Jako experimentální materiál byl použit Tetrahymena Thermophila

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

V tomto experimentu byl jako experimentální materiál použit Tetrahymena thermophila. T. thermophila je volně žijící nálevník, který se široce vyskytuje v globálních vodních ekosystémech a je podobný buňkám metazoí ve struktuře a funkční složitosti15. Objev ribozynnelu6 a telomeraselu7 v Tetrahymeně významně podpořil výzkum mechanismů proti stárnutí, který byl oceněn dvěma Nobelovými cenami8. Díky svému krátkému růstovému cyklu, snadné kultivaci a jasnému genetickému pozadí, T. thermophile by mohl poskytnout duální výzkum in vivo a in vitro v jednom experimentálním designu. T. thermophila se úspěšně používá při screeningu léků a farmakologických mechanismech20. Ještě důležitější je, že byly odhaleny informace o molekulární evoluci skupiny glutathionperoxidáz T. thermophila9-2. Informační profil T.cistanche džingischánthermophila GPX geny lze získat z Tetrahymena Functional Genomics Database (TetraFGD) (http://tfgd.ihb.ac.cn/) a TGD (http://ww. ciliate.org)22. Deset z dvanácti domnělých GPX byly identifikovány jako fosfolipid hydroperoxid glutathion peroxidáza (PHGPx) ve srovnávací databázi genomu Tetrahymena. PHP, na selenu závislý GPX, může specificky redukovat fosfolipidový hydroperoxid, aby chránil lecitinové lipozomy a biofilmy před oxidačním poškozením23. PHGPxin T. thermophila má průměrnou molekulovou hmotnost přibližně 21,7 kDa22, což je podobné molekulové hmotnosti (20-22 kDa) monomerního proteinu PHGPx popsaného u savců24. Navíc velký počet zpráv ukázal, že GPX exprese Tthermophila byla kvantitativně odlišná a závisela na zdroji stresu (oxidant, induktor apoptózy nebo kov)2122 a době expozice20-24

Kliknutím sem se dozvíte více

Porovnáním účinků vodného extraktu a hlavních monomerů G.lucidum na růstovou křivku a maximální hustotu T. thermophila tato studie získala nejlepší extrakt z G. lucidum proti stárnutí. Mechanismus proti stárnutí G. lucidum, zejména určení typu účinku rodiny GPX, byl zkoumán na molekulární, buněčné a individuální úrovni. Očekává se, že výsledky této studie přispějí ke klinické aplikaci produktů G. lucidum.

Materiály a metody

Vodný extrakt a monomery Ganoderma lucidum. S odkazem na zprávu Cuong 25,20 g sušené G. lucidum (Changbai Mountain Senbao Specialty Store, Jilin) ​​bylo rozemleto a extrahováno v 1000 ml ddHO. Vodný extrakt byl shromážděn centrifugací, zakoncentrován na 100 ml vakuovým sušením a skladován při -20 stupni až do použití.

Polysacharid G. lucidum, kyselina ganoderová A, Ganoderal A a ergosterol z G. lucidum byly zakoupeny od Chengdu Must Biotechnology Co., Ltd. Tyto tři standardy byly rozpuštěny v methanolu podle jednotného návrhu a přidány do SPP média. Buněčná kultivace a medikamentózní léčba. Tetrahymenathermophila (SB210) poskytl Hydrobiologický ústav Čínské akademie věd, Wuhan, IPR Čína. T. thermophila byla kultivována ve 28stupňovém inkubátoru. Médium SPP obsahovalo 2 procenta (hm./obj.) proteosového peptonu, 0,1 procenta kvasinkového extraktu (Oxoid), 0,2 procenta glukózy a 0,003 procenta sekvestrenu. Podle jednotného designu (doplňkové tabulky S1 a S2), vodný extrakt G. lucidum,G. do kultivačního média byly přidány lucidum polysacharid, kyselina ganoderová A, ganoderal A a ergosterol G. lucidum. Kontrolní skupina byla nahrazena stejným objemem dvakrát destilované vody se 3 paralelními vzorky v každé skupině. Po vstupu do logaritmické fáze byly vzorky odebírány každé 2 hodiny až do fáze poklesu. Hustota T. thermophila byla spočítána tabulí pro počítání krvinek a byl nakreslen vztah mezi hustotou T. thermophila a časem.

