Anti-apoptóza podocytů a pro-apoptóza mezangiálních buněk pro telmisartan při zmírnění diabetického poškození ledvin

ABSTRAKTNÍ

Poškození podocytů a expanze mezangiálních buněk jsou dva důležité patologické projevy glomerulárního poškození u časného diabetu. Telmisartan jako inhibitor receptoru angiotensinu typu 1 (AT1) by mohl zlepšit produkty pokročilé glykace (AGE) nebo poškození podocytů indukované angiotensinem Ⅱ (Ang Ⅱ), včetně odchlípení nebo apoptózy. V této aktuální práci jsme nejprve potvrdili ochranný účinek telmisartanu na časné diabetické poškození ledvin u potkanů ​​s diabetem 1. typu. Telmisartan snižoval ztrátu podocinu a inhiboval expresi -SMA, což odráží jeho ochranný účinek na poškození podocytů a mezangiální proliferaci, v daném pořadí. Zajímavější je, že jsme pozorovali opačný účinek telmisartanu na buněčnou životaschopnost a apoptózu podocytů a mezangiálních buněk v prostředí s vysokým obsahem glukózy in vitro. Antiapoptotický účinek telmisartanu na podocyty může souviset s jeho inhibicí exprese swiprosinu-1 (protein, který může zprostředkovat apoptózu podocytů indukovanou vysokou glukózou). Zatímco telmisartan indukoval vysokou expresi PPAR v mezangiálních buňkách, a GW9662 (antagonista PPAR) částečně inhiboval telmisartanem indukovanou apoptózu a snižoval životaschopnost mezangiálních buněk. Kromě toho může být telmisartanem blokována vysoká glukózou indukovaná exprese PKC 1/TGF 1 v mesangiálních buňkách. Tato data poskytují přesnější buněčný mechanismus pro odhalení ochranného účinku telmisartanu při diabetickém poškození ledvin.

KLÍČOVÁ SLOVA

diabetické onemocnění ledvin, podocyty (MeSH: D050199), mesangiální buňky, telmisartan (PubChem CID: 65, apoptóza

Kliknutím sem zakoupíte produkty Cistanche

ÚVOD

Diabetické onemocnění ledvin (DKD), dobře známé jako chronické onemocnění ledvin vyvolané diabetes mellitus (DM) typu 1 nebo 2 (Podgórski et al., 2019), by mohlo zhoršit rychlost glomerulární filtrace (GFR), postupně se snižuje, pak se nakonec vyvine do konce - stadium onemocnění ledvin (Hou et al., 2018; Ruiz-Ortega et al., 2020; Expertní skupina Čínské nefrologické společnosti, 2021). Existují dva mechanismy, které hyperglykémie zprostředkovává prostřednictvím poškození ledvinových podocytů a změn glomerulární bazální membrány (GBM) vyvolaných expanzí nebo proliferací mesangiálních buněk (Anders et al., 2018).

Podocyty jsou specializované viscerální epiteliální buňky, které vystýlají vnější vrstvu GBM, jehož chodidlové procesy se vzájemně prolínají a vytvářejí konečnou bariéru, která brání ztrátě bílkovin močí (Podgórski et al., 2019). Počet a/nebo hustota každého glomerulu byla studována u pacientů s DM (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). Poranění podocytů přispívá ke ztrátě jejich adhezivních vlastností a je hlavní příčinou rozvoje DKD (Podgórski et al., 2019). Další pozoruhodnou charakteristikou podocytů je, že zralé podocyty jsou omezené proliferativní buňky (Podgórski et al., 2019), (Griffin et al., 2003). Ztráty podocytů způsobují proliferaci mezangiálních buněk, nicméně výraznější ztráty vedou ke glomerulární fibróze a zvýšené proteinurii jako následné denudaci GBM (Fukuda et al., 2012). Špatná glykemická kontrola má za následek podocytopatii (Anders et al., 2018), morfologické změny charakterizované hypertrofií podocytů, epiteliálně-mezenchymální transdiferenciaci podocytů (Chang et al., 2017), odchlípení podocytů (Zhang et al., 2020), (apoptóza podocytů Wang et al., 2018a) a ztráta podocytů, která vede k progresivním aberacím podocytů, vede k odchlípení GBM s následnou glomerulosklerózou.

