Abstraktní

Poruchy kožní hyperpigmentace, jako je melasma, pihy a pozánětlivá hyperpigmentace (PIH), jsou často spouštěny ultrafialovým-B (UVB) zářením, poraněním kůže a lokálním zánětem kůže. Nadměrné ukládání melaninu zhoršuje vzhled pokožky a negativně ovlivňuje psychickou pohodu pacienta. Konvenční depigmentační činidla, jako je hydrochinon, se primárně zaměřují na tyrosinázu s jednorežimovým účinkem a nesou dobře zdokumentovaná bezpečnostní rizika. Vícecílové přírodní botanické směsi se ukázaly jako slibné alternativy pro moderní funkční kosmetické přípravky.

Fenylethanoidové glykosidy (PhG) jsou typické bioaktivní složky izolované zCistanche deserticola, známá léčivá bylina ze suchých pouštních oblastí. Glabridin (Gla), prenylovaný isoflavan extrahovaný zGlycyrrhiza glabra, je široce uznávána jako vysoce účinná přírodní sloučenina pro rozjasnění pokožky. Tento výzkum systematicky zkoumal synergický anti-hyperpigmentační účinek PhGs v kombinaci s glabridinem. Pro předběžný screening poměru hmotnosti byly použity in-vitro biochemické testy zahrnující inhibici tyrosinázy, DPPH a ABTS⁺ testy vychytávání volných radikálů. Dále byly zkonstruovány tři buněčné modely: model pigmentace buněk myšího melanomu B16F10 ozářený UVB; model zánětu HaCaT keratinocytů stimulovaný lipopolysacharidem (LPS); Model oxidativního stresu HaCaT indukovaný AAPH. Byly kvantifikovány indikátory zahrnující intracelulární aktivitu tyrosinázy, obsah melaninu, uvolňování prozánětlivých cytokinů (IL‑6, TNF‑ ), aktivitu enzymů superoxiddismutázy (SOD) a katalázy (CAT). Výpočet kombinačního indexu (CI) byl implementován pro kvantitativní identifikaci synergické interakce mezi dvěma botanickými extrakty.

Mezi testovanými poměry vykazovaly hmotnostní poměry m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 a 10:1 výraznou synergii potlačující tyrosinázu a antioxidanty. Při celkové koncentraci 0,4 g/l ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) pH 6,8 dosáhly míry inhibice tyrosinázy 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1) a 88,06 % (10:1). Odpovídající procenta vychytávání radikálů DPPH byla 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %; Kapacity ABTS⁺ pohlcující kationty radikálů dosáhly 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %. Při pracovní koncentraci 25 ug/ml nevykazovaly všechny tři formulace sloučenin žádnou významnou cytotoxicitu vůči buněčným liniím B16F10 a HaCaT. Skupina se směsí 1:1 dosáhla vynikající komplexní účinnosti: reziduální intracelulární aktivita tyrosinázy klesla na 23,80 %, relativní obsah melaninu se snížil na 30,90 %. Navíc PhGs/Gla (1:1) vykazovaly nejsilnější supresi na sekreci IL‑6 a TNF‑ a maximálně obnovily aktivitu antioxidačních enzymů SOD a CAT. Experimentální výsledky potvrdily, že PhG spárované s glabridinem dosahují synergických anti-hyperpigmentačních výsledků prostřednictvím trojitých cest: inhibice biosyntézy melaninu, zmírnění zánětu kůže a působení proti oxidativnímu stresu. Hmotnostní poměr 1:1 poskytuje optimální integrovaný biologický výkon. Tato studie poskytuje experimentální důkazy podporující aplikaciCistanchefenylethanoidní glykosidy-glabridin kompozitní materiály ve vývoji čisté krásy, rostlinného původu pro bělení péče o pleť.