Transkripční analýza. Experiment byl proveden s 24-jamkovou destičkou a každá jamka byla vyrobena z 900 ul SPP. V experimentální skupině bylo přidáno 100 μl 200 mg/ml vodného extraktu G. lucidum. Kontrolní skupina byla místo toho ošetřena 100 ul ddH0. V každé skupině byly nastaveny tři paralelní vzorky.cistanche prodloužení životnostiKontrolní skupina i experimentální skupina byly v logaritmické fázi (20} h) a fáze poklesu (27 h) byla shromážděna pro transkriptomickou analýzu. Každá skupina byla biologicky duplikována a všechny vzorky byly podrobeny testu mikročipů s celým transkriptem (Biomarker Technologies, Peking, Čína). Profil genové exprese byl detekován pomocí Affymetrix 3'IVT Expression Array Pro snížení účinku exprese hodnotných genů byly jako kritéria pro screening použity RPKM větší nebo rovno 5 a FC(násobná změna) větší nebo rovno 2 odlišně exprimované geny (DEGs) KOBAS byl použit k realizaci analýzy cesty GeneOntology (GO) a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Dráha obohacení byla určena korigovanou hodnotou P-adj menší nebo rovnou 0,05. Výsledky transkriptomu byly ověřeny pomocí kvantitativní reverzní transkripční PCR (RT-qPCR) (Metoda viz doplňkový soubor). Poté byla vytvořena síť interakce protein-protein (PPI) na základě databáze STRING a centrální gen byl testován pomocí CytoHubla k identifikaci centrálního uzlu v softwaru Cytoscape.

Pozorování barvením stříbrem a transmisní elektronovou mikroskopií (TEM). Postup barvení stříbrem byl podle Foissnerovy metody26. thermophila byla pozorována pod olejovým mikroskopem. Ultrastruktura T. thermophila byla pozorována pomocí TEM. Buňky ošetřené vodným extraktem G.lucidum a kontrolní skupina byly shromážděny centrifugací při 600 x g po dobu 2 minut. Buňky byly předem fixovány ve 2,5 procentech glutaraldehydu a udržovány při 4 stupních po dobu 8 hodin. Vzorky byly třikrát promyty PBS (pH 7,5), centrifugovány při 3000 x g po dobu 5 minut a poté fixovány 1 procentem oxidu osmičelého (4 hodiny). Poté byla provedena dehydratace s použitím gradientu acetonu 15 až 100 procent. Poté byly buňky zality do pryskyřice Embed 812 (TAAB) s nízkou viskozitou. Po vytvrzení byly ultratenké řezy (60-80 nm) nařezány ultratenkým řezačem. Ultrastruktura byla pozorována transmisním elektronovým mikroskopem (JEOL JEM-1010, Japonsko).

Stanovení poškození buněk. Intracelulární lROS byla detekována citlivou fluorescenční sondou 2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetát (DCFH-DA)27. Aktivita malondialdehydu (MDA) byla stanovena komerčními soupravami poskytnutými Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Jiangsu, Čína). Metoda pro stanovení schopnosti eliminovat hydroxylové radikály (·OH) byla popsána Takemurou28. Schopnost vodného extraktu G. lucidum eliminovat volné radikály OH byla vyjádřena jako optická hustota experimentální skupiny mínus optická hustota kontrolní skupiny.

