý účinek TGF-β1(Transformace růstového faktoru β)léčba. (E) Exprese VEGF jako angiogenní faktor byla zvýšena. (F) Exprese IL-10 jako antifibrotického faktoru byla významně snížena TGF-β1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Transformace růstového faktoru β).