Klíčová slova: Cistanche deserticolafenylethanoidové glykosidy; glabridin; synergický efekt; anti-hyperpigmentace; antioxidant; protizánětlivé; kosmetické botanické suroviny

1. Úvod

Nadměrná akumulace melaninu v epidermálních vrstvách má za následek heterogenní fenotypy pigmentace kůže, včetně melasmatu, efelidů a pozánětlivé hyperpigmentace (PIH). UVB ultrafialové záření představuje primární environmentální spouštěč; kožní trauma a chronické lokální zánětlivé reakce dále zesilují pigmentové poruchy. Je dobře známo, že cross-talk mezi epidermálními keratinocyty a melanocyty dominuje progresi pigmentu. Po vnější stimulaci aktivované keratinocyty uvolňují reaktivní formy kyslíku (ROS) a prozánětlivé mediátory. Tyto signální molekuly difundují a působí na přilehlé melanocyty, upregulují katalytickou aktivitu tyrosinázy, urychlují syntézu melaninu a podporují transport melanosomu směrem ke keratinocytům a nakonec produkují viditelné pigmentové léze na povrchu kůže. V souladu s tím se účinná intervence pro hyperpigmentaci nemůže soustředit pouze na inhibici tyrosinázy. Multimodální terapeutické strategie by měly současně zahrnovat inhibici melanogeneze, protizánětlivou intervenci a neutralizaci oxidativního stresu.

Tradiční syntetické aktivní látky zesvětlující pokožku, jako je hydrochinon, poskytují depigmentační účinnost především přímou supresí tyrosinázy. Jednocílové mechanismy však omezují praktickou účinnost a dlouhodobá lokální aplikace hydrochinonu může vyvolat podráždění kůže, kontaktní dermatitidu a potenciální bezpečnostní rizika, což omezuje rozsah použití v kosmetické kvalitě. Přírodní biosložky rostlinného původu přitahují rostoucí zájem výrobců kosmetiky a spotřebitelů pro své mírné profily a vícecestné farmakologické účinky. Směsné směsi různých rostlinných extraktů jsou schopny produkovat synergické biologické účinky, zvyšující celkovou účinnost a zároveň snižují požadavky na účinné dávkování, což otevírá nové technické směry pro výzkum kosmetických surovin proti pigmentaci Google

Cistanche deserticola, běžně nazývaný "pouštní ženšen", je klasickou tonizující bylinkou v tradiční čínské medicíně. Moderní fytochemické výzkumy ukazují, že fenylethanoidní glykosidy (PhGs) tvoří jeho hlavní farmakologicky aktivní frakci, přičemž reprezentativními sloučeninami jsou echinakosid a akteosid. Publikovaný farmakologický výzkum prokazuje, že PhGs mají silnou antioxidační kapacitu, protizánětlivou biologickou aktivitu a mírný potenciál inhibovat tyrosinázy, což naznačuje perspektivní vyhlídky na použití v dermatologických materiálech pro péči o pleť. Glabridin je charakteristická isoflavonoidní sloučenina izolovaná zGlycyrrhiza glabrakořen, známý v kosmetickém průmyslu jako „bělící zlato“. Silně potlačuje melanogenezi a současně moduluje kožní zánětlivé kaskády. Z teoretického pohledu tradiční medicínyCistanchevyživuje ledvinovou esenci a tonizuje jang, zatímco kořeny lékořice tonizují slezinu a čistí tepelný toxin. Kombinované použití odpovídá principům kompatibility směsí bylinných dermatologických terapií.

Mechanistická hypotéza tvrdí, že kombinace PhGs-glabridin může regulovat pigmentaci kůže prostřednictvím vícecílových a vícecestných režimů: společná inhibice katalytické funkce tyrosinázy, aby se odřízl původ tvorby melaninu; zhášení nahromadění reaktivních druhů kyslíku; omezení nadměrného uvolňování prozánětlivých faktorů, aby se přerušila amplifikace signálu zprostředkovaná ROS a cytokiny pro aktivaci melanocytů. K dnešnímu dni jen málo výzkumných prací systematicky uvádělo synergické anti-hyperpigmentační hodnocení pro tuto binární směs.

Tento dokument si klade za cíl prozkoumat kombinované biologické účinky meziCistanchefenylethanoidové glykosidy a glabridin. Nejprve byly implementovány biochemické in vitro enzymové inhibiční a radikálové screeningové experimenty. Pro vícerozměrné hodnocení účinnosti byly zkonstruovány tři reprezentativní buněčné modely napodobující ukládání pigmentu, zánět kůže a oxidační poškození. Ke kvantifikaci synergických nebo antagonistických interakcí byla použita metodologie kombinačního indexu. Zaměřili jsme se na stanovení optimálního hmotnostního poměru sloučeniny, objasnění funkčních mechanismů s trojitým režimem a poskytnutí podpory experimentálních dat pro vývoj přírodních synergických kosmetických surovin pro rozjasnění pokožky.