Mesangiální buňky mají významný vliv nejen na úpravu glomerulární a intraglomerulární cirkulace, ale také na konzervaci glomerulů, jako je obrana glomerulárních endoteliálních buněk a odtok látek ze séra a tekutiny z mikrocév (Wakisaka et al., 2021). Ztluštělá GBM a rozšířený mezangiál jsou patrné glomerulární poruchy u diabetu (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). Ztluštění GBM je časné histopatologické u DKD a je ovlivněno aberantním příjmem a variací extracelulární matrix vylučované endoteliálními buňkami a podocyty (Anders et al., 2018). Hyperglykémie excituje mezangiální buňky k proliferaci a výrobě matrice (Kriz et al., 2017) prostřednictvím aktivace transformujícího růstového faktoru- (TGF), který přímo způsobuje transkripční aktivaci matricových kolagenů (Ziyadeh et al., 2000) vedoucí k expandujícímu mezangiálu matice.

Včasná intervence hypoglykemickou a antihypertenzní léčbou je přínosná pro oddálení výskytu a rozvoje DKD (Martins a Norris, 2001). Zvláště doporučený u dospělých s normálním krevním tlakem s DM a albuminurií je inhibitor angiotenzin-konvertujícího enzymu (ACEI) nebo blokátor receptoru pro angiotenzin (ARB) (Liew et al., 2020). Blokáda systému renin-angiotenzin zlepšuje expresi ANGPTL2 a integrinu, které udržují glomerulární bariéru (Tawfik et al., 2021). Důvod, proč byl vybrán telmisartan, je ten, že je popisován jako účinnější než jiná ARB léčiva při zmírňování proteinurie (Naruse et al., 2019; Guo et al., 2020). Kromě toho může telmisartan snížit nefrotoxicitu vyvolanou cisplatinou, jako je apoptóza podocytů a hladiny exprese proteinů souvisejících s autofagií (Malik et al., 2015). Fascinující je, že telmisartan má takové vlastnosti, které berou v úvahu jeho dvojí roli blokujícího působení receptoru AT1 a parciální agonistické vlastnosti receptoru gama aktivovaného peroxisomovým proliferátorem (PPAR) (Balakumar et al., 2012). Cílem této práce bylo prozkoumat protektivní vliv telmisartanu na poškození podocytů a mezangiální expanzi v časném stadiu DM 1. typu, resp.

Cistanche prášek

MATERIÁLY A METODY

1. Zvířata

SD samci potkanů ​​byli zakoupeni od SLRC Laboratory Animal Ltd. (Shanghai, Čína). Potkani byli chováni při kontrolované teplotě 22 ± 2 stupně C, relativní vlhkosti 50–60 procent, cyklech 12-h světla a 12-h tmy (světlo, 08:00–20 :00, tma, 20: 00–08:00), a povolen volný přístup ke standardní suché stravě a vodě z vodovodu. Všem zvířatům se dostalo humánní péče a experimentální protokoly byly schváleny Výborem pro péči o zvířata na Naval Medical University.

2. Diabetický model a léčba

Weight 180–200 g male rats were treated with STZ (Sigma, Deisenhofen, Germany) to induce type 1 diabetes. STZ was dissolved in sterile citrate buffer (pH 4.5) and injected intraperitoneally (65 mg/kg body weight) within 10 min of preparation. The non-diabetic rats initially injected with STZ vehicles served as controls (group Con, n = 10). Diabetes mellitus was confirmed by measuring glucose levels in tail venous blood using a B-glucose analyzer (HemoCue, Angelholm, Sweden) 7 days later. Rats with random blood glucose levels>Do experimentů bylo zahrnuto 16,7 mmol/l.

Diabetické krysy pak dostaly telmisartan (Merck, PHR 1855, 10 mg kg-1 ·d-1 po, skupina DM plus Tel, n=10) nebo vehikulum (skupina DM, n=10) sondou po dobu 4 týdnů. Telmisartan použitý v tomto článku byl získán od Sigma-Aldrich Germany, Inc., jehož čistota je 98 procent plus (HPLC). Periodicky byla měřena hladina glukózy v krvi a tělesné hmotnosti a vzorky moči pro kvantitativní měření albuminurie byly odebírány v metabolických klecích. Krysy byly po 4 týdnech usmrceny v anestezii, ledviny byly vyjmuty a zváženy pro histologickou analýzu a extrakci proteinu.

3. Močový albumin

Vzorky moči byly centrifugovány při 10, 000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut, aby se odstranily nerozpustné materiály. Supernatant byl rozdělen na alikvoty a skladován při -80 °C až do použití. Souprava ELISA pro krysí urinární albumin od společnosti Chondrex (Redmond, WA) byla použita podle pokynů výrobce.

4. Rychlost clearance kreatininu

Pro stanovení kreatininu v krvi a moči byla použita souprava Creatinin Assay kit (Nanjing Jiancheng, C011-2-1). Ccr bylo vypočteno podle vzorce: Ccr=(kreatinin v moči*24h objem moči)/(kreatinin v krvi*24h*60min/h)/konečná hmotnost (kg).

