Zacílení na pokročilou rakovinu prostaty pomocí STEAP1 chimérického antigenního receptoru T buněk a nádorově lokalizované IL-12 imunoterapie
Sep 18, 2023
Šestitransmembránový epiteliální antigen prostaty 1 (STEAP1) je buněčný povrchový antigen pro terapeutické cílení u rakoviny prostaty. Zde uvádíme širokou expresi STEAP1 ve vztahu k prostatickému specifickému membránovému antigenu (PSMA) u letálních metastatických karcinomů prostaty a vývoj STEAP 1- řízené terapie T-buňkami chimérického antigenního receptoru (CAR). STEAP1 CAR T buňky vykazují reaktivitu při nízké hustotě antigenu, protinádorovou aktivitu napříč modely metastatického karcinomu prostaty a bezpečnost na lidském STEAP1 knock-in myším modelu. Únik antigenu STEAP1 je rekurentní mechanismus rezistence na léčbu a je spojen se sníženým zpracováním a prezentací nádorového antigenu. Aplikace terapie interleukinem lokalizovaným v nádoru-12 (IL-12) ve formě fúzního proteinu vázající kolagen (CBD)-IL-12 v kombinaci s terapií T lymfocyty STEAP1 CAR zlepšuje protinádorovou účinnost remodelací imunologicky chladného nádorového mikroprostředí rakoviny prostaty a bojem proti úniku STEAP1 antigenu prostřednictvím zapojení hostitelské imunity a šíření epitopu.
Čínská bylina cistanche rostlina-Protinádorová
Metastatic prostate cancer represents an incurable disease responsible for over 33,000 deaths per year in the United States1. Prostate cancer is critically reliant on androgen receptor (AR) signaling and thus the suppression of gonadal androgen production through surgical or chemical castration (androgen deprivation therapy) has been a mainstay of treatment for advanced disease. However, metastatic prostate cancer inevitably develops resistance to androgen deprivation therapy and enters a stage called metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). mCRPC is currently incurable and is considered the end stage of the disease and is associated with a median overall survival of three years2. In the past decade, multiple therapies including an inhibitor of extragonadal androgen synthesis (abiraterone acetate)3, second-generation AR antagonists (enzalutamide)4, radioactive isotope (radium-223)5, and a prostate-specific membrane antigen (PSMA)-specific radioligand therapy (lutetium Lu 177 via votide tetraxetan)6 have been approved for mCRPC. Each of these agents extends survival on average by several months but long-term remissions are rare. Strategies to reprogram the immune system to combat prostate cancer first gained traction with the clinical approval of the dendritic cell vaccine sipuleucel-T for asymptomatic mCRPC7. More recently, several types of immunotherapies including immune checkpoint inhibitors, a DNA cancer vaccine, antibody-drug conjugates (ADC), T cell engaging bispecific antibodies (T-BsAb), and chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have been under active clinical investigation8,9. CARs are synthetic receptors that leverage the potency, expansion, and memory of T cells and can be engineered against virtually any tumor-associated cell surface antigen. The adoptive transfer of CAR T cells has rapidly become an established treatment for hematologic malignancies with exceptional response rates leading to six clinical approvals in the last five years10. In contrast, CAR T cell therapies targeting solid tumors have lagged due to additional challenges related to the lack of bona fide tumor-specific antigens, inhospitable tumor microenvironments, and poor trafficking, persistence, and expansion of CAR T cells11. Despite the challenges observed in driving effective immune responses toward solid tumors, recent early-phase clinical trials investigating CAR T cell therapies targeting PSMA in mCRPC have reported safety and evidence of significant biochemical and radiographic responses12,13. These preliminary results serve to embolden efforts to develop and optimize new CAR T cell therapies for prostate cancer. While PSMA is the preeminent target for therapeutic and diagnostic development in prostate cancer, recent work indicates that PSMA expression may be quite heterogeneous in mCRPC14. Tumor antigen heterogeneity, especially in the context of single antigen-targeted CAR T cell therapies for solid tumors like prostate cancer, is an important barrier to therapeutic efficacy15. Thus, identifying cell surface antigens with broad and relatively homogeneous expression in prostate cancer is imperative. In addition, very few if any tumor-associated antigens demonstrate tumor-restricted expression—most also exhibit low-level expression in normal tissues that could represent liabilities for CAR T cell therapies due to on-target off-tumor toxicities which can lead to devastating consequences including death16. We previously performed integrated transcriptomic and cell surface proteomic profiling of human prostate adenocarcinoma cell lines and identified six transmembrane epithelial antigens of the prostate 1 (STEAP1) as one of the most highly enriched cell surface antigens17. STEAP1 was first described over two decades ago18 and was recognized as being highly expressed in prostate cancer. STEAP1 is strongly expressed in >80 % mCRPC s postižením kostí nebo lymfatických uzlin19, 62 % Ewingův sarkom20 a mnoho dalších typů rakoviny21. STEAP1 patří do rodiny STEAP reduktáz Metallo, které mohou tvořit homotrimery nebo heterotrimery s jinými proteiny STEAP22. STEAP1 má zavedenou funkční roli při podpoře proliferace rakovinných buněk, invaze a přechodu z epitelu na mezenchym –26.
Výhody cistanche tubulosa-Antitumor
Kromě toho STEAP1 vykazuje omezenou expresi v normální tkáni27, což z něj činí vysoce přesvědčivý cíl pro terapii rakoviny. Bylo vyvinuto mnoho imunoterapeutických činidel pro cílení na STEAP1, ale žádné není klinicky schváleno. Bylo zjištěno, že ADC vandor tuzumab ved otin (DSTP3086S) sestávající z humanizované protilátky anti-STEAP1 IgG1 spojené s monomethyl auristatinem E má přijatelný bezpečnostní profil ve fázi I klinické studie u mCRPC, ale bylo pozorováno jen málo objektivních nádorových odpovědí28. T-BsAb obsahující dvě anti-STEAP1 fragment-antigen vázající domény (Fab), anti-CD3 jednořetězcový variabilní fragment (scFv) a fragment krystalizovatelnou (Fc) doménu zkonstruovanou tak, aby postrádala efektorovou funkci nazývanou AMG 509, je v současné době hodnocena. v klinické studii fáze I (NCT04221542) v mCRPC29. Nedávno bylo také hlášeno, že asymetrická duální bivalentní T-BsAb nazývaná BC261 vykazuje silnou protinádorovou aktivitu napříč mnoha preklinickými modely rakoviny prostaty a Ewingova sarkomu30. Kromě toho bylo prokázáno, že lidský leukocytární antigen (HLA) omezený receptor T buněk třídy I (TCR) specifický pro peptid STEAP1 inhibuje lokální a metastatický růst Ewingova sarkomu v preklinickém modelu xenoimplantátu po adoptivním přenosu transgenních T buněk31. V této studii provádíme srovnávací analýzu relativní exprese STEAP1 a PSMA ve letálním mCRPC, abychom prozkoumali užitečnost cílení STEAP1 v současné éře teranostiky PSMA. Navrhujeme a provádíme screening druhé generace STEAP1 CAR na aktivaci T-buněk specifickou pro antigen a cytolýzu cílových buněk, abychom získali hlavního kandidáta pro další charakterizaci. Určujeme funkční epitopovou specificitu STEAP1 CAR T buněk a profilujeme expanzi a imunofenotyp produktů STEAP1 CAR T buněk od více dárců. Poté jsme stanovili účinnost a předběžnou bezpečnost terapie T lymfocyty STEAP1 CAR v relevantních preklinických modelech rakoviny prostaty, ale pozorovali jsme opakující se ztrátu exprese antigenu STEAP1 jako mechanismus rezistence na léčbu. Abychom tento problém překonali, hodnotíme současné podávání CBD-IL-12, které remodeluje imunosupresivní nádorové mikroprostředí rakoviny prostaty a aktivuje endogenní imunitu k rozšíření protinádorových reakcí. Souhrnně tyto studie poskytují silné odůvodnění pro klinickou translaci STEAP1 CAR T buněčné terapie na muže s mCRPC a vedou strategie k překonání potenciálních mechanismů terapeutické rezistence.
Výhody cistanche tubulosa-Antitumor
Výsledek
STEAP1 je široce exprimován v tkáních mCRPC odolných vůči léčbě
We first set out to determine the pattern and extent of STEAP1 expression relative to PSMA in advanced metastatic prostate cancer. We performed immunohistochemical (IHC) staining on a duplicate set of tissue microarrays consisting of 121 metastatic tumors (each with up to three cores represented) collected from 44 men with lethal mCRPC patients collected by rapid autopsy between the years 2010 and 2017 through the University of Washington Tumor Acquisition Necropsy Program32 (Fig. 1a). Plasma membrane staining for STEAP1 and PSMA in each tissue was scored by a research pathologist and semiquantitative H-scores were determined based on the staining intensity (Supple mentary Fig. 1a) multiplied by the percentage of cancer cells staining at each intensity (Supplementary Fig. 1b). By implementing a minimal staining threshold with an H-score cut-off of 30, we found that 87.7% of evaluable matched mCRPC tissues (100 of 114) demonstrated staining for STEAP1 compared to only 60.5% (69 of 114) for PSMA (Fig. 1b). In addition, 28.1% of mCRPC tissues (32 of 114) showed STEAP1 but not PSMA staining (Fig. 1b, c) whereas only 0.9% (one of 114) exhibited PSMA but not STEAP1 staining. Based on these results, we used a linear mixed statistical model to determine that the odds of non-zero (H-score >{{0}}) barvení bylo 22-násobně (95% CI 6-173) vyšší pro STEAP1 než pro PSMA a pravděpodobnost H-skóre větší nebo rovna 3{{ 27}} jsou 84-násobně (95% CI 30-317) vyšší pro STEAP1 než pro PSMA. Průměrné STEAP1 H-skóre v kosti (193; 95% CI 171 až 215) bylo významně vyšší než u metastáz v lymfatických uzlinách (rozdíl −48; 95% CI −21 až −76; p < 0,001) a významně vyšší než u viscerálních metastáz (rozdíl −59; 95% CI −42 až −77; p < 0,001). Nebyl žádný významný rozdíl mezi průměrným STEAP1 H-skóre v metastázách lymfatických uzlin ve srovnání s viscerálními metastázami (rozdíl 11; 95% CI −16 až 39; p=0,4) (doplňkový obrázek 1c). Pozorovali jsme také několik případů s heterogenní expresí PSMA v jádrech (obr. 1d), což je v souladu s nedávnou zprávou o intratumorální heterogenitě PSMA v biopsiích mCRPC14. Analýza na úrovni pacienta s použitím průměrné prahové hodnoty H-skóre větší nebo rovné 30 a McNemarův test odhalily, že 95 % hodnotitelných pacientů (42 ze 44) mělo nádory s expresí STEAP1, zatímco 68 % (30 ze 44) bylo pozitivních na PSMA (Doplňkový obr. 1d). Ke studiu vzorců heterogenity mezi pacienty a mezi pacienty spojené s expresí STEAP1 a PSMA jsme použili H-skóre STEAP1 a PSMA k vyhodnocení hypergeometrických, Simpsonových a Shannonových skóre diverzity. Pozorovali jsme dva vzorce exprese STEAP1 (obr. 1e), přičemž 68 % (30/44) pacientů vykazovalo expresi STEAP1 napříč všemi metastatickými místy (vysoká STEAP1) a 32 % (14/44) pacientů vykazovalo metastatická místa s expresí STEAP1 a bez ní. (heterogenní STEAP1). Nebyli identifikováni žádní pacienti, u kterých všechny metastatické tkáně postrádaly expresi STEAP1. Podobná analýza exprese PSMA ve stejné kohortě odhalila 45 % (20/44) pacientů s vysokou expresí PSMA, 32 % (14/44) s heterogenní expresí PSMA a 23 % (10/44) bez exprese PSMA. Na základě molekulární subklasifikace tkání mCRPC pomocí AR a exprese neuroendokrinního markeru synaptofyzinu (SYP) hodnocené pomocí IHC měla většina pacientů s vysokou nebo heterogenní expresí STEAP1 a PSMA AR-pozitivní karcinom prostaty (AR+/SYP- nebo AR+/SYP+), zatímco tito pacienti bez exprese PSMA měli AR-nulovou rakovinu prostaty (AR-/SYP+ nebo AR-/SYP-). Identifikovali jsme pozitivní korelaci mezi expresí STEAP1 a AR (p < 0,001) pomocí přizpůsobeného lineárního smíšeného modelu s náhodným účinkem v případech reprezentovaných na tkáňovém mikročipu (doplňkový obr. 2a, b), což bylo očekáváno vzhledem k tomu, že STEAP1 je androgen -regulovaný gen33,34. Naproti tomu byl oceněn negativní trend mezi expresí STEAP1 a SYP (doplňkový obr. 2c). Tato zjištění naznačují, že stejně jako PSMA35 může být exprese STEAP1 ztracena s neuroendokrinní transdiferenciací rakoviny prostaty.