2. Materiály a metody

2.1 Reagencie, buněčné kmeny a laboratorní přístroje

B16F10 myší melanomová buněčná linie (STCC20013G-1) byla zakoupena od Saierbio Co., Ltd. Zvěčněný lidský epidermální keratinocyt HaCaT (iCell-h066) byl získán od iCell Bioscience Inc.Cistanchefenylethanoidové glykosidy (PhGs) a glabridin (Gla) byly komerčně dodávány společností Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. Houbová tyrosináza, arbutin, L-tyrosin, L-DOPA, DPPH, diamonná sůl ABTS, kyselina L-askorbová, kyselina triaskorbová, XDMton C10, ostatní chemická činidla analytické kvality pocházela od běžných prodejců biochemických činidel. Spotřební materiál pro buněčné kultury zahrnoval médium DMEM s vysokým obsahem glukózy, fetální bovinní sérum, směsný roztok penicilin-streptomycin. Testovací soupravy ELISA zaměřené na lidský IL-6, TNF-, CAT a soupravy pro detekci celkového SOD byly získány od příslušných biotechnologických výrobců.

Klíčové laboratorní vybavení obsahovalo čtečku mikrodestiček Multiskan FC s plnou vlnovou délkou, inkubátor Heracell 371 CO₂ (Thermo Fisher); Ultrazvuková čistička KQ‑200VDB; vodní lázeň s konstantní teplotou; DHG-9246A tryskací pec; KN4006B UVB přístroj na ultrafialové ozařování s výstupním ozářením 8 mW/cm².

2.2 Příprava roztoku vzorku

Zásobní roztoky PhGs a glabridinu byly připraveny v pufru PBS o pH 6,8 nebo rozpouštědle 50 % (v/v) ethanol-voda, sériově zředěné na pracovní koncentrace: 0,001 g/L, 0,005 g/L, 0,025 g/L, 0,1 g/L, 0,4 g/l, 0,4 g/l, 0,8 g/l, 0,8 g/l. 2,0 g/l. Devět kompozitních skupin bylo nakonfigurováno na pevnou celkovou hmotnostní koncentraci 0,4 g/l s různými hmotnostními poměry m(PhGs):m(Gla)=40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40/1:20, 1:40/10, označeno jako PhsG/1Gla až Phs4Gla (1:40).

Pro testy buněčného experimentu byly práškové vzorky rozpuštěny v médiu DMEM bez séra, aby se připravily série roztoků pracovní koncentrace.

2.3 Biochemické in-vitro testy

2.3.1 Test inhibice tyrosinázy

50 μl roztoku vzorku, 50 μl pH 6,8 PBS a 50 μl 1 g/LL-tyrosinového substrátového roztoku bylo postupně přidáno do každé jamky na 96jamkové mikrodestičky. Předinkubace probíhala ve vodní lázni o teplotě 37 stupňů po dobu 10 minut. Následně bylo doplněno 50 ul 0,4 g/l roztoku houbové tyrosinázy (200 U/ml) a inkubace pokračovala při 37 stupních po dobu 10 minut. Arbutin fungoval jako pozitivní kontrolní látka, slepá kontrola přijala pH 6,8 PBS pufru. Hodnota absorbance byla měřena při vlnové délce 490 nm na čtečce mikrodestiček. Vzorec pro výpočet rychlosti inhibice tyrosinázy:

Míra inhibice tyrosinázy (%)={1 − [(A_reaction − A_reaction-control) / (A_blank − A_blank-control)]} × 100 %

Kde: A_reaction: absorbance obsahující vzorek, substrát, PBS a tyrosinázu; A_reaction-control: absorbance vzorku, substrátu a PBS bez enzymu; A_blank: absorbance substrátu, PBS a tyrosinázy; A_blank-control: absorbance pouze pro substrát a pufr PBS.