Cistanche může proti stárnutí

Aktivita PHGPx. Poměr nikotinamid adenindinukleotid fosfát (NADPH)/NADP* a poměr glutathion/glutathiondisulfid (GSH/GSSG) byly stanoveny pomocí sady NADP*/NADPH Quantification Kit (S0179, Beyotime), GSH/GSSG Assay Kit (S0053, Beyotime). testy byly provedeny podle protokolu výrobce.

Výsledek

Účinky vodného extraktu G.lucidum a monomerů G.lucidum na růst T. ther-mochila. Stejně jako předchozí studie7, G. polysacharid lucidum byl hlavní složkou vodného extraktu G. lucidum v tomto experimentu podle identifikace spektrofotometrem (doplňkový obr. S1). Účinné látky vodného extraktu G. lucidum byly také analyzovány pomocí GC-MS. Celkový iontový diagram vodného extraktu G. lucidum ukázal, že ve vodném extraktu existovaly všechny složky (doplňkový obr. S2). Mezi sloučeninami vodného extraktu G.lucidum (doplňkové tabulky S3 a S4), G. kyselina lucidum A, Ganoderal A a ergosterol G. lucidum byly vybrány podle jejich retenčního času a stupně shody.

Aby bylo možné porovnat účinky vodného extraktu G. lucidum a těchto hlavních monomerů na růst T. thermophila, byly vodný extrakt G. lucidum a roztok monomerů G. lucidum přidány do kultivačního média T. thermophila. Výsledky jsou ukázány na obr. 1. Maximální hustota kontrolní skupiny byla 6x104 buněk/ml po 24 hodinách. Hustota buněk skupiny s vodným extraktem G. lucidum od 12 do 20 hodin byla téměř stejná jako u kontrolní skupiny, ale od 20 do 25 hodin byla významně vyšší než hustota buněk kontrolní skupiny.cistanche nzSoučasně byla logaritmická fáze prodloužena o 1 hodinu, maximální hustota byla 1,15×105 buněk/ml. Ačkoli maximální hustota polysacharidové skupiny G. lucidum byla vyšší než u kontrolní skupiny o 9,7 x 104 buněk/ml, byla nižší než u skupiny s vodným extraktem G. lucidum. Maximální hustota G. lucidum acid A, Ganoderal A a G. lucidum ergosterolu nepřesáhla hustotu kontrolní skupiny, což ukázalo, že alkoholové soluty těchto monomerů nevedly k růstu T. thermophila. Dalo by se dojít k závěru, že vodný extrakt G.lucidum obsahující různé účinné látky může podporovat růst T. thermophila více než jeho monomery.

Anti-aging efekt vodného extraktu G. lucidum. S rostoucí dobou kultivace byla intenzita světla ROS ve fázi poklesu (obr. 2b) vyšší než v logaritmické fázi (obr. 2a). Po přidání vodného extraktu G. lucidum, ačkoli intenzita fluorescence fáze poklesu (obr. 2d) byla stále zvýšená ve srovnání s logaritmickou fází (obr. 2c), byla významně nižší než u kontrolní skupiny. Obsah MDA v kontrolní skupině byl také vyšší ve fázi poklesu než v logaritmické fázi (obr. 2e). Mezitím byla schopnost vychytávání OH ve fázi poklesu nižší než v logaritmické fázi (obr. 2e). Rovnováha mezi oxidací a redukcí se ztratila a tělo stárlo. Po přidání vodného extraktu G. lucidum byl obsah MDA nižší než v kontrolní skupině (levý sloupec na obr. 2e) a množství OH zachycené buňkami v logaritmické fázi a fázi poklesu bylo vyšší než v kontrolní skupině. kontrolní skupina (pravý sloupec na obr. 2e). Růst T[ thermophila lze srovnat s procesem stárnutí mnohobuněčných organismů prostřednictvím jeho buněčného poškození. Jak se ROS a MDA akumulovaly, růst byl inhibován a hustota T. thermophila byla snížena. Přídavek vodného extraktu G. lucidum by mohl udržet redoxní rovnováhu u T. thermophila a dosáhnout účinků proti stárnutí.