Fig. 1 | Comparative analysis of STEAP1 and PSMA in lethal, metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). a Characteristics of the mCRPC tissues represented on University of Washington Tissue Acquisition Necropsy Tissue Microarray 92 (UW TAN TMA92). b Contingency table showing the frequency of mCRPC tissues with STEAP1 or PSMA IHC staining above or below an H-score threshold of 30. Micrographs of select mCRPC tissues after STEAP1 and PSMA IHC staining to highlight the (c) absence of PSMA but the presence of STEAP1 expression and (d) intratumoral heterogeneity of PSMA expression but not STEAP1. Scale bars = 50 µm. For panels (c, d) n = 332 mCRPC cores were immunostained for STEAP1 and PSMA. e Dot and box plot showing the distribution of STEAP1 (top) and PSMA (bottom) H-scores in 44 patients from the UW TAN TMA92 cohort. Each dot represents a tumor specimen/core (n = 319 cores for PSMA and 333 cores for STEAP1) and the color indicates the molecular subtype: AR+/SYP+ (red), AR+/SYP− (green), AR−/SYP+ (yellow) and AR−/SYP− (purple). Gray rectangles show interquartile ranges spanning the 25th to the 75th percentiles of PSMA H-scores from each patient. Bar plots (on the right) summarize the frequencies of patients classified based on STEAP1 and PSMA expression as no expression (all cores with H-score ≤30, light grey), heterogeneous expression (at least one core with H-score ≤30 and H-score >30, mid grey) and high expression (all cores with H-scores >30, tmavě šedá). Zdrojová data jsou uvedena v souboru zdrojových dat.
Develvytvoření silného, antigen-specifického STEAP1 CAR
Vzhledem k rozšířené expresi STEAP1 v pozdním stádiu mCRPC a jeho uváděné funkční roli v progresi rakoviny27,36,37 jsme dále začali konstruovat lentivirovou STEAP1-specifickou CAR druhé generace. Použili jsme lentivirovou páteř pCCL-c-MNDU3-X38, která byla široce používána pro genovou terapii hematopoetických kmenových buněk39 a exprese CAR v T buňkách řízená vnitřním promotorem MNDU3 se ukázala být vyšší než exprese dosažená pomocí Promotor EFS40. 4-1BB kostimulační doména byla upřednostňována díky svému spojení s tvorbou paměti T buněk a prodlouženou perzistencí41 a byla zavedena transmembránová doména CD28, protože bylo prokázáno, že snižuje práh antigenu pro druhou generaci 4-1BB Aktivace CAR T buněk42. Začlenili jsme plně humanizovaný scFv odvozený z vandor tuzumab vedotinu, ADC cíleného na STEAP1, jehož vývoj byl přerušen po klinické studii fáze I28. Tento scFv je humanizovaná varianta myší monoklonální protilátky (mAb 120.545) původně vyvinutá společností Agensys, Inc., která vykazuje afinitu 1 nM ve vazebných testech na bázi buněk43. Abychom potenciálně vyladili aktivitu CAR, implementovali jsme tři různé délky závěsu/distanční vložky, včetně krátkého (závěs IgG4), středního závěsu (závěs IgG4-CH3) a dlouhého (závěs IgG4-CH2- CH3). Dlouhý spacer byl zkonstruován s dříve popsanými mutacemi 4/2- NQ44 v doméně CH2, aby se zabránilo vazbě Fc-gama receptoru a aktivací indukované buněčné smrti, ke které dochází při adoptivním přenosu dlouhých spacer CAR T buněk do imunodeficientních myší. Tři kandidátní CAR byly klonovány do lentivirového vektoru (obr. 2a), který také koexprimuje zkrácený receptor epidermálního růstového faktoru (EGFRt) jako transdukční marker. Lentiviry byly vytvořeny a použity k transdukci lidských CD4 a CD8 T buněk obohacených z lidských dárcovských mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) odebraných z ferézy. Expandované CD4 a CD8 CAR T buňky byly imunofenotypizovány (doplňkový obr. 3a) a rekonstituovány do buněčných produktů definovaného složení s normálním poměrem CD4/CD8 pro hodnocení jejich funkčních aktivit. Pro kontrolu exprese STEAP1 izogenním způsobem jsme se zaměřili na buněčnou linii lidské rakoviny prostaty 22Rv1, která demonstruje nativní expresi STEAP1, a provedli jsme knockout STEAP1 (ko) úpravou genomu CRISPR/Cas9. Poté jsme vytvořili záchrannou linii STEAP1 z 22Rv1 STEAP1 ko transdukcí lentivirem exprimujícím STEAP1 (obr. 2b). Tyto linie byly poté použity pro screening tří krátkých, středních a dlouhých spacer STEAP1 CAR T buněk v testech společné kultury s odečtem uvolňování interferonu-gama (IFN-) jako indikátorem aktivace T buněk. Pouze dlouhé spacer STEAP1 CAR T buňky (dále nazývané STEAP1-BBζ CAR T buňky) prokázaly předpokládaný antigen-specifický vzor uvolňování IFN-, zatímco krátké a střední spacer STEAP1 CAR T buňky nikoliv (obr. 2c , Doplňkový obr. 3b, c). Dále, STEAP1-BBζ CAR T buňky vykazovaly podstatnou na dávce závislou cytolýzu 22Rv1 buněk ve srovnání s netransdukovanými T buňkami (obr. 2d) a prokázaly relativní ušetření 22Rv1 STEAP1 ko buněk (obr. 2e). Podobné studie byly poté provedeny na buněčné linii DU145 lidské rakoviny prostaty, která postrádá nativní expresi STEAP1, ale byla upravena tak, aby exprimovala STEAP1 (DU145 STEAP1) lentivirovou transdukcí (doplňkový obrázek 4a). V tomto nastavení byla aktivace STEAP1-BBζ CAR T buněk pozorována pouze ve společných kulturách s buňkami DU145 STEAP1 a nikoli s rodičovskými buňkami DU145 (doplňkový obrázek 4b). Cytolytická aktivita byla oceněna pouze u STEAP1-BBζ CAR T buněk a nikoli u netransdukovaných T buněk v kokulturách s buňkami DU145 STEAP1 (doplňkový obrázek 4c). Následně jsme analyzovali větší panel buněčných linií lidského karcinomu prostaty, abychom charakterizovali jejich nativní expresi STEAP1 pomocí imunoblotové analýzy. Buněčné linie se známou expresí/aktivitou AR (LNCaP, 22Rv1, VCaP a LNCaP95) vykazovaly různé úrovně exprese STEAP1, zatímco buněčné linie AR-null (PC3, DU145, MSKCC EF1 a NCI-H660) zřejmě neexprimovaly detekovatelné hladiny STEAP1 (obr. 2f). Pokračovali jsme v provádění společných kultur STEAP1-BBζ CAR T s těmito liniemi, abychom dále potvrdili jejich antigenně specifickou aktivaci na základě uvolňování IFN (obr. 2g). Pozorovali jsme však nesouhlasné zjištění v tom, že linie PC3, která nevykazovala žádnou zjevnou expresi proteinu STEAP1 (obr. 2f), indukovala podstatnou aktivaci STEAP1-BBζ CAR T buněk. Předchozí literatura naznačovala, že STEAP1 je exprimován v buněčné linii PC3 v nízkých hladinách45. Prodloužená expozice imunoblotu skutečně odhalila pás naznačující přítomnost velmi nízké exprese STEAP1 (obr. 2h). Abychom potvrdili, zda aktivace STEAP1-BBζ CAR T buněk byla způsobena touto minoritní expresí STEAP1 v buňkách PC3, vytvořili jsme tři PC3 STEAP1 ko sublinie (obr. 2h) a znovu provedli společné kultivace se STEAP{133} }BBζ CAR T buňky. STEAP1 ko v linii PC3 vedl ke zrušení aktivace STEAP1-BBζ CAR T buněk (obr. 2i), což dále potvrdilo specificitu a poskytlo důkaz o citlivosti STEAP1-BBζ CAR T buněk na nízkou podmínky hustoty antigenu.
Nedostatek zkřížené reaktivity STEAP1-BBζ CAR s myším Steap1 a lidským STEAP1B
cistanche doplněk výhody-zvyšuje imunitu
V souladu s anti-lidskou specifitou vandor tuzumab vedotinu, STEAP1-BBζ CAR T buňky nevykazovaly zkříženou reaktivitu s myším Steap1 (doplňkový obrázek 4a, d, e). Využili jsme to však jako příležitost k individuální rekonstituci tří lidských extracelulárních domén STEAP1 (ECD) na myším Steap1 (doplňkový obrázek 4f), abychom určili, které ECD jsou kritické pro rozpoznávání epitopu buňkami STEAP1-BBζ CAR T. Experimenty s kokultivací byly provedeny s buňkami STEAP1-BBζ CAR T a buňkami DU145 upravenými tak, aby exprimovaly myší Steap1 s individuálním nahrazením myších ECD lidskými ECD. Zjistili jsme, že lidský STEAP1 ECD2, ale ne ECD1 nebo ECD3, byl spojen s aktivací STEAP1-BBζ CAR T buněk (doplňkový obrázek 4g). Je zajímavé, že lidský STEAP1 a myší Steap1 ECD2 prokázaly 93,9% (31/33 aminokyselin) homologii (doplňkový obrázek 4h), což naznačuje, že Q198 a/nebo I209 lidského STEAP1 jsou kritické pro produktivní rozpoznávání pomocí STEAP1-BBζ CAR T buňky. Ukázalo se, že Q198 interaguje s Fab 120.545 jako součást interakčního aktivního bodu založeného na nedávné struktuře vyřešené kryogenní elektronovou mikroskopií22. Z lidské rodiny proteinů STEAP má STEAP1B největší homologii se STEAP145. Byly identifikovány tři transkripty STEAP1B, z nichž všechny demonstrují kompletní konzervaci aminokyselinové sekvence lidského STEAP1 ECD2 (doplňkový obrázek 5a). Algoritmus predikce konsensuální membránové topologie TOPCONS46 předpověděl sekvence domény ECD2 jako extracelulární ve třech izoformách proteinu STEAP1B (doplňkový obrázek 5b), i když s nízkým skóre spolehlivosti pro STEAP1B ve srovnání s hSTEAP1 kvůli nedostatku konsenzu mezi pěti modely predikce topologie (OCTOPUS, Philius, PolyPhobius, SCAMPI a SPOCTOPUS) používané společností TOPCONS (doplňkový obr. 5c). Předchozí analýza pomocí jiného nástroje pro predikci topologie TMHMM47 založeného na in silico skrytém Markovově modelu také naznačila, že tato sekvence by mohla být intracelulární spíše než extracelulární v izoformách proteinu STEAP1B 1 a 245. Nicméně krystalová struktura STEAP1B dosud nebyla stanovena, aby to přímo potvrdila. tyto předpovědi. Abychom funkčně vyhodnotili, zda STEAP1- BBζ CAR T buňky mohou být také reaktivní proti STEAP1B, provedli jsme společné kultivace s použitím linií DU145 navržených tak, aby exprimovaly každou ze tří izoforem STEAP1B. Neidentifikovali jsme důkaz aktivace STEAP1-BBζ CAR T buněk (doplňkový obrázek 5d), což naznačuje, že epitop STEAP1 rozpoznávaný STEAP1-BBζ CAR T buňkami nemusí být prezentován jako součást ektodomény STEAP1B navzdory zjevné sekvenční homologii.