2.3.2 Stanovení DPPH Free-Radical-Scavenging

Prášek DPPH byl rozpuštěn v bezvodém ethanolu za účelem přípravy 0,2 mmol/l pracovní kapaliny DPPH. PhGs, glabridin a referenční látka vitaminu C byly rozpuštěny v 50% rozpouštědle ethanol-voda za vzniku zásobních roztoků s gradientem koncentrace. Vzorky binární směsi s devíti hmotnostními poměry byly rovnoměrně promíchány. Do každé jamky bylo přidáno 100 μl kapaliny vzorku plus 100 μl pracovního roztoku DPPH. Po důkladném promíchání byla mikrodestička udržována mimo světlo při teplotě okolí po dobu 30 minut. Odečet absorbance byl zaznamenán při λ = 517 nm. Vitamin C fungoval jako pozitivní kontrola, každá experimentální skupina se opakovala pro 3 biologické replikáty. Vzorec pro rychlost čištění DPPH:

Míra čištění DPPH (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A1: absorbance vzorku + pracovní kapalina DPPH; A₂: absorbance 50 % ethanolu + pracovní kapaliny DPPH; A3: absorbance roztoku vzorku smíchaného s rozpouštědlem 50 % ethanolu.

2.3.3 ABTS⁺ Kationt Radical-Scavenging Assay

7,4 mmol/l zásobního roztoku ABTS a 2,6 mmol/l roztoku persíranu draselného byly rovnoměrně smíchány, inkubovány v tmavém prostředí po dobu 12 hodin za vzniku stabilního pracovního činidla ABTS⁺. Roztoky vzorků byly konfigurovány podle protokolů popsaných v části 2.3.2. 40 μl roztoku vzorku a 160 μl pracovní kapaliny ABTS⁺ byly pipetovány do jamek mikrodestičky. Po inkubaci se stíněním po dobu 6 minut při teplotě místnosti byla měřena absorbance při 734 nm. Vzorec ABTS⁺ rychlosti vychytávání radikálů:

Míra úklidu ABTS⁺ (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A1: absorbance roztoku vzorku plus pracovního roztoku ABTS+; A2: absorbance deionizované vody smíchané s pracovním činidlem ABTS⁺; A₃: hodnota absorbance pro roztok vzorku smíchaný s rozpouštědlem z čisté deionizované vody.

2.4 Postupy buněčné kultury

Buňky melanomu B16F10 a keratinocyty HaCaT byly kultivovány v médiu DMEM s vysokým obsahem glukózy doplněné 10 % fetálního-bovinního séra a 1 % penicilin-streptomycinu. Parametry inkubátoru: 37 stupňů, 5 % objemový podíl CO₂, relativní vlhkost 70 %. Pasáž buněk a osvěžení média byly prováděny podle hustoty buněčného růstu pozorované pod inverzním optickým mikroskopem. Buňky ve fázi logaritmického růstu byly shromážděny pro následné naočkování na 96jamkové kultivační destičky.

2.5 Vytvoření tří buněčných funkčních modelů

2.5.1 UVB-indukovaný model pigmentace B16F10

Po 1 hodině předběžného ošetření odpovídajícím vzorkovým médiem byl povrch buněčné vrstvy pokryt PBS pufrem. Intenzita UVB záření byla nastavena na 8 mW/cm², vzdálenost ozařování 3 cm, doba ozáření 110 s. Normální skupina dostala stejné médium bez zásahu UVB zářením. Modelová kontrolní skupina obdržela předléčení PBS následované expozicí stejnou dávkou UVB bez doplnění vzorku.

2.5.2 Model zánětlivé aktivace HaCaT zprostředkovaný LPS

Buňky HaCaT byly preinkubovány s testovacím médiem DMEM po dobu 24 hodin. Poté byl doplněn roztok lipopolysacharidu LPS do konečné koncentrace 20 ug/ml a kokultivace trvala dalších 24 hodin. Buňky modelové skupiny byly stimulovány LPS bez předběžného ošetření vzorku. Normální skupina udržovala běžnou kompletní střední kultivaci.

2.5.3 Model oxidativního stresu HaCaT spouštěný AAPH

Buňky byly předinkubovány po dobu 24 hodin. Do kultivačního média bylo přidáno činidlo AAPH, konečná koncentrace 25 mmol/l, inkubace pokračovala 24 hodin. Model-kontrolní skupina byla stimulována pomocí AAPH bez zásahu do vzorku. Normální kontrolní skupina rostla za normálních středních podmínek.

Všechny skupiny buněčných modelů obsahovaly tři technické replikační jamky.

