Účinky Xiaoyaosanu na signální dráhu CAMP v mozkové kůře depresivních krys

 

Abstraktní

Objektivní:Vyhodnotit změny sérového prostaglandinu E2 (PGE2) a substance P (SP) a mRNA exprese cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP) a cAMP response element-binding protein 1 (CREB1) v mozkové kůře depresivních potkanů ​​a prozkoumat molekulární mechanismus, kterým Xiaoyaosan působí antidepresivně.

Metody: Čtyřicet osm samců SD potkanů ​​bylo náhodně rozděleno do čtyř skupin (n=12 každé): normální, model, Xiaoyaosan a fluoxetin. Byl vytvořen model deprese pomocí chronického imobilizačního stresu (CIS). Xiaoyaosan byl podáván sondou 30 minut před denním modelováním po dobu 21 dnů. Účinky podobné antidepresivu byly hodnoceny makroskopickým pozorováním chování, testem preference sacharózy, testem v otevřeném poli a testem nuceného plavání. Hladiny kortikálního cAMP a CREB1 mRNA byly kvantifikovány fluorescenční qPCR v reálném čase. Sérové ​​PGE2 a SP byly měřeny enzymem vázaným imunosorbentním testem (ELISA).

Výsledky: Ve srovnání s modelovou skupinou Xiaoyaosan i fluoxetin významně zmírnily chování podobné depresi; zvýšená spotřeba sacharózy, počty vertikálních odchovů, horizontální křížení a péče v testu na otevřeném poli; a sníženou kumulativní dobu nehybnosti v testu nuceného plavání. Obě léčby zlepšily kortikální histopatologii, zvýšily expresi cAMP a CREB1 mRNA v mozkové kůře a snížily hladiny PGE2 a SP v séru (P < 0,01).

Závěr:Xiaoyaosan vykazuje jasné antidepresivní účinky u depresivních potkanů, potenciálně prostřednictvím regulace kortikální cAMP signální dráhy.

Klíčová slova: Xiaoyaosan; Deprese; tábor; CREB1; prostaglandin E2 (PGE2); Látka P (SP)

 

Zavedení

Deprese je celosvětově hlavní příčinou nemocnosti a invalidity, která zásadně zhoršuje kvalitu života. Xiaoyaosan, klasický multi-bylinný přípravek tradiční čínské medicíny (TCM), prokázal klinickou užitečnost napříč běžnými depresivními projevy, což podporuje jeho pokračující vývoj jako botanické terapie.

Mechanicky je signální kaskáda cAMP-proteinkináza A (PKA)-CREB ústřední pro regulaci nálady a afektivního chování. Downregulace této dráhy může urychlit depresivní fenotypy. CREB se podílí na patofyziologii deprese a aktivace cAMP zvyšuje transkripci downstream genů; polymorfismy a funkční redukce v této ose byly považovány za faktory náchylnosti k depresi.

K depresi přispívají i mediátory zánětu. Prostaglandin E2 (PGE2) zprostředkovává zánětlivé reakce a zvýšený PGE2 může vyvolat depresivní chování. Substance P (SP), neuropeptid spojený se stresem a afektem, je často zvýšena v séru pacientů s depresí. Změněná kortikální exprese cAMP a CREB1 mRNA spolu se zvýšeným sérovým PGE2 a SP tedy může představovat molekulární mechanismus, který je základem kortikálního poškození při depresi.

Ačkoli bylo zkoumáno mnoho vzorců sloučenin TCM pro antidepresivní mechanismy, vliv většiny přípravků na dráhu cAMP zůstává nejasný. Pomocí paradigmatu chronického imobilizačního stresu (CIS) k vyvolání chování podobného depresi u potkanů ​​tato studie dále zkoumá antidepresivní mechanismus Xiaoyaosanu a porovnává jej s fluoxetinem, s cílem informovat o budoucím vývoji botanických terapeutik a poskytnout užitečné poznatky pro lidi hledající pomoc při depresi.

JAK BYLINKOVÉ DOPLŇKY TCM ZLEPŠUJÍ PŘÍZNAKY PROSTATITIDY

Materiály

 

Zvířata

Čtyřicet osm zdravých dospělých samců potkanů ​​Sprague–Dawley stupně SPF (ve věku 8 týdnů, 200–220 g) bylo zakoupeno od společnosti Beijing Viton Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd. [Č. licence: SCXK (Beijing) 2016-0006]. Potkani byli chováni v bariérovém zařízení pro zvířata na Univerzitě tradiční čínské medicíny v Guizhou při 22 ± 2 stupních, relativní vlhkosti 35 %–55 %, 12 h světlo/12 h tma (7:00–19:00), čtyři krysy na klec, se 7 dny aklimatizace. Etické schválení: Guizhou University of TCM (č.. 20210142).