Obr. 2|Screening druhé generace 4-1BB chimérických antigenních receptorů (CAR) za účelem identifikace vedoucího pro terapii T lymfocyty STEAP1 CAR. Schéma lentivirového konstruktu STEAP1 CAR a variace na základě krátkých, středních a dlouhých spacerů. LTR dlouhá terminální repetice, oblast U3 viru myší leukémie MNDU3 Moloney, jednořetězcový variabilní fragment scFv, variabilní lehký řetězec VL, variabilní těžký řetězec VH, tm transmembrána, zkrácený receptor epidermálního růstového faktoru EGFRt, 4/2 NQ {{1{28 }}}} mutace domény CH2, aby se zabránilo vazbě na Fc-gama receptory. b Imunobloty STEAP1 v 22Rv1 rodičovských buňkách, STEAP1 knockout (ko) buňkách a STEAP1 ko buňkách se záchranou STEAP1. c IFN-enzymový imunosorbentní test (ELISA) je výsledkem společných kultur buď netransdukovaných T buněk nebo STEAP1-BBζ CAR T buněk s každou z 22Rv1 sublinie v poměru 1:1 za 24 hodin (p < 0.001). Relativní buněčná životaschopnost (d) 22Rv1 a (e) 22Rv1 STEAP1 ko cílových buněk v průběhu času měřená fluorescenčním zobrazením živých buněk při společné kultivaci s (vlevo) STEAP1-BBζ CAR T buňkami (p < 0,001) nebo ( vpravo) netransdukované T buňky při variabilních poměrech efektorových k cílovým (E:T) buňkám. f Imunobloty demonstrující expresi STEAP1 v buněčných liniích lidského karcinomu prostaty pozitivních na androgenní receptor (AR), ale ne AR-negativních buněčných liniích karcinomu prostaty. g IFN- kvantifikace pomocí ELISA ze společných kultur buď netransdukovaných T buněk nebo STEAP1- BBζ CAR T buněk s každou z buněčných linií lidského karcinomu prostaty v (f) v poměru 1:1 za 24 hodin. h Imunobloty pro STEAP1 v 22Rv1, PC3 a PC3 STEAP1 ko podliniích. I IFN- kvantifikace pomocí ELISA ze společných kultur buď netransdukovaných T buněk nebo STEAP1- BBζ CAR T buněk s každou buněčnou linií v (h) v poměru 1:1 za 24 h (p < 0,001). Pro panely (c–e, g a i) bylo použito n=4 biologických replikátů na stav a chybové úsečky představují průměr se SEM. Panel (b, f, h) zobrazuje výsledky reprezentativní pro n=3 biologických replikátů. GAPDH byl použit jako kontrola nanášení proteinu. Pro panely (c) a (i) byla použita dvoucestná ANOVA se Sidakovým mnohonásobným srovnávacím testem. Pro panely (d) a (e) byla použita dvoucestná ANOVA s Tukeyovým testem vícenásobného srovnání. Zdrojová data jsou uvedena v souboru zdrojových dat.
Charakterizace produktů STEAP1-BBζ CAR T buněk napříč řadou dárců
Dále jsme profilovali expanzi, účinnost transdukce a imunofenotyp produktů STEAP1-BBζ CAR T buněk pomocí tří nezávislých sad mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) odebraných od zdravých dárců. Obecně jsme pozorovali 20- až 40-násobnou expanzi STEAP1-BBζ CAR T buněk během 11 dnů kultivace (doplňkový obrázek 6a). Procento EGFRt+ CD8 T buněk se pohybovalo od 24,3 do 54,2 %, zatímco procento EGFRt+ CD4 T buněk bylo vyšší a pohybovalo se od 60,1 do 74,9 % v našich produktech STEAP1-BBζ CAR T buněk (doplňkový obrázek 6b). Zkoumali jsme expresi markerů vyčerpání T buněk PD-1 a LAG-3 v podskupinách netransdukovaných a STEAP1- BBζ CAR T buněk a nepozorovali jsme žádné významné zvýšení exprese (doplňkový obrázek 6c ). Toto zjištění naznačovalo nízkou nebo chybějící tonickou signalizaci pomocí STEAP1-BBζ CAR, což bylo povzbuzující, protože konstitutivní CAR signalizace může negativně ovlivnit funkci efektoru CAR T buněk48. Fenotypy T lymfocytů s pamětí kmenových buněk (Tscm) a T lymfocytů centrální paměti (TCM) byly spojeny s terapeutickou účinností terapie CAR T lymfocyty, protože podporují trvalou proliferaci a perzistenci in vivo49–51. Imunofenotypizace podskupin netransdukovaných a STEAP1-BBζ CAR T buněk prokázala vyšší frekvence buněk Tscm ve srovnání s podskupinami T buněk v dárcovských PBMC, ze kterých byly buněčné produkty odvozeny (doplňkový obrázek 6d). Tento účinek je pravděpodobně způsoben přidáním IL-7 a/nebo IL-15 do expanzního média T buněk, protože bylo prokázáno, že tyto cytokiny zachovávají a zvyšují diferenciaci Tscm51,52. Naše analýza také odhalila obohacení v populacích Tcm, zejména v CD8 STEAP1-BBζ CAR T buňkách (doplňkový obrázek 6e).
STEAP1-BBζ CAR T buňky vykazují podstatné protinádorové účinky v modelech diseminovaného karcinomu prostaty s nativní expresí STEAP1 zjištěnou u imunodeficientních myší
cistanche tubulosa - zlepšení imunitního systému
Jako počáteční screening in vivo protinádorové aktivity jsme vytvořili 22Rv1 subkutánní xenoimplantátové nádory u samců NOD scid gama (NSG) myší. Když nádory narostly na přibližně 10}0 mm3, byly myši ošetřeny jednou intratumorální injekcí buď 5 x 106 netransdukovaných T buněk nebo STEAP1-BBζ CAR T buněk. Intratumorální léčba pomocí STEAP1- BBζ CAR T buněk byla spojena s významnou inhibicí růstu nádoru, která byla statisticky významná do 18. dne léčby (obr. 3a). Myši byly usmrceny 25. den a zbytkové nádory z myší léčených STEAP1-BBζ CAR T buňkami vykazovaly velké oblasti nekrotických úlomků a oblasti životaschopného nádoru byly infiltrovány CD3+ STEAP1-BBζ CAR T buňky (doplňkový obrázek 7a). Exprese STEAP1 byla zachována v nádorech napříč léčebnými skupinami (doplňkový obrázek 7b). Transdukovali jsme buňky 22Rv1 lentivirem, abychom podpořili expresi luciferázy světlušek (Luc) a buňky 106 22Rv1-fLuc byly injikovány do ocasních žil samců myší NSG. Metastatická kolonizace byla vizualizována pomocí živého bioluminiscenčního zobrazování (BLI) po dvou týdnech, kdy byly myši ošetřeny jednou intravenózní injekcí buď 5 x 106 netransdukovaných T buněk nebo STEAP1-BBζ CAR T buněk (obr. 3b). . Sériové BLI odhalilo rychlou progresi onemocnění u myší léčených netransdukovanými T buňkami, zatímco ty, které dostávaly STEAP1-BBζ CAR T buňky, vykazovaly významné zpoždění v progresi nádoru (obr. 3c, d) a prodloužení přežití (97 dnů oproti 31 dnům , p=0.0018 log-rank testem, obr. 3e). Mezi léčebnými rameny nebyl žádný významný rozdíl v hmotnostech myší (doplňkový obrázek 7c). IHC barvení nádorů na konci studie ukázalo významné snížení exprese STEAP1 (doplňkový obrázek 7d), což naznačuje, že únik antigenu byl mechanismem rezistence. To však bylo nepravděpodobné v důsledku transdiferenciace na variantní stav rakoviny prostaty, protože jsme neocenili morfologické změny, ztrátu exprese AR a PSMA53 nebo zisk exprese SYP (doplňkový obrázek 7d). Abychom prozkoumali globální dopad ztráty STEAP1 u rakoviny prostaty, provedli jsme transkriptomové profilování izogenních 22Rv1 divokého typu (wt), 22Rv1 STEAP1 ko a 22Rv1 STEAP1 ko + záchranných buněčných linií, které jsme dříve připravili (obr. 2b). Analýza diferenciální genové exprese porovnávající 22Rv1 STEAP1 ko buňky s 22Rv1 wt buňkami identifikovala ~1700 genů významně downregulovaných (FDR menší nebo rovno 0,05, násobná změna<2) with STEAP1 knockout. Rescue of STEAP1 expression in the 22Rv1 STEAP1 ko cells revealed that ~600 genes were significantly upregulated (FDR ≤ 0.05, fold-change>2) přidáním STEAP1 (doplňkový obr. 8a). Analýza obohacování genové sady (GSEA) nominovala několik biologických drah, které mohou být dysregulovány modulací exprese STEAP1. Prominentní mezi nimi byla progrese buněčného cyklu a více metabolických procesů včetně Krebova cyklu a glykolýzy, které byly negativně obohaceny knockoutem STEAP1 a zachráněny po přidání STEAP1 (doplňkový obrázek 8b). Na naše data jsme aplikovali validovaný 31-signaturu progrese genového buněčného cyklu (CCP)54, která ukázala významnou downregulaci signatury CCP spojené s knockoutem STEAP1 se skóre −0,8, které se podstatně zvýšilo na {{ 14}}.5 se záchranou exprese STEAP1 (doplňkový obr. 8c). Tato data jsou v souladu s předchozí publikací, která naznačuje, že knockdown STEAP1 v buněčné linii karcinomu prostaty LNCaP zhoršuje životaschopnost a proliferaci buněk a zároveň indukuje apoptózu37. Také jsme zaznamenali, že zpracování a prezentace antigenu byly jednou z nejvýznamnějších de-obohacených KEGG drah s knockoutem STEAP1 (doplňkový obrázek 8b). Pozorovali jsme významnou downregulaci genů včetně PSME1 (podjednotka aktivátoru proteazomu 1), který je členem imunoproteazomového komplexu, TAP1 (transportér 1, člen podrodiny kazety vázající ATP), který je kritický pro hlavní histokompatibilní komplex (MHC) peptid třídy I. zaváděcí komplex a několik genů MHC třídy I a II, jako je MR1 (hlavní komplex histokompatibility, související s třídou I), HLA-DQ-B1 a HLA-DQB2 (doplňkový obr. 8d). Dále jsme zkoumali nádory shromážděné z 22Rv1 diseminovaných modelů ošetřených STEAP1- BBζ CAR T buněčnou terapií, která prokázala ztrátu antigenu (obr. 3c, doplňkový obr. 7d) analýzou transkriptomu. Diferenciální analýza genové exprese a následné GSEA srovnání 22Rv1 metastatických nádorů z myší léčených STEAP1-BBζ CAR T buněčnou terapií s těmi léčenými netransdukovanými T buňkami prokázaly negativní obohacení drah zapojených do MHC, cytotoxických lymfocytů a aktivace T buněk ( Doplňkový obr. 9a, b). Také jsme specificky hodnotili expresi genů MHC třídy I a II a pozorovali jsme jejich výraznou downregulaci u nádorů 22Rv1 léčených terapií STEAP1-BBζ CAR T lymfocyty (doplňkový obrázek 9c). Tento výsledek byl dále doložen významným snížením barvení HLA-A, B, C pomocí IHC v těchto nádorech (doplňkový obrázek 9d). Potenciálním důsledkem těchto dat je, že léčba STEAP1-BBζ CAR T buněčnou terapií a výsledná ztráta exprese nádorového antigenu STEAP1 u rakoviny prostaty může vést k další rezistenci na imunoterapii prostřednictvím zhoršeného zpracování a prezentace antigenu. Samci myší NSG jsme také naočkovali C4-2B-fLuc buňkami injekcí do ocasní žíly. C4-2B je kastračně rezistentní sublinie LNCaP55 s kinetikou růstu více v souladu s typickým karcinomem prostaty. Čtyři týdny po injekci byla metastatická kolonizace potvrzena pomocí BLI a myši byly ošetřeny jednou intravenózní injekcí buď 5 x 106 netransdukovaných T buněk nebo STEAP1-BBζ CAR T buněk (obr. 3b). Sériové BLI ukázaly kompletní odpověď u všech myší, které dostaly STEAP1-BBζ CAR T buňky během pěti týdnů léčby (obr. 3f, g). Identifikovali jsme trend zvýšeného úbytku hmotnosti ve skupině léčené netransdukovanými T-buňkami (doplňkový obr. 10a), ale to nebylo statisticky významné. Pitva myší ošetřených STEAP1-BBζ CAR T buňkami nevykazovala žádné makroskopické onemocnění a ex vivo BLI orgánů neodhalilo žádný signál (doplňkový obr. 10b), což naznačuje, že tyto myši byly pravděpodobně vyléčeny. Identifikovali jsme periferní persistenci STEAP1-BBζ CAR T buněk na konci experimentu na základě přítomnosti detekovatelných CD3+ EGFRt+ splenocytů (obr. 3h).