2.6 Test cytotoxicity (metoda CCK‑8)

Buněčná suspenze byla upravena na hustotu 1 x 104 buněk/ml a naočkována na 96-jamkové mikrodestičky. Po přilnutí buněk bylo podáno vzorkové médium s gradientovou koncentrací a inkubace pokračovala po dobu 24 hodin, 48 hodin, 72 hodin. CCK‑8 detekční činidlo smíchané s čerstvým médiem DMEM (objemová frakce 10 %) nahradilo staré médium, inkubace probíhala 60 min. Čtečka mikrotitračních destiček měřila absorbanci při vlnové délce 450 nm. Vzorec pro výpočet relativního procenta životaschopnosti buněk:

Životaschopnost buněk (%)=[(A_vzorek − A_blank) / (A_0 − A_blank)] × 100 %

A_vzorek: absorbance buněk obsahujících jamku, činidlo CCK‑8 a médium pro vzorek; A_blank: absorbance pro kultivační médium plus CCK‑8 bez nasazených buněk; A_0: absorbance buněk a činidla CCK‑8 kultivovaných se slepým médiem (žádné testovací vzorky).

2.7 Kvantifikace aktivity intracelulární tyrosinázy

Po 48 hodinách zpracování modelu byl buněčný supernatant odstraněn. Buněčná monovrstva byla dvakrát promyta pH 7,4 PBS. 50 μl 1% lyzačního roztoku Triton X‑100 na jamku. Mikrotitrační destička byla zmražena při teplotě -80 stupňů v lednici po dobu 30 minut, poté byla rozmražena při pokojové teplotě, aby došlo k úplnému protržení buněčné membrány. Předehřívací ošetření na 37 stupňů trvalo 5 minut. Substrát L‑DOPA (10 mmol/l, 10 μl) byl doplněn. Mikrotitrační destička byla inkubována po dobu 1 hodiny v CO2 inkubátoru. Absorbance byla detekována při 475 nm pro výpočet relativní intracelulární tyrosinázové aktivity.

2.8 Měření intracelulárního obsahu melaninu

Pro detekci obsahu melaninu byla použita metoda štěpení NaOH. Po zásahu modelu po 72 hodinách byl supernatant kultury odstraněn, buňky byly dvakrát promyty pomocí pufru PBS. 100 μL 1 mol/l vodného roztoku NaOH obsahujícího 10 % DMSO. Mikrotitrační destička byla inkubována v 90stupňové sušárně po dobu 60 minut pro úplné rozpuštění melaninu. Absorbance byla odečtena při 490 nm pro výpočet relativního procenta obsahu melaninu.

2.9 Detekce indikátorů zánětlivého faktoru a antioxidačních enzymů

Po 48 hodinách zpracování modelu byly buňky HaCaT seškrábány a shromážděny, centrifugovány, aby se sklidil buněčný supernatant. Pro kvantitativní stanovení koncentrací prozánětlivých cytokinů IL-6 a TNF- byly použity komerční soupravy ELISA. Pro antioxidačně-enzymové testování byly buněčné pelety podrobeny opakovaným cyklům zmrazování a rozmrazování, aby se dosáhlo fragmentace buněk. Podmínky centrifugace: 12 000 ot./min., 4 stupně, 10 min. Frakce supernatantu byla shromážděna za účelem testování vitality SOD a obsahu enzymu CAT podle provozních specifikací soupravy.

2.10 Analýza kombinačního indexu (CI).

Algoritmus kombinace indexu Chou-Talalay (CI) byl implementován k posouzení synergické/aditivní/antagonistické interakce mezi PhG a glabridinem v rámci testů inhibice tyrosinázy a antioxidantů:

CI=D₁/DX₁ + D₂/DX₂

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >1 představuje antagonistickou interakci; CI ≈ 1 znamená aditivní účinek; CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Statistická analýza

Výsledky experimentálního měření byly vyjádřeny jako střední hodnota ± standardní odchylka (průměr ± SD). Software GraphPad Prism 9.5.0 provedl statistické výpočty. Pro víceskupinové srovnání byla použita jednocestná analýza rozptylu (ANOVA). P-hodnota< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Výsledky a diskuse

3.1 In-vitro účinnost inhibice tyrosinázy u PhGs, glabridinu a vzorků binárních směsí

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhGs.