JAK BYLINKOVÉ DOPLŇKY TCM ZLEPŠUJÍ PŘÍZNAKY PROSTATITIDY

 

 

 

 

BYLINKOVÉ DOPLŇKY TCM NA PRODEJ

Podrobnosti výpisu

 

 

 

Drogy

Vzorec Xiaoyaosan sledoval proporce Taiping Huimin Heji Ju Fang. Surové byliny byly zakoupeny od Beijing Tongrentang (Bozhou) Decoction Pieces Co., Ltd.: Bupleurum (Chaihu), bílá pivoňka (Baishao), Angelica sinensis (Danggui), smažené Atractylodes (Baizhu), Poria (Fuling), medově smažená lékořice (Zhigancao), kombinace čerstvého a Mentha poměru 5:5:5:5:5:4:1:5. Odvar a koncentrace byly připraveny v souladu s vydáním lékopisu Čínské lidové republiky z roku 2020 od Hunan Jiuzhitang, který slouží jako intervence TCM. Dávky byly převedeny pro krysy, rozpuštěny v deionizované vodě a připraveny jako suspenze.

Jako referenční antidepresivum byly použity kapsle fluoxetin hydrochloridu (Patheon France; baleno společností Eli Lilly Suzhou Pharmaceutical Co., Ltd.; šarže č. . 6663B; 20 mg/kapsle).

Reagencie

ExTaq (TAKARA, kat. DRR100A); SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (2x) (Fermentas, kat. č. K0242); primery (Qingke Bio); Soupravy PGE2 a SP ELISA pro potkany (Shanghai Yuanju Biotechnology Center, kat. CK-E30697 a CK-E30122).

 

Nástroje

7900 fluorescenční qPCR systém v reálném čase (Applied Biosystems, USA); mikropipety (Eppendorf); parafinový mikrotom (HY1508, Jinhua Huiyou); Systém ultračisté vody Aquapro (AJY-0501, Aikepu).

Metody

 

Seskupování a modelování
Potkani byli náhodně rozděleni do normálních, modelových, Xiaoyaosanových a fluoxetinových skupin (v každé n=12). S výjimkou normální skupiny všechny skupiny podstoupily CIS po dobu 3 hodin/den v randomizovaných časech po dobu 21 dnů. Normální krysy nebyly omezovány, ale byly bez jídla a vody během stejných časových období, aby odpovídaly zacházení.

 

Podávání léků

Na základě předchozích studií byl Xiaoyaosan podáván žaludeční sondou v množství 2,22 g surového léčiva.kg-1.den-1; fluoxetin v dávce 2,0 mg.kg-1.den-1. Léky byly rozpuštěny v deionizované vodě. Dávky byly vypočteny konverzí plochy povrchu těla; objem žaludeční sondy byl 10 ml/kg, podávaný 30 minut před každým denním omezovacím sezením. Normální a modelové skupiny dostaly stejné objemy deionizované vody.

 

Výsledná opatření a postupy

 

3.1 Makroskopická pozorování

Denní pozorování zaznamenávalo duševní stav, pohyb a celkový vzhled.

 

3.2 Test preference sacharózy

Krysy byly trénovány po dobu 3 dnů. Den 1: dvě lahvičky 1% sacharózy na klec. 2. den: jedna láhev nahrazena dvakrát destilovanou vodou stejného objemu. Po 24 hodinách nedostatku potravy a vody dostal každý potkan jednu láhev 1% sacharózy a jednu dvakrát destilovanou vodu po dobu 1 hodiny. Lahve byly zváženy, aby se vypočítala preference sacharózy (%): příjem sacharózy / (sacharóza + příjem vody) × 100 %.

 

3.3 Test v otevřeném poli

V tiché místnosti bylo použito otevřené pole s černými stěnami (125 cm × 125 cm × 50 cm). Krysy byly umístěny do středu; během 5 minut byly zaznamenávány počty vertikálních odchovů, horizontální křížení mřížky a česání. Aréna byla mezi pokusy vyčištěna 75% ethanolem a vodou.

 

3.4 Test nuceného plavání

Krysy byly jednotlivě umístěny do skleněných válců s 35 cm vody při 20 ± 2 stupních. Od ponoření bylo chování zaznamenáváno po dobu 5 minut kamerou s vysokým rozlišením. Byla měřena kumulativní doba nehybnosti po dobu 5 minut (nehybnost definovaná jako minimální pohyb pro udržení nosu nad vodou, mírná flexe těla pro rovnováhu). Voda se měnila mezi zvířaty.