Obr. 3|In vivo protinádorová aktivita terapie T lymfocyty STEAP1-BBζ CAR v modelech rakoviny prostaty s nativní expresí STEAP1. a Objemy 22Rv1 subkutánních nádorů u myší NSG (n=4 pro skupinu netransdukovaných T buněk a n=5 pro skupinu STEAP1-BBζ CAR T buněk) v průběhu času po jediné intratumorální injekci 5 × 106 netransdukovaných T buněk nebo STEAP{{10}}BBζ CAR T buněk v normálních poměrech CD4/CD8. p < 0.0001 ve dnech 20 a 25. Sloupce představují průměr se SEM. b Schéma experimentů s provokací nádoru pro 22Rv1 (nahoře) a C4-2B (dole) diseminované modely. Luciferáza světlušky Luc, bioluminiscenční zobrazování BLI. c Sériové živé bioluminiscenční zobrazování (BLI) myší NSG implantovaných 22Rv1-fLuc metastázami a ošetřených jednou intravenózní injekcí 5 × 106 netransdukovaných T buněk nebo STEAP1-BBζ CAR T buněk při normálním CD4/ Poměry CD8 v den 0. Červené X označuje mrtvé myši. Je zobrazena stupnice záření. d Graf ukazující kvantifikaci celkového toku v průběhu času ze živého BLI každé myši v (c). e Kaplan-Meierovy křivky přežití myší v (c) se statistickou významností stanovenou log-rank (Mantel-Cox) testem. Pro panely (c–e) bylo použito n=5 myší na stav. f Sériové živé BLI myší NSG implantovaných C4-2B metastázami a léčených jednou intravenózní injekcí 5 × 106 netransdukovaných T buněk nebo STEAP1-BBζ CAR T buněk v normálních poměrech CD4/CD8 v den 0. Červené X označuje mrtvé myši. Je zobrazena stupnice záření. g Graf ukazující kvantifikaci celkového toku v průběhu času ze živého BLI každé myši v (f). Pro panely (f, g) bylo použito n=4 myší ve skupině netransdukovaných T buněk a n=5 myší ve skupině STEAP1-BBζ CAR T buněk. h Kvantifikace CD3+ EGFRt+ STEAP1-BBζ CAR T buněk průtokovou cytometrií ze splenocytů myší ošetřených STEAP1-BBζ CAR T buňkami (n=4) na konci experimentu v den 49. Sloupce představují průměr. Pro panel (a) byla použita dvoucestná ANOVA se Sidakovým vícenásobným srovnávacím testem. Zdrojová data jsou uvedena v souboru zdrojových dat.
Studie T-buněk STEAP1 CAR myší v myši prokazují protinádorovou terapeutickou účinnost
Aktivace a cytolytická aktivita STEAP1-BBζ CAR T buněk pozorovaná ve velmi nízké hustotě antigenu STEAP1 (~1500 molekul/buňku) v kontextu buněčné linie PC3 (obr. 2g–i, doplňkový obr. 11a, b ) a důkazy o protinádorové aktivitě in vivo v modelu diseminovaného nádoru PC3-fLuc (doplňkový obr. 11c–e) představovaly obavy z potenciálu mimonádorových toxicit na cíl. Abychom vyhodnotili potenciální toxicitu u ovladatelného modelového organismu, vytvořili jsme lidskou STEAP1 knock-in (hSTEAP1-KI) myš, ve které byl lidský gen STEAP1 vražen do myšího lokusu genu Steap1 na pozadí C57Bl/6 ( Obr. 4a). Byla založena myší kolonie s genotypizací provedenou polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) DNA ocasu (obr. 4b). Jak homozygotní, tak heterozygotní hSTEAP1-KI myši nevykazovaly žádné zjevné fenotypové nebo reprodukční abnormality ve srovnání se sourozenci divokého typu. Tkáňový průzkum exprese lidského STEAP1 založený na kvantitativní reverzní transkripční PCR (qRT-PCR) byl proveden na samcích a samicích heterozygotních hSTEAP1-KI (hSTEAP1-KI/+) myší a odhalil největší relativní expresi v prostatě, následuje děloha a nadledvinka (obr. 4c). Další in situ analýza pomocí STEAP1 IHC mužské hSTEAP1-KI/+ prostaty a nadledvin odhalila expresi lidského STEAP1 omezenou na luminální epiteliální buňky prostaty (obr. 4d) a expresi v kůře nadledvin (obr. 4e) . Murinizovaná verze STEAP1 CAR, nazvaná STEAP1-mBBζ CAR, ve které byly zachovány mezerníky scFv a IgG4 pant-CH2-CH3, ale transmembránová doména CD28, 4-1BB kostimulační doména a CD3ζ aktivační doména byla nahrazena jejich myšími orthology byla klonována do gamaretrovirového konstruktu (obr. 4f). Kromě toho byl lidský transdukční marker EGFRt nahrazen zkráceným myším CD19 (mCD19t), aby se minimalizovala potenciální imunogenicita. Potvrdili jsme účinnou retrovirovou transdukci T buněk obohacených z myších splenocytů (obr. 4g) a prokázali schopnost myších STEAP1-mBBζ CAR T buněk indukovat cytolýzu RM9 myší buněčné linie karcinomu prostaty56 upravené tak, aby exprimovaly lidský STEAP1 (RM9- hSTEAP1) lentivirovou transdukcí (obr. 4h). In vivo účinnost myších STEAP1-mBBζ CAR T buněk byla ověřena v modelu diseminovaného nádoru RM9-STEAP1-fLuc u myší NSG (doplňkový obrázek 12a). Jeden týden po injekci buněk RM9-STEAP1-fLuc do ocasní žíly byly myši ošetřeny buď 5 × 106 netransdukovanými myšími T buňkami nebo myšími STEAP1-mBBζ CAR T buňkami pomocí injekce do ocasní žíly . Myši, které dostaly netransdukované myší T buňky, vykazovaly nekontrolovanou progresi onemocnění, zatímco ty, které byly léčeny STEAP1-mBBζ CAR T buňkami, jednotně vykazovaly rychlou regresi onemocnění, po které následoval následný relaps o deset dní později (doplňkový obrázek 12b, c). STEAP1-mBBζ CAR T buněčná terapie byla spojena se statisticky významným přínosem pro přežití (22 dnů versus 12 dnů, p=0,0039 podle log-rank testu, doplňkový obr. 12d). Ztráta hmotnosti byla evidentní v obou léčebných skupinách, protože nádorová zátěž se před smrtí zvýšila (doplňkový obrázek 12e, f). Analýza myších splenocytů odebraných při nekropsii ukázala periferní persistenci STEAP1-mBBζ CAR T buněk s detekcí mCD3+ mCD19t+ buněk až 24 dní po adoptivním přenosu (doplňkový obrázek 12g). Plíce byly odebrány myším v obou léčebných skupinách a STEAP1 IHC vykazoval ztrátu exprese STEAP1 v plicních metastázách od myší léčených STEAP1-mBBζ CAR T buňkami (doplňkový obrázek 12h). Následně jsme rozšířili klonální linie RM9-STEAP1-fLuc, abychom určili, zda by pozorovaný únik nádorového antigenu mohl být výsledkem již existující heterogenity v expresi STEAP1. Experiment byl opakován s klonálním, diseminovaným modelem nádoru RM9-STEAP1-fLuc u myší NSG (doplňkový obrázek 13a). V tomto kontextu myši ošetřené STEAP1-mBBζ CAR T buňkami prokázaly rychlou a trvalou kompletní odpověď (doplňkový obrázek 13b–d). Tato zjištění zdůrazňují sílu STEAP1-mBBζ CAR T buněk při vymýcení STEAP1+ rakoviny prostaty a dále naznačují, že k překonání rezistence u podskupin pacientů s pokročilou rakovinou prostaty, kde je heterogenita STEAP1, mohou být zapotřebí doplňkové terapeutické strategie exprese je přítomna (obr. 1e).
cistanche přínosy pro muže-posílení imunitního systému
Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity
【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Terapie T lymfocyty STEAP1 CAR je v humanizovaném myším modelu STEAP1 bezpečná
Abychom prozkoumali jak preklinickou bezpečnost, tak i účinnost terapie STEAP1-mBBζ CAR T lymfocyty, naočkovali jsme samce heterozygotních myší hSTEAP1-KI syngenní, neklonální RM9-STEAP{{4} }fLuc buňky injekcí do ocasní žíly (obr. 5a). Po potvrzení metastatické kolonizace pomocí BLI asi o týden později myši dostaly předkondicionovaný cyklofosfamid 100 mg/kg intraperitoneální injekcí57. O den později byly myši randomizovány k léčbě buď 5 x 106 netransdukovanými myšími T buňkami nebo myšími STEAP1-mBBζ CAR T buňkami injekcí do ocasní žíly. Všechny myši, které dostaly myší STEAP1-mBBζ CAR T buňky, prokázaly snížení nádorové zátěže během prvního týdne od zahájení léčby na základě BLI (obr. 5b, c). Pozorovaná odpověď byla krátkodobá, ale vedla k mírnému prodloužení přežití (21 dnů oproti 12 dnům, p=0,0138 log-rank testem, obr. 5d) – podobně jako nálezy z neklonálního RM Experimenty 9-STEAP1-fLuc na myších NSG (doplňkový obrázek 12d). Nebyla pozorována žádná velká toxicita nebo předčasná úmrtí specificky spojená s myší STEAP1-mBBζ CAR T buněčnou terapií v této dávkové hladině, kde byl pozorován jasný důkaz protinádorové účinnosti. Ztráta hmotnosti byla spojena se zvýšenou nádorovou zátěží, ale společná pro obě léčebná ramena (obr. 5e, f). K dalšímu posouzení potenciální toxicity terapie STEAP1-mBBζ CAR T lymfocyty byl paralelně proveden podobný experiment na heterozygotních myších hSTEAP1-KI nesoucích nádory RM9-hSTEAP1 a žádné nádory. Myši nenesoucí nádor ošetřené netransdukovanými T buňkami nebo STEAP1- mBBζ CAR T buňkami nevykazovaly žádné rozdíly v přežití (doplňkový obrázek 14a) nebo celkovou toxicitu včetně ztráty tělesné hmotnosti (doplňkový obrázek 14b). Protože STEAP1-BBζ CAR sestává z modifikovaného IgG4 spaceru, který by mohl být potenciálně imunogenní, hodnotili jsme v tomto experimentu odezvu myší proti lidské protilátce (MAHA) odběrem retroorbitálního krvácení od myší. V séru myší nebyly 8. den po léčbě STEAP1-BBζ CAR T buňkami detekovány žádné protilátky proti lidskému IgG a IgM (doplňkový obrázek 14c).