Při celkové koncentraci 0,4 g/l pro roztok sloučeniny PBS poskytly PhGs/Gla (10:1), PhGs/Gla (5:1), PhGs/Gla (1:1) míru inhibice tyrosinázy 88,06 %, 92,93 %, 94,37 %. Poměry 5:1 i 1:1 překonaly účinnost inhibice jednosložkových PhGs (36,92 %) a jednosložkového glabridinu (92,71 %) při odpovídající celkové hmotnostní koncentraci. Skupina 1:1 dosáhla velikosti inhibice srovnatelné s pozitivní kontrolou arbutinem. Podle výsledků výpočtu hodnoty CI: m(PhGs):m(Gla) v rozsahu od 40:1 do 1:1 generovaný CI< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, projevující se antagonistickou interakcí.

Fenolové hydroxylové skupiny tvoří hlavní funkční skupinu pro inhibiční kapacitu tyrosinázy. PhG obsahují ortho-dihydroxyfenylové strukturní fragmenty schopné chelatovat ionty mědi v katalyticky aktivní kapse tyrosinázy, čímž kompetitivně brání vazbě substrát-enzym. Izoflavanový skelet glabridinu nese na svém B-kruhu 2‑OH a 4‑OH skupiny, strukturně analogické s L‑tyrosinem / L‑DOPA aromatickým hydroxylem substituovaným kruhem, což umožňuje konkurenční obsazení domény aktivního místa enzymu. Po smíchání směsi se zvyšuje kumulativní množství fenolických hydroxylů; mezitím se dvě molekuly mohou připojit k odlišným vazebným místům tyrosinázového proteinu, což společně zesiluje inhibiční účinnost.

3.2 Antioxidační aktivita testovaných vzorků pohlcující radikály

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridin. PhG se hojně vyskytují v caffeoylových skupinách a 3,4-dihydroxyfenylethanolových skupinách, přičemž systémy konjugovaných dvojných vazeb posilují účinnost neutralizace volných radikálů. Glabridinový flavonoidový rámec také dodává hydroxylové skupiny a rozšířenou architekturu konjugovaných kruhů pro stabilizaci nepárových elektronů z reaktivních kyslíkových druhů.

Tři slibné skupiny sloučenin PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) vykazovaly vynikající účinnost při odstraňování DPPH- a ABTS⁺. Míra vychytávání ABTS⁺ dosáhla téměř 100 %, což ukazuje na téměř úplnou eliminaci volných kationtů. Různé hmotnostní poměry vytvářejí různé stavy molekulární interakce mezi dvěma molekulami, což vede k rozdílům ve stavu expozice hydroxylovým skupinám a vede k divergenci synergické velikosti antioxidantů.

3.3 Hodnocení cytotoxicity PhGs, glabridinu a směsných přípravků

Testování cytotoxicity CCK‑8 prokázalo, že PhG v koncentračním rozsahu 62,5 ~ 500 ug/ml a glabridin 6,25 ~ 25 ug/ml nespustily zjevnou redukci životaschopnosti pro buněčné linie B16F10 a HaCaT. Za podmínek celkové hmotnostní koncentrace 25 ug/ml si tři skupiny s poměrem sloučenin PhGs/Gla (1:1, 5:1, 10:1) udržely vysokou životaschopnost buněk a nevykazovaly žádný detekovatelný cytotoxický účinek proti oběma buněčným kmenům. Následně byla zvolena 25 ug/ml jako bezpečná pracovní koncentrace pro následné hodnocení buněčné funkce. Pro skupiny s jedním léčivem byly PhG nízké/střední/vysoké dávky definovány jako 125 ug/ml, 250 ug/ml, 500 ug/ml; glabridin nízké/střední/vysoké dávky: 6,25 ug/ml, 12,5 ug/ml, 25 ug/ml.

3.4 Vliv na intracelulární aktivitu tyrosinázy a obsah melaninu v buňkách B16F10 stimulovaných UVB

Po ošetření UVB zářením vykazovala modelová skupina B16F10 statisticky významné zvýšení aktivity intracelulární tyrozinázy a akumulace melaninu (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

Při jednotné celkové koncentraci 25 ug/ml vykazovaly skupiny sloučenin lepší biologické výsledky ve srovnání s jednosložkovými protějšky. Mezi třemi poměry PhGs/Gla (1:1) poskytl optimální účinek: zbytková intracelulární aktivita tyrosinázy pouze 23,80 %, relativní obsah melaninu klesl na 30,90 %. Statistické srovnání odhalilo významný rozdíl ve srovnání se skupinami sloučenin 5:1 a 10:1. Poměr 1:1 vykazoval výraznou synergickou amplifikaci pro omezení biosyntézy melaninu uvnitř buněk melanocytů.