Analýza odlišně exprimovaných genů a verifikace pomocí RT-qPCR. Ve srovnání s kontrolní skupinou se exprese 11 519 genů v logaritmické fázi T. thermophila významně změnila po přidání vodného extraktu G. lucidum k SPP. Mezi nimi bylo 6201 genů up-regulovaných a 5318 genů down-regulovaných.velikost penisu cistancheExprese 8772 genů se významně změnila během fáze poklesu, z nichž 4721 genů bylo up-regulováno a 4051 genů bylo regulováno směrem dolů. V předchozích studiích v naší laboratoři,

anti-aging účinek G.lucidum na Stylonychia se projevil v antioxidačním indexu, takže 10 genů (doplňková tabulka S5) souvisejících s antioxidanty bylo náhodně vybráno z DEG a přesnost dat RNA-seq byla ověřena pomocí RT- qPCR. Vzorce exprese těchto 10 genů v logaritmické fázi a fázi poklesu byly v souladu s trendem dat RNA-seq (doplňkový obr. S3). Výsledek ukázal, že data RNA-seq byla spolehlivá a mohla být použita pro následnou analýzu.

GO obohacení a analýzy KEGG dráhy. DEG v logaritmické fázi byly zapojeny do 14 biologických procesů (BP) se 6 typy molekulárních funkcí (MF) a existovaly ve všech buněčných komponentách (CC) (obr. 3a). DEG ve fázi poklesu byly zapojeny do 12 BP se 4 druhy MF a existovaly ve 12 CC Nejvýznamněji zapojený BP ve dvou fázích byl metabolický proces, MF byl vazebný a CC byl membránový. Mezi metabolickým procesem, vazbou a membránou tvořily up-regulované geny 70 procent v logaritmické fázi (obr. 3b) a 75 procent ve fázi poklesu (obr. 3c). Tyto výsledky ukazují, že vodný extrakt G. lucidum by mohl podporovat zachování integrity buněčné membrány v obou fázích.

Pro další analýzu stupňů mezi dvěma fázemi byla provedena analýza obohacení KEGG dráhy. V logaritmické fázi bylo koncentrováno 94 drah, z nichž 68 procent celkových genů bylo zapojeno do metabolismu. Ve fázi poklesu bylo obohaceno 91 drah, mezi nimiž byl metabolismus stále největší cestou, představující 68 procent. 20 nejlepších drah v logaritmické fázi (obr. 3d) a fázi poklesu (obr. 3e) bylo použito k nakreslení bublinového grafu a ukázalo se, že bez ohledu na význam nebo počet zapojených genů, účinek G.cistanche prášeklucidum vodný extrakt primárně zaměřený na metabolickou dráhu glutathionu. V logaritmické fázi bylo touto cestou obohaceno 38 odlišně exprimovaných genů, což představuje 45 procent. Ve fázi poklesu bylo touto cestou obohaceno 43 odlišně exprimovaných genů, což představuje 50 procent.

Protein-protein interakce (PPI) sítě DEGs. Objasnění DEG v metabolické dráze glutathionu a vhled do jejich interakcí s jinými proteiny pomůže dále prozkoumat potenciální regulační mechanismus vodného extraktu G. lucidum. Jak logaritmická fáze (obr. 4a), tak fáze poklesu (obr. 4b) měly nejdůležitější vliv na GPX1, GPX2, GPX7 a GPX11. Prostřednictvím dotazu databáze TetraFGD tyto enzymy GPX patřily do PHGPx (doplňková tabulka S6). Proto antioxidační enzymy, zejména PHGPx, hrají důležitou roli při podpoře růstu T. thermophila prostřednictvím indukce vodného extraktu G. lucidum.