Důležité je, že heterozygotní hSTEAP1-KI myši léčené STEAP1-mBBζ CAR T buňkami neprokázaly žádné zjevné narušení tkáně nebo zvýšenou infiltraci CD3+ T buněk v prostatě (doplňkový obrázek 15a, b ) nebo nadledvinka (doplňkový obrázek 15c, d) vzhledem k jejich protějškům ošetřeným netransdukovanými T buňkami, což naznačuje nepřítomnost mimonádorových toxicit na cíl. Plíce odebrané na konci experimentu ukázaly expresi lidského STEAP1 v plicních metastázách RM9-hSTEAP1 s regionální heterogenitou u myší léčených netransdukovanými myšími T buňkami (obr. 5g). Na druhé straně nádory z myší léčených myšími STEAP1-mBBζ CAR T buňkami opět vykazovaly nepřítomnost exprese lidského STEAP1 (obr. 5h). Abychom vyhodnotili, zda terapie myšími STEAP1- mBBζ CAR T lymfocyty a ztráta lidského antigenu STEAP1 mohou také ovlivnit prezentaci antigenu v nádorech RM9-hSTEAP1, provedli jsme IHC pro myší beta{18}}mikroglobulin (B2m ), která je klíčovou složkou molekul MHC I. třídy. Pozorovali jsme významnou downregulaci exprese B2m v progresivních nádorech po léčbě myšími STEAP1-mBBζ CAR T buňkami ve srovnání s netransdukovanými T buňkami (doplňkový obrázek 15e, f), což je v souladu s našimi zjištěními v modelu 22Rv1.
Obr. 4|Vytvoření systému myši v myši s myším modelem lidského STEAP1 knock-in (hSTEAP1-KI) a murinizovaným STEAP1 CAR. Schéma znázorňující strategii homologní rekombinace používající cílící vektor k knock-in lidských exonů STEAP1 2–5 do myšího lokusu Steap1 na pozadí C57Bl/6. FRT Flippase rozpoznávací cíl. b Vizualizace produktů PCR z genotypizace ocasních špiček myší divokého typu (+/+), heterozygotních (KI/+) nebo homozygotních (KI/KI) myší pomocí párů primerů určených k amplifikaci částí alel KI divokého typu nebo hSTEAP{17}} . NTC ovládání nulové šablony. Reprezentativní gelový snímek z n=3 biologicky nezávislých experimentů. c qPCR pro lidskou expresi STEAP1 normalizovaná na expresi 18S v průzkumu tkání z myší hSTEAP1-KI/+. n=3 pro pohlavně specifické orgány a n=6 pro běžné orgány. Sloupce představují průměr se SEM. Mikrofotografie barvení STEAP1 IHC (d) tkání prostaty z (vlevo) +/+ a (vpravo) KI/+ myší a (e) nadledvin z KI/+ myši. Měřítko=50 µm. Pro panel (d, e) bylo imunobarvení STEAP1 provedeno na n=3 biologicky nezávislých vzorcích. f Schéma retrovirového murinizovaného konstruktu STEAP1 CAR. MuLV virus myší leukémie, mCD19t myší zkrácený CD19. g Kvantifikace účinnosti retrovirové transdukce aktivovaných myších T buněk ze tří nezávislých experimentů založených na frekvenci myších CD3+ CD19t+ buněk průtokovou cytometrií (p {{4{49}}}}.0003). h Relativní buněčná životaschopnost cílových buněk RM9 nebo RM9-hSTEAP1 v průběhu času měřená fluorescenčním zobrazením živých buněk při společné kultivaci v poměru 1:1 s myšími STEAP1-mBBζ CAR T buňkami nebo netransdukovanými T buňkami (p < 0,0001). n=4 biologických replikací na stav. Chybové úsečky představují průměr se SEM. Pro panel (g) byl použit nepárový dvoustranný Studentův t-test s Welchovou korekcí. V panelu (h) byla použita dvoucestná ANOVA se Sidakovým vícenásobným srovnávacím testem. Zdrojová data jsou uvedena v souboru zdrojových dat.
Obr. 5|Stanovení účinnosti a bezpečnosti myších STEAP1-mBBζ CAR T buněk u hSTEAP1-KI myší nesoucích syngenní, diseminovaný karcinom prostaty.
Fúzní cytokin doména vázající kolagen-IL-12 vyvolává protinádorové reakce prostřednictvím zesílené signalizace receptoru T buněk a prezentace antigenu
IL{{0}} je heterodimerní cytokin sestávající z podjednotek p40 a p35, který reguluje odpovědi T buněk a vede k produkci IFN-. Nápadné protinádorové odpovědi spojené se systémovým podáváním IL-12 byly prokázány na několika preklinických modelech58,59 ale přenos tohoto terapeutického přístupu do klinické praxe se zastavil kvůli toxicitě a neúčinnosti limitující dávku60–63. Alternativní strategie, jak tyto problémy obejít, byly zaměřeny na lokalizaci IL{{10}} do nádorů, a to buď intratumorálním podáním, nebo úpravou IL{11}} fúzních proteinů k využití jedinečných vlastností mikroprostředí nádoru. Jedním z nedávno popsaných přístupů je fúze s doménou von Willebrandova faktoru A3, která slouží jako doména vázající kolagen (CBD, obr. 6a) a umožňuje vazbu fúzních proteinů na exponovaný kolagen v neuspořádané vaskulatuře nádoru64. Ukázalo se, že systémová terapie CBD-IL-12 remodeluje nádorové mikroprostředí imunologicky „chladných“ myších modelů rakoviny prsu a melanomu prostřednictvím zesílené signalizace IFN- a spolupracuje s anti-PD{{20}} inhibice imunitního kontrolního bodu k vyvolání eradikace nádoru65. Ptali jsme se, zda by CBD-IL-12 mohl být účinný při přeměně rakoviny prostaty z „studené“ na „horkou“ a při indukci protinádorových reakcí. Subkutánní, syngenní nádory RM9 a Myc-CaP byly založeny u samců myší C57Bl/6 a FVB a myši byly randomizovány k léčbě vehikulem, anti-PD-1 nebo CBD-IL-12 . Systémové podávání CBD-IL-12 indukovalo významnou inhibici růstu nádoru u syngenních modelů nádorů RM9 i Myc-CaP, které jinak špatně reagovaly na anti-PD-1 terapii (obr. 6b, doplňkový obr. 16a) . Abychom získali další přehled o mechanismech působení CBD-IL-12, provedli jsme jednobuněčnou RNA-seq (scRNA-seq) analýzu nádorů RM9 od myší léčených buď vehikulem nebo CBDIL-12. Grafy stejnoměrné aproximace a projekce ukázaly podstatné snížení nádorových epiteliálních, fibroblastových a endoteliálních buněčných kompartmentů (doplňkový obrázek 16b) konzistentní s protinádorovou aktivitou. Markerové profilování podskupin vrozených a adaptivních imunitních buněk (obr. 6c, d) v datech scRNA-seq identifikovalo podstatné zvýšení CD8+ T buněk (7,55 vs. 0,76 %) , antigen křížově prezentující buňky včetně XCR1+ IRF8+ konvenční dendritické buňky typu 1 (cDC1, 1,33 vs. 0 %), CD86+ INOS2+ polarizované makrofágy M1 ( 2,26 vs 0 %) a CD64+ F4/ 80+ monocyty/makrofágy (29,2 vs 4,43 %) u nádorů ze skupiny léčené CBDIL-12 ve srovnání s kontrolní skupinou s vehikulem. S terapií CBD-IL{91}} bylo také spojeno snížení imunosupresivních CD163+ CD206+ M2 polarizovaných makrofágů (0 vs. 0,25 %) a Ly6G+ neutrofilů (0,52 vs. 1,08 %). Analýza IHC potvrdila, že nádory RM9 ošetřené vehikulem obecně postrádaly CD8+ T buňky, zatímco nádory léčené CBD-IL-12 vykazovaly viditelně významnou infiltraci CD8+ T buněk (doplňkový obrázek 16c) . Nádorové buňky prokázaly zvýšenou expresi proteazomu a imunoproteazomových podjednotek Psmb8 a Psmb9 a genů H2-}K1, H2-D1 a B2m hlavního histokompatibilního komplexu třídy I (MHC I), což je v souladu s upregulací zpracování antigenu a prezentační zařízení (obr. 6e, doplňkový obrázek 16d). Paralelně T buňky vykazovaly zvýšenou genovou expresi spojenou se signalizací receptoru T buněk a imunoregulačními interakcemi mezi lymfoidní a nelymfoidní buňkou (obr. 6f, doplňkový obr. 16e). Buňky mononukleárního fagocytového systému (MPS) vykazovaly obohacenou genovou expresi související se zpracováním antigenu a křížovou prezentací a také cytokinovou signalizací (doplňkový obrázek 16f, g). Tyto studie prokázaly protinádorovou aktivitu CBD-IL{113}} v modelech rakoviny prostaty prostřednictvím přeprogramování mikroprostředí nádoru a zapojení jak vrozeného, tak adaptivního imunitního systému.