5. Imunohistochemické a barvení TUNEL

Ledviny byly nařezány v řezacím mikrotomu na 7–8 μm a fixovány 4% paraformaldehydem v PBS po dobu 10 min. Blokování bylo provedeno pufrem (PBS, 2 procenta BSA, 10 procent FBS) po dobu 1 hodiny, po které následovala 10 minutová inkubace s druhým pufrem (PBS, 0,4 procenta Tritonu). Primární protilátka proti -SMA (Servicebio, GB13044) nebo NPHS2 (Abcam, ab229037) byla inkubována po dobu 3 hodin při pokojové teplotě ve zvlhčené komoře. Po promytí byly řezy inkubovány s Cy3 kozím anti-myším IgG (H plus L) (Servicebio, GB21301), HRP konjugovaným kozím anti-králičím IgG (H plus L) (Servicebio, GB23303) nebo imunofluorescenčním TUNELem (Servicebio, G1501 ) reakce ve vlhké komoře (tma, 37 stupňů, 1 h). Řezy byly poté kontrastně obarveny DAPI (Servicebio, G1012) pro detekci jader. Nakonec byly obarvené řezy zapuštěny do těsnící kapaliny odolné proti fluorescenci zhášejícím a zobrazeny pomocí fluorescenčního mikroskopu (NIKON ECLIPSE C1, Japonsko).

Extrakt z cistanche

6. Buněčná kultura

Lidské ledvinové mesangiální buňky (HRMC) byly získány od ScienCell Research Laboratories, Santiago, CA, a kultivovány v Mesangial Cell Medium (MsCM, ScienCell Research Laboratories). HRMC byly naneseny na baňku potaženou poly-L-lysinem (2 ug/cm2) a pěstovány při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 procent C02. Buňky v tomto experimentu byly použity ve 3–4 pasážích a byly zkoumány, aby se zajistilo, že vykazují specifické vlastnosti mezangiálních buněk. Buněčná linie myších podocytů MPC-5 byla získána z ATCC, Maryland, Spojené státy americké. Buňky byly pěstovány na kolagenu typu I v RPMI 1640 (10 procent FBS) s 50 U/ml IFN- při 33 stupních až 85 procentní konfluenci a poté přeneseny do 37 stupňů bez IFN- po dobu 10–14 dnů pro diferenciaci.

7. Test buněčné životaschopnosti a proliferace

K měření buněčné proliferace a životaschopnosti buněk byla použita sada Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Buňky byly nasazeny do každé jamky 96-jamkových kultivačních destiček (5 x 103/jamku). Po ošetření bylo přidáno 10 ul CCK-8 (Beyotime, Shanghai, Čína) a inkubováno po dobu 1 hodiny při 37 °C. Absorbance byla měřena pomocí čtečky mikrodestiček (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Spojené státy americké) při vlnové délce 450 nm.

8. Barvení annexinem V a propidium jodidem

Buňky byly naneseny a pěstovány, dokud nedosáhly 60% konfluence, a poté byly ošetřeny vysokým obsahem glukózy (50 mmol/l) nebo telmisartanem. Po 96 hodinách byly shromážděné buňky promyty studeným PBS a resuspendovány ve vazebném pufru. Annexin V-FITC a PI (eBioscience, Santiago, CA, Spojené státy americké) byly přidány k buněčné suspenzi podle pokynů výrobce a vzorek fluorescence 10,000 buněk byl analyzován průtokovou cytometrií provedenou pomocí FACScan ( Becton, Dickinson, and Company, Franklin, NJ, Spojené státy americké).

9. Western blotting

Ledvinová kůra, HRMC a MPC-5 byly homogenizovány v tkáňovém nebo buněčném proteinovém extrakčním činidle (Beyotime) doplněném inhibitory proteázy a fosfatázy (Merck, Whitehouse Station, NJ, Spojené státy americké). Vzorky byly odděleny na 10% SDS PAGE a přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Pall Corporation, NY, Spojené státy americké). Membrána byla blokována 5% hovězím sérovým albuminem a blotována protilátkami. Anti-PKC 1 (Cell Signaling Technology, 46 809), anti-swiprosin-1 (Abcam, ab24368), TGF{10}} (Abcam, ab215715), Tubulin (Beyotime, AT819) a GAPDH (Beyotime, AF5009, AF5 ) byly použity v koncentraci 1:1,000. Proteiny byly vizualizovány pomocí IRDye-konjugovaných anti-myších nebo anti-králičích sekundárních protilátek (Rockland, Limerick, PA, Spojené státy americké) v poměru 1:5,000. Použití ODYSSEY INFRARED IMAGING SYSTEM (LI-COR) k analýze výsledků.