Ověření aktivity a funkce GPS. Aktivita PHGPx se vztahuje k rychlosti poklesu absorpce NADPH2". Hodnota NADPH/NADP* ve fázi poklesu u kontrolní skupiny byla nižší než v logaritmické fázi (obr. 5a). Výsledek naznačoval, že aktivita PHGPx klesal s rostoucí dobou kultivace. Po přidání vodného extraktu G. lucidum byla plusová hodnota NADPH/NADP ve fázi poklesu stále nižší než v logaritmické fázi, ale vyšší než v obou fázích kontrolní skupiny. Tento výsledek ukázal, že vodný extrakt G.lucidum by mohl podporovat aktivitu PHGPx.

PHP může specificky katalyzovat redukci fosfolipidového hydroperoxidu redukovaným glutathionem (GSH), aby došlo k účinné přeměně toxického lipidového peroxidu (PL-PUFA-OOH) na netoxické polynenasycené mastné kyseliny (PL-PUFA-OH)30. Změna poměru GSH/GSSH může odrážet změnu PL-PUFA-OOH a PL-PUFA-OH V důsledku poklesu aktivity PHGPx (obr. 5a) se poměr GSH/GSSH v kontrolní skupině také snížil s prodloužení doby kultivace (obr. 5b). Avšak po přidání vodného extraktu G.lucidum se poměr GSH/GSSH zvýšil v logaritmické fázi a fázi poklesu. Intracelulární toxický PL-PUFA-OOH v experimentální skupině byl transformován na netoxický PL-PUFA-OH, což bylo více než u kontrolní skupiny. Pozorování mikroskopické morfologie a ultrastruktury. Ochranný účinek vodného extraktu G. Luci-dum na membránu byl vizualizován barvením čpavkovým stříbrem a TEM. Porovnáním logaritmické fáze kontrolní skupiny (obr. 6a) a fáze poklesu kontrolní skupiny (obr. 6c) bylo zjištěno, že buněčná morfologie T. thermophila byla vážně deformována prodloužením doby kultivace a jádro bylo rozmazané, což naznačuje, že buňky vypadaly jako ve stavu stárnutí. Nicméně ve skupině vodného extraktu G.lucidum byla morfologie a integrita buněk dobře chráněna v logaritmické fázi (obr. 6e) a fázi poklesu (obr. 6g). Ultrastrukturální změny v buňkách byly pozorovány pomocí TEM. Hřeben a obrys mitochondrií byly rozmazané ve fázi poklesu (obr. 6d) ve srovnání s logaritmickou fází (obr. 6b) v kontrolní skupině. Rozpad mitochondrií se zvyšoval s prodloužením doby kultivace. Přidání vodného extraktu G. lucidum zlepšilo morfologii mitochondrií v logaritmické fázi (obr. 6f) a fázi poklesu (obr. 6h). Vodný extrakt G. lucidum zaručoval funkci mitochondrií, která úzce souvisí s integritou membrány. Je třeba poznamenat, že v logaritmické fázi mitochondrie v experimentální skupině vykazovaly morfologické změny (obr. 6f, h), ale integrita membrány nebyla ovlivněna.

Diskuse

Aplikace extraktů G.lucidum má dlouhou historii jak v tradiční čínské medicíně, tak ve východní Asii. Velké množství studií prokázalo jejich účinnost. Předchozí zprávy zjistily, že vodný extrakt G.lucidum obsahoval nejen polysacharidy G.lucidum, ale také triterpenoidy Glucidum. Podle předchozích zpráv jsou Ganoderma kyselina, Ganoderma aldehyd a Ganoderma ergosterol hlavními složkami G. lucidum triterpene 3. Působí různými opravnými funkcemi pro buňky (Tabulka 1). Vodný extrakt Ganoderma lucidum obsahuje celou řadu aktivních látek, integrujících funkce dalších čtyř aktivních látek, které nejen odolávají oxidaci, ale také zachovávají integritu membrány. V této studii,

podpora růstu vodného extraktu G. lucidum na T. thermophila ověřila tento inkluzní vztah. Prostřednictvím analýzy vodného extraktu G. lucidum pomocí totální iontové průtokové chromatografie (doplňkový obr. S2) bylo možné zjistit, že doba rozpouštění různých účinných látek byla různá. Vodný extrakt G. lucidum se tak s prodloužením doby varu stává komplexním organickým rozpouštědlem. Myslíme si, že účinné látky ve vodném extraktu G.lucidum mohou působit v různých časech, což vede k synergii. To by měla být další studie v budoucnu.