Lepší kontrola nádoru se současnou terapií STEAP1-mBBζ CAR T buňkami a CBD-IL-12
Dále jsme předpokládali, že rozšíření protinádorové imunitní odpovědi pomocí terapie CBD-IL-12 by mohlo zlepšit terapeutickou účinnost STEAP1-mBBζ CAR T buněčné terapie u rakoviny prostaty bojem proti heterogenitě nádorového antigenu a záchranou zpracování antigenu a prezentace. Proto jsme vytvořili syngenní, neklonální RM9-STEAP{5}}fLuc metastázy u samců heterozygotních hSTEAP1-KI myší a randomizovali jsme je k léčbě buď 5 × 106 netransdukované myší T buňky nebo myší STEAP1-mBBζ CAR T buňky pomocí injekce do ocasní žíly s nebo bez týdenní terapie CBD-IL-12 pomocí retroorbitální sinusové injekce. Skupiny, které dostávaly terapii CBD-IL-12 samotnou nebo v kombinaci s terapií STEAP1-mBBζ CAR T, nedostaly cyklofosfamid depleční lymfy (obr. 7a). Sériové BLI odhalilo rychlou progresi onemocnění u myší léčených netransdukovanými T buňkami a CBD-IL-12, zatímco ty, které dostávaly STEAP1-BBζ CAR T buňky v kombinaci s CBD-IL-12 terapií, prokázaly významnou zpoždění progrese nádoru (obr. 7b, c). Důležité je, že kombinovaná léčba myšími STEAP1- mBBζ CAR T buňkami a týdenním CBD-IL-12 byla spojena se statisticky významným prodloužením celkového přežití ve srovnání se všemi ostatními léčebnými skupinami (obr. 7d). Analýza plazmatických cytokinů na retroorbitálním krvácení odebraném v den 0 a den 8 léčby ukázala významný nárůst hladin prozánětlivých cytokinů IFN-, TNF-, IL-6 a IL-4 (obr. 7e, doplňkový obr. 17) u myší léčených STEAP1-mBBζ CAR T buňkami a CBD-IL-12. Zbytkové nádory byly odebrány při pitvě a STEAP1 IHC vykazoval ztrátu antigenu u nádorů z myší léčených jak STEAP1- mBBζ CAR T buňkami samotnými, tak v kombinaci s CBD-IL-12 (obr. 8a). Kromě toho jsme pozorovali zvýšení exprese nádoru B2m (obr. 8a) spojené s terapií CBD-IL-12. CD3+ T buňky byly také zvýšeny (obr. 8b) u nádorových stavů podrobených IL-12 terapii, ale i když byl tento trend oceněn, nezjistili jsme statisticky významný nárůst intratumorálních T buněk mezi STEAP1-mBBζ CAR T buňky a kombinované léčebné skupiny STEAP1-mBBζ CAR T buňky a CBD-IL-12. Reziduální nádory včetně nádorů od myší léčených kombinovanými STEAP1-mBBζ CAR T buňkami a CBD-IL-12 odebranými při maximální léčebné odpovědi (nadir) v den 10 a při soucitných koncových bodech progrese nádoru (relaps) byly disociované na jednotlivé buňky a podskupiny imunitních buněk byly charakterizovány multiparametrickou průtokovou cytometrií (doplňkový obrázek 18). V souladu s našimi výsledky scRNA-seq vedla léčba CBD-IL-12 buď samostatně, nebo v kombinaci s STEAP1-mBBζ CAR T buňkami k významnému zvýšení CD11b+ Ly6C-/+F4/{{68 }} Makrofágy MHC-II+ (obr. 8c, d, doplňkový obr. 19a). CD11b+ Ly6CF4/80+ MHC-II+ buňky představují zralé makrofágy prezentující antigen66 a tato populace byla přednostně obohacena a prokázala zvýšenou expresi indukované syntázy oxidu dusnatého (iNOS) jako marker prozánětlivé polarizace M1 pomocí CBD-IL{{84} } terapie. Pozorovali jsme také expanzi populace cDC1 a snížení populace konvenčních dendritických buněk typu 2 (cDC2) (obr. 8e, doplňkový obr. 19b). cDC1 se účastní aktivace protinádorových cytotoxických CD8+ T buněk a potenciálních mechanismů terapeutické rezistence. Nenašli jsme žádné známky migrace buněk do nádoru, zatímco cDC2 jsou důležité pro aktivaci významného rozdílu v poměrech přirozených zabíječů KLRG1+ a KLRG1- CD4+ T buněk včetně Tregs67 . V souladu s nálezy cDC2, buňky napříč léčebnými skupinami (doplňkový obrázek 19d). Frekvenční profilování CD4+ FOXP3+ Tregs odhalilo pokles Tregs spojený s F40/80+ SiglecF+ eozinofily byly zvýšeny, zatímco Ly6G+ neucioval pomocí CBD-IL{108}} terapie (doplňkové Obrázek 19c). Zajímavé je, že trofily byly sníženy přidáním CBD-IL-12 do STEAP1- jsme pozorovali, že u recidivujících nádorů po kombinované terapii STEAP1-mBBζ mBBζ CAR T buňkami (obr. 8f, G). Pozoruhodné je, že frekvence těchto CAR T lymfocytů a terapie CBD-IL{116}} se snížila v cDC1 a neutrofily spojené s nádorem byly zvýšeny léčbou se zvýšením Tregs, což implikuje sníženou priming cytotoxického CD8 STEAP{120 }}mBBζ CAR T lymfocyty ve srovnání s netransdukovanými T lymfocyty (54 vs. T lymfocyty a obohacení imunosupresivní signalizací Treg jako 34 %), snížené v podmínkách s terapií CBD-IL-12, ale zvýšené po relapsu nádoru po kombinovaném STEAP 1-mBBζ CAR T buňky a CBD-IL{127}} terapie (19 až 42 %). Tato zjištění naznačují, že imunosupresivní vlastnosti neutrofilů spojených s nádorem mohou hrát významnou roli ve zprostředkování rezistence na léčbu a progrese nádoru. Celkově tyto analýzy ukazují, že léčba CBD-IL{132}} vrací nepřátelské imunosupresivní nádorové prostředí do prozánětlivého stavu a rozšiřuje protinádorovou aktivitu ve spojení s adoptivně přenesenou terapií T lymfocyty STEAP1-mBBζ CAR. Dále jsme provedli analýzu repertoáru TCR pomocí multiplexního sekvenování beta řetězce TCR na bázi PCR68 na nádorech nesoucích plíce odebraných z každé léčebné skupiny při pitvě. Pozorovali jsme významný pokles Simpsonovy klonality ve vzorcích od myší léčených CBD-IL-12 samotným a v kombinaci s STEAP1-mBBζ CAR T buněčnou terapií, což svědčilo o zvýšené intratumorální diverzitě T buněk (obr. 8h). Tato zjištění ukazují, že přidání CBD-IL-12 jako doplňku k terapii T lymfocyty STEAP1 CAR může být prospěšné prostřednictvím remodelace mikroprostředí nádoru rakoviny prostaty, zlepšení zpracování a prezentace antigenu a zapojení hostitelské imunity k podpoře šíření epitopu.
Obr. 6|Systémová cytokinová fúzní terapie kolagen-vazebná doména IL-12 (CBD-IL-12) inhibuje růst nádoru rakoviny prostaty a přeprogramuje mikroprostředí imunitního systému nádoru. Schéma CBD-IL-12, složené z podjednotek p35 a p40 fúzovaných s CBD z domény A3 von Willebrandova faktoru. b Objemy RM9 subkutánních nádorů u syngenních myší C57Bl/6 v průběhu času s léčbou vehikulem, anti-PD-1 (klon 29 F.1A12) 200 Μg intraperitoneální injekcí každých 5 dní, nebo CBD-IL-12 25 Μg intravenózní injekcí každých 5 dní počínaje dnem 0. n=7 myší ve skupinách léčených vehikulem a CBD-IL-12 a n=8 myší v anti -skupina léčená PD1. p < 0,0001 ve dnech 9 a 12. Sloupce představují průměr se SEM. P-hodnoty jsou odvozeny z dvoucestné ANOVA s Dunnettovým vícenásobným srovnávacím testem, ns nevýznamné. c Grafy UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) různých podskupin imunitních buněk (nahoře) z analýzy jednobuněčné RNA-seq (scRNA-seq) pěti nádorů RM9, každý agregovaný z myší léčených vehikulem nebo CBD-IL{{41} }. UMAP grafy obarvené genovou expresí markerů specifických pro podmnožinu imunitních buněk pro panmonocyty/makrofágy, polarizované makrofágy M1 a M2, konvenční dendritické buňky typu 1 (cDC1), přirozené zabíječské buňky (NK) a pomocné T pomocné buňky typu 1 (Th1) buňky. d Grafy ukazující frekvenci specifických populací imunitních buněk (vzhledem k CD45 + imunitním buňkám) identifikovaných analýzou scRNA-seq včetně CD4+ a CD8+ T buněk, Th1 (Infg+ Tbx{ {56}} ) a Th2 (cMAF+ Gata3+ ) buňky, Ly6C+/− monocyty/makrofágy (Ly6C+/− Adgre1+ ), M1 makrofágy (CD80+ CD{{67} } INOS2+ ), makrofágy M2 (CD163+ Mrc1+ cMAF+), cDC1 (XCR1+ IRF8+), konvenční dendritické buňky typu 2 (cDC2 , CD1+ IRF4+ ), migrační CD103+ dendritické buňky (Itgae+), eozinofily (SiglecF+), neutrofily (Ly6G+) a NK buňky (Klrb1c+ Ncr1+) u nádorů léčených vehikulem nebo CBDIL-12. Vulkánové grafy ukazující rozdílnou genovou expresi v (e) nádorových buňkách a (f) T buňkách z nádorů RM9 myší léčených CBD-IL-12 ve srovnání s těmi, kterým bylo podáváno vehikulum. FC násobná změna, FDR míra falešného objevu. Zdrojová data jsou uvedena v souboru zdrojových dat.
Diskuse
Účinnost terapie CAR T lymfocyty a dalších cílených terapeutik na bázi imunity je vysoce závislá na konzistentní expresi antigenu na všech nebo většině buněk zahrnujících nádorovou populaci u jednotlivého pacienta. Heterogenita antigenu je však výrazná u solidních nádorů včetně rakoviny prostaty, kde je progrese k mCRPC a rezistence na léčbu spojena se vznikem odlišných podtypů onemocnění vyznačujících se odlišnými transkripčními programy –71 a expresí antigenu na povrchu buněk. Zatímco PSMA je považován za jeden z předních biomarkerů u karcinomu prostaty s významnou nadměrnou expresí zjištěnou napříč spektrem progrese onemocnění, naše práce potvrzuje zjištění z nedávné publikace14, která naznačuje, že exprese PSMA je u letálního mCRPC heterogenní. Ukazujeme, že STEAP1 je v tomto nastavení šířeji exprimován než PSMA, ale v žádném případě není exprimován jednotně ve vysokých hladinách ve všech tkáních mCRPC. Žádná terapie cílená na jeden antigen včetně terapie CAR T buňkami nemusí být schopna překonat již existující heterogenitu nádorového antigenu v mCRPC. Je tedy kriticky důležité důkladně pověřit další terapeutické cíle, jako je STEAP1 v mCRPC, které mohou umožnit kombinační terapie, které vyvíjejí nepřekonatelný terapeutický tlak. Patří mezi ně duální antigen-cílené (např. PSMA a STEAP1) terapie CAR T lymfocyty nebo multimodální strategie kombinující terapie CAR T lymfocyty s ADC, T-BsAb nebo jiné léčby, které silně podporují na antigenu nezávislé a závislé zabíjení nádorů. Vytvořili jsme STEAP1-cílenou CAR T buněčnou terapii, která je vysoce antigenně specifická a funkčně lokalizovala epitop rozpoznávaný CAR do druhého ECD STEAP1. Naše STEAP1-BBζ CAR T buňky prokazují podstatnou protinádorovou aktivitu proti mnoha modelům diseminované rakoviny prostaty jak ve studiích typu člověk na myši, tak na myši na myši. Důležité je, že náš STEAP1-BBζ CAR je schopen vyvolat aktivaci T buněk a cytolýzu cílových buněk i v podmínkách nízké hustoty antigenu, jak dokazuje reaktivita proti modelu rakoviny prostaty PC3. Tato citlivost STEAP1-BBζ CAR T buněk na nízké hladiny exprese STEAP1 však může být výhodná z hlediska zvýšení protinádorové účinnosti, ale mohla by také zvýrazňovat závazky z on-target off-tumor toxicity. Systémová exprese STEAP1 byla dříve hlášena jako prakticky nepřítomná v normálních lidských tkáních18,72 kromě prostaty, kde byla popsána membránová exprese v epiteliálních buňkách prostaty27. Abychom se ponořili do bezpečnosti terapie T lymfocyty STEAP1-BBζCAR T v preklinickém prostředí, vytvořili jsme humanizovaný model myši STEAP1. Myší model hSTEAP1-KI rekapituloval expresi lidského STEAP1 v prostatě a ukázal expresi v kůře nadledvin. Uklidňující je, že terapie T lymfocyty STEAP1-BBζ CAR v dávce dostatečné k vyvolání protinádorové aktivity nevedla k evidentní systémové toxicitě u myší hSTEAP1-KI včetně mimonádorových toxicit na místech lidského STEAP1 výraz. Opakujícím se mechanismem relapsu a progrese karcinomu prostaty po terapii T lymfocyty STEAP1-BBζ CAR v našich studiích byl únik nádorového antigenu. Na jedné straně toto zjištění podtrhuje celkovou účinnost terapie T lymfocyty STEAP1-BBζ CAR. Není však jasné, zda je ztráta exprese nádorového STEAP1 způsobena pouze inherentní heterogenitou nádorového antigenu, nebo zda existuje také adaptivní downregulace exprese STEAP1. Nedávná publikace ukázala, že methylace promotoru STEAP1 moduluje expresi STEAP1 a epigenetickou deregulaci pomocí DNA methyltransferázy a inhibice histondeacetylázy byla dostatečná k výraznému zvýšení exprese STEAP173. Léčba epigenetickými inhibitory v kombinaci s terapií STEAP1 CAR T buňkami by mohla současně zvýšit expresi nádoru STEAP1 a přeprogramovat CAR T buňky do příznivých diferenciačních stavů odolných vůči vyčerpání74,75, čímž by se zmírnila ztráta nádorového antigenu a zvýšila se protinádorová účinnost u rakoviny prostaty. Naše studie také naznačuje, že STEAP1 hraje funkční roli při regulaci progrese buněčného cyklu a buněčného metabolismu u rakoviny prostaty. STEAP1 je jedinečný od ostatních členů rodiny STEAP (STEAP2, 3 a 4) v tom, že postrádá intracelulární doménu oxidoreduktázy22, která je nezbytná pro aktivitu metaloreduktázy. V důsledku toho homotrimery STEAP1, ale nikoli heterotrimery s jinými proteiny STEAP, postrádají enzymatickou funkci redukce Fe3+ na Fe2+ a Cu2+ na Cu1+. Zda a jak zapojení STEAP1 do kovových iontů a buněčného metabolismu podporuje progresi rakoviny, musí být ještě stanoveno a stojí za další zkoumání. Imunologicky „chladné“ nádorové mikroprostředí rakoviny prostaty je hlavní překážkou účinnosti protinádorové imunoterapie. Například průzkumné studie spojené s fází I klinické studie PSMA CAR T buněčné terapie obrněné k expresi dominantně negativního receptoru transformujícího růstového faktoru (TGF R-DN) v mCRPC ukázaly, že exprese imunosupresivních signálních molekul v mikroprostředí nádoru se zvyšuje po infuzi CAR T13. V našich studiích byla kritickým zjištěním souvislost mezi ztrátou exprese STEAP1 a downregulací zpracování a prezentace antigenu, a to jak u knockoutovaných buněk STEAP1, tak u nádorů se ztrátou antigenu STEAP1 po terapii T lymfocyty STEAP1-BBζ CAR. Ztráta antigenu STEAP1 u rakoviny prostaty tedy podporuje nejen přímou rezistenci vůči terapii T lymfocyty STEAP1-BBζ CAR, ale může také omezit adaptivní protinádorovou imunitu hostitele. Ztráta exprese nádorového cílového antigenu a konverze do více imunosupresivního stavu se zvýšenou infiltrací Tregs a vyšší expresí imunosupresivních molekul byla také pozorována ve fázi I studie EGFR-vIII CAR T buněk u účastníků s rekurentním glioblastomem76. K pochopení funkčních mechanismů, které jsou základem ztráty antigenu STEAP1, a obecněji toho, jak mohou dynamické účinky adoptivní terapie CAR T buňkami přispívat ke ztrátě antigenu a imunoeditaci modulací interakcí nádor-imunitní-stromální v solidních nádorech, bude zapotřebí další práce.