UVB záření vyvolává melanogenní signální kaskádu vlastní melanocytům, zvyšuje expresi transkripčního faktoru MITF a dále indukuje nadměrnou expresi tyrosinázového proteinu. Výsledky našich buněčných experimentů potvrdily, že PhG v kombinaci s glabridinem mohou účinně zvrátit aktivaci tyrosinázy indukovanou UVB a snížit tvorbu melaninu.

3.5 Protizánětlivý účinek na keratinocyty HaCaT napadené LPS

Stimulace LPS silně zvýšila sekreci prozánětlivých cytokinů IL-6 a TNF- v modelové skupině HaCaT (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhGs/Gla (10:1). Formulace 1:1 generovala maximální snížení uvolňování IL-6 a TNF-, převyšující inhibiční účinek získaný oddělenou aplikací PhG nebo glabridinu.

Vysvětlení molekulárního mechanismu: PhGs fenol-hydroxylová část vychytává volné radikály spouštějící zánět; navíc PhGs mohou interferovat s intracelulárními signálními kaskádami NF‑κB a MAPK, aby omezily transkripci prozánětlivých genů. Glabridin inhibuje fosforylaci stresem aktivované kinázy JNK a p38, čímž blokuje downstream transdukci zánětlivého signálu. Jedna látka může pouze částečně potlačit aktivaci zánětlivých signálních drah. Binární kombinace současně zasahuje do více uzlů v rámci zánětlivé signalizační sítě a dosahuje synergického protizánětlivého účinku.

Kožní zánět slouží jako kritický faktor upstream pro výskyt PIH. Zánětlivé cytokiny vylučované keratinocyty působí jako parakrinní signalizační poslové, stimulují sousední melanocyty k urychlení produkce melaninu a přenosu melanosomu. Účinné zmírnění epidermálního zánětu je nezbytné pro prevenci a zlepšení hyperpigmentačních lézí. Proto protizánětlivá výhoda sloučeniny PhGs-glabridin poskytuje další hodnotu pro aplikaci kosmetického materiálu proti pigmentaci.

3.6 Antioxidačně-enzymově regulační kapacita za podmínek oxidačního stresu vyvolaného AAPH

Skupina modelu oxidativního stresu AAPH prokázala zřejmý pokles intracelulární SOD a CAT antioxidačně-enzymové vitality (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

Kůže vystavená ultrafialovému záření vytváří velké množství reaktivních druhů kyslíku. Přebytek ROS nejen přímo oxiduje biomolekuly související se syntézou melaninu, ale také aktivuje více melanogenních signálních drah. Endogenní antioxidačně-enzymový systém (SOD, CAT) tvoří hlavní obrannou bariéru pro eliminaci intracelulárního ROS. Když oxidační stres přemůže vnitřní antioxidační kapacitu, akumulace ROS urychluje progresi pigmentace. PhGs-glabridin sloučenina nejen přímo vychytává volné radikály prostřednictvím fenolicko-hydroxylové chemické reakce, ale také opravuje funkci buněčného antioxidačně-enzymového systému a zmírňuje poškození oxidativním stresem ze dvou dimenzí. Různé hmotnostní poměry mění vzorec molekulární interakce mezi dvěma přirozenými molekulami, což vede k nesrovnalostem v konečné antioxidační regulační účinnosti.

3.7 Diskuse o komplexním mechanismu pro synergickou anti-hyperpigmentaci

Patologický proces hyperpigmentace kůže tvoří komplexní signální síť: UVB záření působí jak na melanocyty, tak na okolní keratinocyty. Keratinocyty uvolňují ROS a prozánětlivé cytokiny. Tyto biosignály dále aktivují melanocyty, upregulují aktivitu tyrosinázy, zesilují biosyntézu melaninu a usnadňují transport melanosomu směrem k epidermálním keratinocytům, což nakonec vede k viditelnému usazování pigmentu na povrchu kůže. Jednocílová inhibice tyrozinázy tedy nemůže plně zvrátit patologickou pigmentaci. Vícecestná intervenční strategie by měla zahrnovat inhibici melanogeneze, protizánětlivou a antioxidační ochranu.