3.5 Histopatologie

Krysy byly anestetizovány 3% pentobarbitalem sodným (0,15 ml/100 g). Šest krys na skupinu podstoupilo transkardiální perfuzi 4% paraformaldehydem následovanou 0,9% fyziologickým roztokem pro fixaci, dekapitaci a extrakci mozku. Mozky byly ponořeny do 4% paraformaldehydu (4 stupně) na 72 hodin, zality do parafinu, oříznuty a nařezány na ~5 μm. Řezy byly plaveny při 48 stupních, upevněny, vypalovány při 60 stupních po dobu 4 hodin, zbaveny parafinu a rehydratovány, obarveny hematoxylinem, diferencovány, opláchnuty, kontrastně obarveny eosinem, dehydratovány, vyčištěny a zakryty krycím sklíčkem pro mikroskopické vyšetření. Zbývajících šest krys na skupinu bylo usmrceno; mozková kůra byla rychle vypreparována na ledu a uložena při teplotě -80 stupňů pro extrakci RNA.

 

3.6 Kvantifikace mRNA

Cílové sekvence byly získány z NCBI a primery navrženy s primerem 6.0.

cAMP: Forward 5'-CCGTGCTGTGGATGACTTCAACC-3'; Reverzní 5'-AGTCTCCTTCACTCGGAACCTCA-3'; 133 bp.

CREB1: Forward 5'-GGAGCAGACAACCAGCAGAGTG-3'; Reverzní 5'-GGATACCTGGGCTAATGTGGCA-3'; 105 bp.

GAPDH: Forward 5'-AAGGGCTCATGACCACAGTC-3'; Reverzní 5'-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3'; 116 bp.

Podmínky qPCR: předdenaturace 90 stupňů po dobu 30 s; 45 cyklů 95 stupňů 10 s, 60 stupňů 30 s, 72 stupňů 30 s. Analýza křivky taveniny: 95 stupňů 1 min, 55 stupňů 1 min, 95 stupňů 1 min.

 

3.7 Sérové ​​zánětlivé faktory

Pro ELISA: (i) nastavte standardy a vzorky; přidejte 50 μl standardů v odstupňovaných koncentracích do standardních jamek; ii) přidejte 40 μl ředidla pro vzorky do jamek pro slepý pokus a jamky, poté 10 μl vzorku a promíchejte; iii) přidat 100 μl enzymového konjugátu ke všem kromě slepých pokusů; (iv) uzavřete a inkubujte při 37 stupních po dobu 1 hodiny; (v) zředit koncentrovaný promývací pufr 1:20; (vi) 5krát omyjte a osušte; (vii) přidejte 50 μl substrátu A a poté 50 μl substrátu B, inkubujte při 37 stupních chráněné před světlem po dobu 15 minut; (viii) přidat stop roztok; (ix) odečtěte absorbanci při 450 nm se slepými pokusy nastavenými na nulu.

 

Statistická analýza

Data byla analyzována v SPSS 26.0 a vyjádřena jako průměr ± SD. Po potvrzení normality a homogenity rozptylu byla použita jednocestná ANOVA. P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné.

Poznámka čtenáře pro praktiky a lidi hledající pomoc

Pro vývojáře botanických/TCM antidepresiv: Studie spojuje klasický vzorec se specifickou neurobiologickou cestou (cAMP–CREB) a zánětlivými mediátory (PGE2, SP). Taková duální modulace-signalizace neuroplasticity a zánětu jsou v souladu se současnou biologií deprese a mohou vést k optimalizaci vzorce, výběru biomarkerů a kombinačním strategiím s SSRI, jako je fluoxetin.

Pro jednotlivce, kteří hledají pomoc při depresi: Předklinické výsledky nemohou nahradit lékařskou péči, ale naznačují, že Xiaoyaosan může zlepšit depresivní chování normalizací mozkové signalizace a snížením zánětlivých signálů. Pokud zvažujete bylinné možnosti, poraďte se s kvalifikovaným lékařem, zvláště pokud užíváte antidepresiva, abyste se vyhnuli interakcím a zajistili dávkování a kontrolu kvality.

 

Přechodné jídlo s sebou

Xiaoyaosan zlepšil chování, histologii mozku a molekulární markery u CIS-indukovaných depresivních potkanů, pravděpodobně prostřednictvím upregulace kortikální cAMP/CREB signalizace při současném snížení periferních PGE2 a SP. Na základě toho bude příští studie rozebírat upstream regulátory cAMP (např. izoformy adenylylcyklázy a fosfodiesterázy) a určí, zda Xiaoyaosan přímo moduluje tyto cíle nebo působí primárně prostřednictvím protizánětlivých cest konvergujících na CREB.