Obr. 7|Kombinace CBD-IL-12 s STEAP1-mBBζ CAR T buněčnou terapií zlepšuje celkové přežití a hladiny zánětlivých cytokinů. Schéma experimentu s nádorovou výzvou pro RM9-hSTEAP1 diseminovaný model u hSTEAP1-KI/+ myší zkoumajících kombinaci CBD-IL-12 se STEAP{{1{{18} }}}mBBζ CAR T buněčná terapie. Cy cyklofosfamid (pro předkondicionování). Vytvořeno pomocí BioRender.com. b Sériové živé BLI myší hSTEAP1-KI/ + s implantovanými metastázami RM9-hSTEAP1- fLuc a léčených jedinou intravenózní injekcí 5×106 myší bez transdukce T buňky nebo STEAP1-mBBζ CAR T buňky v den 0 s nebo bez léčby CBD-IL- 12 týdně. Červené X označuje zesnulé myši. Je zobrazena stupnice záření. (c) Graf ukazující kvantifikaci celkového toku v průběhu času ze živého BLI každé myši v (b). d Kaplan-Meierovy křivky přežití myší v (b) se statistickou významností stanovenou log-rank (Mantel-Cox) testem (p=0,002). e Grafy ukazující hladiny sérových cytokinů IFN- (vlevo, p=0,002) a TNF- (vpravo, p < 0,0001) na základě imunotestů ProcartaPlex z retroorbitálního krvácení myší hSTEAP1-KI/+ ( n=4 myší na skupinu) nesoucích metastázy RM9-hSTEAP1-fLuc před (den 0) a po léčbě (den 8) netransdukovanými myšími T buňkami nebo myším STEAP{{38} }mBBζ CAR T buňky s nebo bez terapie CBD-IL{40}}. Chybová úsečka představuje průměr s SEM. Pro panel (e) byly p-hodnoty odvozeny z dvoucestné ANOVA se Sidakovým testem vícenásobného srovnání. Zdrojová data jsou uvedena v souboru zdrojových dat.
Obr. 8|Kombinace CBD-IL-12 s STEAP1-mBBζ CAR T buněčnou terapií přeprogramuje imunitní mikroprostředí nádoru a podporuje prezentaci antigenu a šíření epitopu. a Mikrofotografie STEAP1 (nahoře), B2m (uprostřed) a CD3 (dole) IHC barvení RM9-hSTEAP1 plicních nádorů po léčbě myšími netransdukovanými T buňkami nebo STEAP1-mBBζ CAR T buňkami s nebo bez léčby CBD-IL{11}}. Měřítko=50 µm. b Sloupcový graf ukazující IHC kvantifikaci CD3 pozitivních buněk infiltrujících metastatické plicní nádory (n=4 nádorů na skupinu). Jednosměrná ANOVA p=0.{{80}}021. Chybový pruh představuje střední hodnotu s SD. Grafy ukazující frekvence (c) Ly6C− F4/{{20}} MHC-II+ (vlevo, jednosměrná ANOVA p=0.00{ {98}}5) a Ly6C − F4/80+ iNOS2+ (vpravo, jednosměrná ANOVA p=0.0017) makrofágy, (d) Ly6C+ F4/ {{36} } makrofágy MHC-II+ (vlevo, jednosměrná ANOVA p=0.0038) a Ly6C+ F4/80+ iNOS2+ (vpravo, jednosměrná ANOVA p=ns), (e) CD11b+ XCR1+ cDC1 (jednosměrná ANOVA p=0.0003), (f) F4/80+ SiglecF+ eozinofily (jednocestná ANOVA p=0. 0008) a (g) Ly6G+ neutrofily (jednocestná ANOVA p=0.0035) normalizované na celkový počet CD45+ buněk, jak bylo stanoveno multiparametrickou průtokovou cytometrií po léčbě netransdukovanými T buňkami, STEAP{{67 }}mBBζ CAR T buňky, netransdukované T buňky a CBD-IL-12 a STEAP1- mBBζ CAR T buňky a CBD-IL-12 při maximální léčebné odpovědi (nadir) a relapsu nádoru (recidiva). h Sloupcové grafy představující Simpsonovu klonalitu jako míru 'rovnoměrnosti' repertoáru TCR analyzovaného sekvenováním TCRB na buňkách infiltrujících nádor odebraných z myší v (a). n=4 nádorů na skupinu. P-hodnoty pro netransdukované T buňky + CBD-IL-12 ve srovnání s netransdukovanými T buňkami a STEAP1-mBBζ CAR T buňkami jsou 0,008 a 0,02, v daném pořadí; a STEAP1-mBBζ CAR T buňky + CBD-IL-12 ve srovnání s netransdukovanými a STEAP1-mBBζ CAR T buňkami jsou 0,004 a 0,01, v tomto pořadí. Chybový pruh představuje střední hodnotu s SD. Pro panely (c–g) n=3 nádorů na skupinu, *p < 0,05; **p < 0,01, ***p < 0,001, p-hodnoty v panelech (b–h) jsou z jednosměrné ANOVA s Dunnovým vícenásobným srovnávacím testem. Zdrojová data jsou uvedena v souboru zdrojových dat.
Abychom rozšířili protinádorovou odpověď, zkoumali jsme systémové podávání CBD-IL-12 v kombinaci s STEAP1-BBζ CAR T buněčnou terapií v modelu diseminovaného, syngenního nádoru RM9-hSTEAP1 v hSTEAP 1-KI myši k přiblížení imunosupresivní povahy mCRPC na základě předchozí charakterizace RM9 jako špatně imunogenního modelu57,77. Společná léčba s CBD-IL12 vedla ke zlepšení celkového přežití, produkce cytokinů, prezentace nádorového antigenu a intratumorální diverzity T buněk v souladu se šířením epitopu. Důkladné zkoumání imunitního mikroprostředí nádoru odhalilo, že přidání CBD-IL-12 do terapie T lymfocyty STEAP1-BBζ CAR indukuje reverzi nádorového stromatu a zvyšuje aktivované makrofágy a cDC1 a zároveň snižuje neutrofily spojené s nádorem. V našich studiích však nebylo dosaženo vyléčení a zdůrazňujeme potenciální kompenzační, adaptivní mechanismy rezistence a progrese nádoru, včetně zvýšených frekvencí imunosupresivních neutrofilů a cDC2, které mohou podporovat indukci Treg. Je důležité poznamenat, že k maximalizaci protinádorových odpovědí může být zapotřebí další optimalizace dávky a rozvrhu podávání CBD-IL-12. Tyto výsledky však podporují výzkum kombinatorických imunoterapeutických přístupů, jako je armoring CAR T buněk k expresi rekombinantních cytokinů78 (např. IL-2, IL-12, IL-15 nebo IL{{24 }}), současnou léčbou imunomodulátory (např. anti-PD-1/PD-L1 nebo anti-CTLA4) nebo radioterapií zaměřenou na nádor k remodelaci mikroprostředí nádoru rakoviny prostaty a posílení funkce efektoru T buněk CAR. Zatímco se tento rukopis připravoval, studie skupiny v Norsku ohlásila preklinický vývoj terapie T lymfocyty STEAP1 CAR s protinádorovou aktivitou u subkutánního modelu 22Rv1 u imunokompromitovaných myší79. Hlášená STEAP1 CAR se liší od STEAP1-BBζ CAR, protože obsahuje syntetický scFv nazývaný Oslo1 a pantovou a transmembránovou doménu CD8. Dalším rozlišovacím znakem je, že STEAP1-BBζ CAR T buňky jsou připraveny jako definovaný produkt s normálním poměrem CD4/CD8 T buněk, zatímco Oslo1 STEAP1 CAR T buňky nikoli. Mechanismy rezistence a studií bezpečnosti souvisejících s léčbou Oslo1 STEAP1 CAR T lymfocyty nebyly hlášeny. Bude však zajímavé vidět, jak tyto rozdíly v inženýrství CAR a složení buněčných produktů mohou ovlivnit protinádorovou účinnost, perzistenci a bezpečnost, protože jak Oslo1 STEAP1 CAR T buněčná terapie, tak naše STEAP1-BBζ CAR T buněčná terapie programy jsou přeloženy na kliniku. Výsledky našich studií vedly k partnerství s programem National Cancer Institute (NCI) Experimental Therapeutics (NExT) s cílem převést terapii STEAP1-BBζ CAR T lymfocyty na první studii na lidech u mužů s mCRPC. Signály bezpečnosti a účinnosti z této rané fáze klinické studie pomohou určit, zda může mít hodnotu také zkoumání tohoto terapeutického přístupu u jiných typů rakoviny, které vysoce exprimují STEAP1.
Reference
1. Siegel, RL, Miller, KD, Fuchs, HE & Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: Cancer J. Clinicians 72, 7–33 (2022).
2. Armstrong, AJ a kol. Predikce pětiletého přežití a výsledky bezpečnosti s enzalutamidem u mužů s metastatickým kastračně rezistentním karcinomem prostaty bez chemoterapie ze studie PREVAIL. Eur. Urol. 78, 347–357 (2020).
3. Fizazi, K. a kol. Abirateron plus prednison u metastatického karcinomu prostaty citlivého na kastraci. N. Engl. J. Med. 377, 352–360 (2017).
4. Scher, HI a kol. Zvýšené přežití s enzalutamidem u rakoviny prostaty po chemoterapii. N. Engl. J. Med. 367, 1187–1197 (2012).
5. Parker, C. a kol. Radium emitoru alfa-223 a přežití u metastatického karcinomu prostaty. N. Engl. J. Med. 369, 213–223 (2013).
6. Sartor, O. a kol. Lutecium-177–PSMA-617 pro metastatický kastračně rezistentní karcinom prostaty. N. Engl. J. Med. 385, 1091–1103 (2021).