Analýza transkriptomu T. thermophila zkoumala účinek vodného extraktu G. lucidum na genovou expresi během růstu. Po ošetření vodným extraktem G. lucidum se PHGPx jevil jako klíčový vliv na hustotu buněk a dobu generování. Tento výsledek potvrdil, že vodný extrakt G.lucidum působil na selen-dependentní typ rodiny GPX. PHP je multifunkční selenoprotein široce distribuovaný v těle, který se může nejen účastnit antioxidačních reakcí, ale také přímo redukovat lipidy v membráně, aby chránil integritu membránového systému40. Ve srovnání s jinými GPX má PHGPx menší objem a větší hydrofobnost. Mnoho zpráv prokázalo, že nadměrná exprese PHGPx v buňkách může odolat buněčné odpovědi na endogenní (např. stárnutí) fl a exogenní (např. environmentální) peroxidační poškození 2-45. PHP je jediný enzym, který může přímo redukovat PL-PUFA- OOH membrány na odpovídající hydroxylové sloučeniny, čímž se umožní ukončení peroxidace a ochrana biologické membrány před poškozením peroxidací4647. Zvýšení obsahu PL-PUFA-OOH bylo důvodem poškození buněčné membrány u kontrolní skupiny během fáze poklesu, která se stala začarovaným kruhem a urychlila stárnutí buněk. V této studii byly obsahy ROS a MDA (Obr. 2) T.thermophila v kontrolní skupině se zvyšoval s rostoucí dobou kultivace. Membrána se při morfologickém pozorování jevila jako vážná deformace ve fázi poklesu. Nicméně, když byl přidán vodný extrakt G. lucidun, byla exprese PHGPx up-regulována. PL-PUFA-OOH na membráně byl tedy transformován na netoxický PL-PUFA-OH a stabilita membránové struktury je zvýšena jak v logaritmické fázi, tak ve fázi poklesu. Podle pozorování membrány barvením čpavkovým stříbrem a TEM bylo možné usoudit, že vodný extrakt G.lucidum pronikl buněčnou membránou během procesu růstu. Tento reparační účinek na buněčnou membránu by mohl přimět aktivní látky vodného extraktu G. lucidum, aby vstoupily do cytoplazmy a chránily membránovou strukturu jádra a mitochondrií, aby podpořily metabolismus T. thermophila a dosáhly účinků proti stárnutí. Jak ukazují výsledky obohacení lKEGG, v metabolických drahách je koncentrováno velké množství diferenciálních genů. Tyto výsledky ukázaly, že vodný extrakt G. lucidum byl prospěšný pro metabolismus glutathionu a eliminaci toxických peroxidů produkovaných stárnutím buněk.

Obecně vodný extrakt G. lucidum podporoval expresi enzymu PHGPx závislého na selenu v rodině GPX. Zvýšení aktivity PHGPx by mohlo nejen snížit reakci na oxidační stres in vivo, ale také specificky a účinně snížit ukládání lipidů na biologické membráně a zachovat integritu membrány (obr. 7). Účinné látky ve vodném extraktu G. lucidum se následně dostávají do buněk přes neporušenou membránu a podporují jejich metabolismus. To vytvořilo ctnostný cyklus k dosažení účinku proti stárnutí.

Tento článek je převzat z Scientifc Reports|(2022) 12:3139|https://doi.org/10.1038/s41598-022-06985-z