10. Statistické analýzy

Zpracování dat bylo analyzováno pomocí Origin 6.1 (OriginLab, Northampton, MA) a vyjádřeno jako průměr ± SD z alespoň tří nezávislých experimentů. Statistická významnost byla stanovena pomocí ANOVA. Hodnota p < 0,05 byla považována za statisticky významnou.

Cistanche tubulosa

DISKUSE

Telmisartan je selektivní blokátor receptoru AT1, který se klinicky používá ke snížení zvýšeného krevního tlaku a vylučování bílkovin močí u hypertoniků (Baden et al., 2008; Mann et al., 2009). Několik klinických studií naznačilo, že telmisartan je účinný při snižování proteinurie u pacientů s makroalbuminurií a oddaluje nástup a progresi diabetické nefropatie (Makino et al., 2005; Nakamura et al., 2010; Fujita et al., 2011; Schmieder et al. ., 2011). V této studii perorální léčba telmisartanem u potkanů ​​s diabetem vyvolaným STZ zabránila nástupu časných abnormalit v ledvinách a celkově, včetně snížení tělesné hmotnosti, glukózy v krvi a bílkovin v moči. Tyto výsledky potvrdily, že telmisartan má renoprotekci u myší s časnou diabetickou nefropatií. Ještě důležitější je, že tato studie zjistila, že ochranný účinek telmisartanu na diabetické glomeruly se odráží v antiapoptotických a proapoptotických účincích na podocyty a mezangiální buňky.

Koncové produkty pokročilé glykace (AGE) by mohly způsobit poškození a oddělení DNA podocytů částečně prostřednictvím stimulace osy Ang II-AT1R, a tak poskytnout inovativní prospěšnou vlastnost telmisartanu v DKD (Fukami et al., 2013). U normotenzních proteinurických glomerulárních onemocnění nízkého stupně zmírňuje léčba telmisartanem v časném stadiu onemocnění glomerulární a tubulointersticiální poškození (Villa et al., 2011). A několik drah je pravděpodobně spojeno s pleiotropními důsledky včetně signalizace růstového faktoru, savčího cíle signalizace rapamycinu, ubikvitinace proteinu, dráhy Wnt-beta kateninu a signalizace hypoxie (Villa et al., 2011).

Nedávno jsme uvedli, že swiprosin-1 (Wang et al., 2018b), další název pro doménu EF-hand obsahující 2 (EFhd2), hrál kritickou roli v progresi DKD zahájené po indukci, zatímco lokalizoval v podocytech myšího glomerulu. Absence swiprosinu-1 zlepšila apoptózu podocytů závislou na mitochondriích stimulovanou hyperglykémií nebo vysokou hladinou glukózy prostřednictvím signální dráhy p38 MAPK. Zde jsme také zjistili, že telmisartan inhibuje hyperglykémii nebo vysokou glukózou indukovanou expresi swiprosinu{10}} in vivo i in vitro, což naznačuje, že antiapoptózní účinek telmisartanu na podocyty může souviset s regulací swiprosinu{10}} {12}} výraz.

Bylo zjištěno, že proliferace mesangiálních buněk a nadměrné ukládání proteinů extracelulární matrix přispívají k rozvoji DKD (Lee et al., 2004). Předchozí studie ukázaly, že vysoká hladina glukózy by mohla vyvolat expresi mezangiálních proteinů extracelulární matrix při hyperglykémii (Taniguchi et al., 2013). -SMA se obecně používá k odlišení mezangiálních buněk od jiných glomerulárních buněk u myší s diabetem indukovaným STZ a zvýšená exprese SMA by mohla být markerem fenotypových posunů mezangiálních buněk z neaktivované fáze do proliferativní, sekrečně aktivované fáze (Niu a kol., 2014). Zde jsme zjistili, že telmisartan snižuje expresi -SMA v diabetickém glomerulu. Kromě toho bylo hlášeno, že proliferace mesangiálních buněk má významný dopad na patogenezi DKD (Zeng et al., 2013). Naše výsledky v této studii odrážely časově a dávkově závislý snížený účinek telmisartanu na proliferaci mesangiálních buněk související s proapoptotickými charakteristikami.