7. Kantoff, PW a kol. Imunoterapie Sipuleucel-T pro kastračně rezistentní karcinom prostaty. N. Engl. J. Med. 363, 411–422 (2010).
8. Jackson, HJ, Rafiq, S. & Brentjens, RJ Řízení CAR T-buněk vpřed. Nat. Clin. Oncol. 13, 370–383 (2016).
9. Weiner, GJ Budování lepších terapeutik na bázi monoklonálních protilátek. Nat. Rev. Cancer 15, 361–370 (2015).
10. Chavez, JC, Bachmeier, C. & Kharfan-Dabaja, MA CAR T-buněčná terapie pro B-buněčné lymfomy: výsledky klinických studií dostupných produktů. Terapeutické Adv. Hematol. 10, 2040620719841581 (2019).
11. Sterner, RC & Sterner, RM CAR-T buněčná terapie: současná omezení a potenciální strategie. Rakovina krve J. 11, 69 (2021).
12. Slovin, SF a kol. Studie fáze 1 P-PSMA-101 CAR-T buněk u pacientů s metastatickým kastračně rezistentním karcinomem prostaty (mCRPC). J. Clin. Oncol. 40, 98–98 (2022).
13. Narayan, V. a kol. Pancéřované CAR T buňky zacílené na TGF necitlivé na PSMA u metastatického kastračně rezistentního karcinomu prostaty: studie fáze 1. Nat. Med. 28, 724–734 (2022).
14. Paschalis, A. a kol. Heterogenita prostatického specifického membránového antigenu a defekty opravy DNA u rakoviny prostaty. Euro. Urol. 76, 469–478 (2019).
15. Chen, N., Li, X., Chintala, NK, Tano, ZE & Adusumilli, PS Řízení aut na nerovné cestě heterogenity antigenu u solidních nádorů. Curr. Opin. Immunol. 51, 103–110 (2018).
16. Morgan, RA a kol. Kazuistika závažné nežádoucí příhody po podání T buněk transdukovaných chimérickým antigenním receptorem rozpoznávajícím ERBB2. Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther. 18, 843–851 (2010).
17. Lee, JK a kol. Systémové profilování povrchomu identifikuje cílové antigeny pro imunoterapii u podtypů pokročilého karcinomu prostaty. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 115, E4473–e4482 (2018).
18. Hubert, RS a kol. STEAP: prostatický specifický buněčný povrchový antigen vysoce exprimovaný v lidských nádorech prostaty. Proč. Natl Acad. Sci. USA 96, 14523–14528 (1999).
19. Nolan-Stevaux, O. Abstrakt DDT02-03: AMG 509: Nová, humanizovaná, s prodlouženým poločasem, bispecifická STEAP1 × CD3 T lymfocyty rekrutující XmAb® 2+1 protilátka. Cancer Res. 80, DDT02-03-DDT02-03 (2020).
20. Grunewald, TG a kol. Vysoká exprese STEAP1 je spojena se zlepšenými výsledky u pacientů s Ewingovým sarkomem. Ann. Oncol. Vypnuto. J. Eur. Soc. Med. Oncol. 23, 2185–2190 (2012).
21. Moreaux, J., Kassambara, A., Hose, D. & Klein, B. STEAP1 je nadměrně exprimován u rakoviny: slibný terapeutický cíl. Biochem. Biophys. Res. Commun. 429, 148–155 (2012).
22. Oosterheert, W. & Gros, P. Kryo-elektronová mikroskopie struktura a potenciální enzymatická funkce lidského šestitransmembránového epiteliálního antigenu prostaty 1 (STEAP1). J. Biol. Chem. 295, 9502–9512 (2020).
23. Jiao, Z. a kol. Šestitransmembránový epiteliální antigen exprese prostaty 1 podporuje metastázy rakoviny vaječníků tím, že napomáhá progresi přechodu z epitelu na mezenchym. Histochem. Cell Biol. 154, 215–230 (2020).
24. Gomes, IM, Arinto, P., Lopes, C., Santos, ČR & Maia, CJ STEAP1 je nadměrně exprimován u rakoviny prostaty a intraepiteliálních neoplazií prostaty a je pozitivně spojen s Gleasonovým skóre. In Urologická onkologie: semináře a původní vyšetření. sv. 32, 53.e23–53.e29 (Elsevier, 2014).
25. Huo, S.-f. a kol. STEAP1 usnadňuje metastázování a epiteliálně-mezenchymální přechod plicního adenokarcinomu prostřednictvím signální dráhy JAK2/STAT3. Biosci. Rep. 40, BSR20193169 (2020).
26. Gomes, IM a kol. Knockdown STEAP1 inhibuje buněčný růst a indukuje apoptózu v buňkách rakoviny prostaty LNCaP, čímž působí proti účinku androgenů. Med. Oncol. 35, 1–10 (2018).
27. Gomes, IM, Maia, CJ & Santos, ČR STEAP proteiny: od struktury k aplikacím v terapii rakoviny. Mol. Cancer Res. MCR 10, 573–587 (2012).
28. Danila, DC a kol. Studie fáze I DSTP3086S, konjugátu protilátka-lék zacíleného na šestitransmembránový epiteliální antigen prostaty 1, u metastatického karcinomu prostaty rezistentního na kastraci. J. Clin. Oncol. Vypnuto. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 37, 3518–3527 (2019).
29. Kelly, WK a kol. Studie fáze I s AMG 509, imunitní terapií XmAb 2+1 rekrutující T buňky STEAP1 x CD3, u pacientů s metastatickým karcinomem prostaty rezistentním na kastraci (mCRPC). J. Clin. Oncol. 38, TPS5589–TPS5589 (2020).
30. Lin, T.-Y., Park, JA, Long, A., Guo, H.-F. & Cheung, N.-KV Nová účinná anti-STEAP1 bispecifická protilátka k přesměrování T buněk pro imunoterapii rakoviny. J. Immunother. Rakovina 9, e003114 (2021).
31. Schober, SJ a kol. TCR-transgenní CD4(+) T buňky omezené na MHC I. třídy proti STEAP1 zprostředkovávají lokální kontrolu nádoru Ewingova sarkomu in vivo. Buňky 9, 1581 (2020).
32. Roudier, MP a kol. Fenotypová heterogenita konečného stádia karcinomu prostaty metastatického do kosti. Hučení. Pathol. 34, 646-653 (2003).
33. Gomes, IM, Santos, ČR, Socorro, S. & Maia, CJ Šest transmembránový epiteliální antigen prostaty 1 je down-regulován pohlavními hormony v buňkách prostaty. Prostata 73, 605–613 (2013).
34. Sharp, A. a kol. Exprese sestřihové varianty-7 androgenního receptoru se objevuje s rezistencí na kastraci u rakoviny prostaty. J. Clin. Investovat. 129, 192–208 (2019).
35. Bakht, MK a kol. Neuroendokrinní diferenciace karcinomu prostaty vede k supresi PSMA. Endokr.-Relat. Rak 26, 131–146 (2018).
36. Ihlaseh-Catalano, SM a kol. Nadměrná exprese proteinu STEAP1 je nezávislým markerem biochemické recidivy u karcinomu prostaty. Histopathology 63, 678–685 (2013).
37. Gomes, IM a kol. Knockdown STEAP1 inhibuje buněčný růst a indukuje apoptózu v buňkách rakoviny prostaty LNCaP, čímž působí proti účinku androgenů. Med. Oncol. 35, 40 (2018).
38. Logan, AC a kol. Faktory ovlivňující titr a infekčnost lentivirových vektorů. Hučení. Gene Ther. 15, 976-988 (2004).
39. Morgan, RA, Gray, D., Lomová, A. & Kohn, DB Genová terapie hematopoetických kmenových buněk: pokrok a získané poznatky. Cell Stem Cell 21, 574–590 (2017).
40. Larson, SM a kol. Preklinický vývoj genové modifikace hematopoetických kmenových buněk s chimérickými antigenními receptory pro imunoterapii rakoviny. Hučení. Vaccin Immunother. 13, 1094–1104 (2017).
41. Salter, AI a kol. Fosfoproteomická analýza signalizace chimérického antigenního receptoru odhaluje kinetické a kvantitativní rozdíly, které ovlivňují buněčnou funkci. Sci. Signál. 11, eaat6753 (2018).
42. Majzner, RG a kol. Vyladění požadavku na hustotu antigenu pro aktivitu CAR T-buněk. Cancer Discov. 10, 702–723 (2020).
43. Challita-Eid, PM a kol. Monoklonální protilátky proti šesti transmembránovým epiteliálním antigenům prostaty-1 inhibují mezibuněčnou komunikaci in vitro a růst xenograftů lidských nádorů in vivo. Cancer Res. 67, 5798-5805 (2007).
44. Hudeček, M. a kol. Nesignální extracelulární spacer doména chimérických antigenních receptorů je rozhodující pro in vivo protinádorovou aktivitu. Cancer Immunol. Res. 3, 125–135 (2015).
45. Gomes, IM, Santos, CR & Maia, CJ Exprese STEAP1 a STEAP1B v buněčných liniích prostaty a domnělá regulace STEAP1 posttranskripčními a posttranslačními mechanismy. Genes Cancer 5, 142–151 (2014).
46. Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A. & Elofsson, A. TOPCONS: konsensus predikce topologie membránových proteinů. Nucleic Acids Res. 37, W465–W468 (2009).
47. Krogh, A., Larsson, B., Von Heijne, G. & Sonnhammer, EL Predikce transmembránové proteinové topologie se skrytým Markovovým modelem: aplikace na kompletní genomy. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
48. Long, AH a kol. 4-1Kostimulace BB zlepšuje vyčerpání T buněk vyvolané tonickou signalizací chimérických antigenních receptorů. Nat. Med. 21, 581–590 (2015).
49. Berger, C. a kol. Adoptivní přenos efektorových CD8+ T-buněk odvozených z centrálních paměťových buněk vytváří perzistentní T-buněčnou paměť u primátů. J. Clin. Vyšetřování. 118, 294-305 (2008).
50. Gattinoni, L. a kol. Podskupina lidských paměťových T buněk s vlastnostmi podobnými kmenovým buňkám. Nat. Med. 17, 1290–1297 (2011).
51. Xu, Y. a kol. Úzce příbuzné T-paměťové kmenové buňky korelují s in vivo expanzí CAR.CD19-T buňky jsou chráněny IL-7 a IL-15. Krev 123, 3750–3759 (2014).
52. Cieri, N. a kol. IL-7 a IL-15 instruují generování lidských paměťových kmenových T buněk z naivních prekurzorů. Krev 121, 573–584 (2013).
53. Hansel, DE a kol. Sdílená mutace genu TP53 u morfologicky a fenotypově odlišného souběžného primárního malobuněčného neuroendokrinního karcinomu a adenokarcinomu prostaty. Prostata 69, 603–609 (2009).
54. Cuzick, J. a kol. Prognostická hodnota podpisu exprese RNA odvozeného z genů proliferace buněčného cyklu u pacientů s rakovinou prostaty: retrospektivní studie. Lancet Oncol. 12, 245–255 (2011).
55. Chen, ME, Lin, SH, Chung, LW & Sikes, RA Izolace a charakterizace PAGE-1 a GAGE-7. Nové geny exprimované v modelu progrese karcinomu prostaty LNCaP, které sdílejí homologii s antigeny spojenými s melanomem. J. Biol. Chem. 273, 17618–17625 (1998).
56. Baley, PA, Yoshida, K., Qian, W., Sehgal, I. & Thompson, TC Progrese k androgenní necitlivosti v novém in vitro myším modelu rakoviny prostaty. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 52, 403-413 (1995).
57. Murad, JP a kol. Předběžná úprava modifikuje TME tak, aby se zvýšila účinnost CAR T buněk v solidním nádoru a endogenní ochranná imunita. Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther. 29, 2335–2349 (2021).
58. Brunda, MJ a kol. Protinádorová a antimetastatická aktivita interleukinu 12 proti myším nádorům. J. Exp. Med. 178, 1223-1230 (1993).