Klinické důkazy doporučují, že telmisartan je při zmírňování proteinurie u hypertoniků s DKD účinnější než losartan, což může souviset s jeho schopností částečně agonizovat PPAR (Bichu et al., 2009). Kromě toho byly tyto příznivé změny, jako je prevence renální atrofie a fibrózy telmisartanu, spojeny se snížením exprese TGF 1 a dalších prozánětlivých a profibrotických cytokinových genů prostřednictvím aktivace PPAR/HGF (Kusunoki et al., 2012), nezávisle blokády receptoru Ang II typu 1. Zde jsme také našli telmisartanem specificky aktivovanou expresi genu PPAR v mezangiálních buňkách a proapoptotický účinek způsobený telmisartanem na mesangiální buňky by mohl být zmírněn inhibitory PPAR.

PKC 1 je jednou z extenzivně exprimovaných rodin serin-threonin kináz, které transdukují širokou škálu buněčných progresí substrátově specifickou fosforylací (Newton, 1995). Bylo hlášeno, že nejen zvýšená aktivita PKC, ale také její hladiny mRNA jsou pozorovány v biopsiích lidské diabetické nefropatie (Langham et al., 2008). Hyperglykémií indukovaná exprese a aktivace PKC má pleiotropní účinky v mezangiálních buňkách, včetně podpory nadměrné akumulace ECM proteinů (Brownlee, 2001). Studie ukázaly, že inhibice PKC zeslabuje glomerulární hypercelularitu a expanzi extracelulární matrix u db/db myší a glomerulární dysfunkci u STZ-krys (Ishii et al., 1996; Koya et al., 2000). Podobně inhibitor PKC zeslabil proliferaci mesangiálních buněk a produkci kolagenu řízenou růstovým faktorem odvozeným od destiček (PDGF) (Tokuyama et al., 2011). V naší studii telmisartan snižoval upregulaci mRNA PKC 1 a expresi proteinu v hyperglykémií stimulovaných mesangiálních buňkách. Kromě toho exprese TGF 1 v mezangiálních buňkách indukovaná vysokým obsahem glukózy by mohla být také inhibována telmisartanem.

Jak AT1, tak AT2 receptory, dobře známé jako sedm transmembránových receptorů spřažených s G proteinem, byly klonovány a farmakologicky ilustrovány (Touyz a Berry, 2002). Receptory AT1 mohou být selektivně antagonizovány telmisartanem, zatímco blokátory receptoru AT1 mohou indukovat expresi receptorů AT2 (Touyz a Berry, 2002). Studie ukázaly, že receptory AT1 uplatňují svůj vliv tím, že omezují růst buněk a vyvolávají apoptózu (Horiuchi et al., 1997; Touyz et al., 1999). Navíc receptory AT2 indukují buněčnou apoptózu ve specifické konformaci prostřednictvím apoptotické signalizace zprostředkované p38 MAPK (Miura a Karnik, 2000). V naší práci byla exprese AT1 a AT2 mRNA nezměněna v kultivovaných mezangiálních buňkách stimulovaných telmisartanem nebo hyperglykémií. Proto telmisartanem indukovaná apoptóza mesangiálních buněk a snížená exprese PKC 1 nemusí být zprostředkovány receptory AT1 a AT2.

Kapsle Cistanche

Závěrem lze říci, že telmisartan zmírnil časné glomerulární poškození u krys s diabetem typu 1 inhibicí apoptózy podocytů a podporou mezangiální apoptózy. Antiapoptotický účinek telmisartanu v podocytech může souviset s jeho inhibicí exprese swiprosinu-1, zatímco proapoptotický účinek na mezangiální buňky byl částečně spojen s jeho agonistickým účinkem na PPAR. Navíc telmisartan selektivně blokoval expresi PKC 1/TGF 1 v mezangiálních buňkách, ale ne v podocytech. Pokročilé studie jsou nezbytné k objasnění opačných, ale prospěšných účinků telmisartanu na podocyty a mezangiální buňky a základní molekulární mechanismy.

Xin Wei 1, Yabin Ma2, Ya Li 3, Wenzhao Zhang4, Yuting Zhong5, Yue Yu6, Li-Chao Zhang5, Zhibin Wang4 a Ye Tu2

1 Department of Clinical Pharmacy, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai, China,

2 Oddělení farmacie, Shanghai East Hospital, Tongji University, Šanghaj, Čína,

3 Oddělení klinické farmacie, Centrum klinických zkoušek, První přidružená nemocnice Shandong First Medical University a Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, Jinan, Čína,

4 Ústav kritické péče, School of Anesthesiology, Naval Medical University, Šanghaj, Čína,

5 Oddělení farmacie, Městská nemocnice tradiční čínské medicíny v Šanghaji, Šanghaj, Čína,

6 Institute of Vascular Disease, Shanghai TCM-Integrated Hospital, Shanghai, China