Naše experimentální výsledky ukázaly, že PhG v kombinaci s glabridinem realizují multimodální intervenci proti hyperpigmentaci:

Přímo potlačit katalytickou aktivitu tyrosinázy uvnitř melanocytů, aby se inhiboval zdroj biosyntézy melaninu;

Inhibovat nadměrnou sekreci prozánětlivých cytokinů z keratinocytů a odříznout parakrinní zánětlivý stimulační signál směrem k melanocytům;

Odstraňte přebytek reaktivních druhů kyslíku a obnovte endogenní aktivitu antioxidačních enzymů SOD/CAT, čímž zmírníte amplifikaci pigmentu zprostředkovanou oxidačním stresem.

Poměr m(PhGs):m(Gla) = 1:1 vykazoval optimální komplexní synergický výkon napříč biochemickou inhibicí enzymů, vychytáváním radikálů, modelem pigmentu melanocytů, modelem zánětu keratinocytů a modelem oxidativního stresu. Tento poměr překonal skupiny 5:1 a 10:1 téměř ve všech testovacích ukazatelích. Synergie může pocházet z komplementárních molekulárně-strukturních charakteristik: PhGs a glabridin mají odlišné fenolické kostry, interagující s různými cílovými proteiny (tyrosináza, zánětlivé signalizační kinázy, dráhy související s antioxidačními enzymy). Po smíchání směsi je stav expozice fenolických hydroxylů optimalizován prostřednictvím intermolekulární interakce, která zvyšuje celkovou biologickou aktivitu.

Z praktického hlediska kosmetického průmyslu přinášejí synergické rostlinné složené suroviny dvě hlavní výhody. Za prvé, synergický efekt umožňuje snížení požadované dávky pro každou jednotlivou aktivní složku, čímž se snižují náklady na formulaci; za druhé, vícecestný funkční profil odpovídá komplexnímu patologickému mechanismu klinicky pozorované hyperpigmentace kůže, jako je PIH a melasma, a nabízí teoretický základ pro vývoj vysoce účinných přírodních kosmetických přípravků pro rozjasnění pokožky.

4. Závěr

Tento výzkum systematicky hodnotil synergickou anti-hyperpigmentační bioaktivituPochází z Cistanche deserticolafenylethanoidové glykosidy (PhGs) kombinované s glabridinem (Gla). Biochemický screening in vitro a tři reprezentativní buněčné modely byly použity pro vícerozměrnou charakterizaci účinnosti. Hlavní experimentální závěry jsou shrnuty takto:

V rámci in-vitro biochemických testů na inhibici tyrosinázy a vychytávání volných radikálů vykazovaly formulace sloučenin m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 příznivou inhibiční účinnost a synergickou interakci. Při celkové koncentraci 0,4 g/l v pH 6,8 PBS dosáhly míry inhibice tyrosinázy 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1), 88,06 % (10:1). Míra vychytávání DPPH radikálů: 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. ABTS⁺-radikál-scavenging-rates: 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %.

Při bezpečné pracovní koncentraci 25 ug/ml nevykazovaly roztoky DMEM PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) žádnou cytotoxicitu vůči buňkám melanomu B16F10 a lidským keratinocytům HaCaT. Mezi těmito skupinami dosáhly PhGs/Gla (1:1) nejlepší integrované účinnosti: intracelulární aktivita tyrosinázy se snížila na 23,80 %, obsah melaninu se snížil na 30,90 %. Vytvářel nejsilnější inhibici uvolňování IL-6, TNF- zánětlivých-cytokinů a maximální obnovu SOD a vitality antioxidačních enzymů CAT. Skupina s hmotnostním poměrem 1:1 vykazovala zřejmý efekt synergického zesílení lepší než skupiny s jedním činidlem a jiné skupiny s poměrem sloučenin.

Binární směs PhGs a glabridinu působí proti hyperpigmentaci pokožky prostřednictvím trojitých cest: potlačuje biosyntézu melaninu, zmírňuje epidermální zánět a působí proti poškození oxidativním stresem. Optimální synergický hmotnostní poměr m(PhGs):m(Gla) = 1:1. Tato studie poskytuje experimentální důkazy a technickou podporu pro vývoj přírodních multifunkčních kosmetických surovin rostlinného původu pro rozjasnění pleti a aplikace proti pigmentaci.

Poděkování

Tato práce byla finančně podpořena National Natural Science Foundation of China (Grant č. . 82160772). Děkujeme Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Research za podporu experimentální platformy.

Reference

[1] Nautiyal A, Wairkar S. Management hyperpigmentace: Současná léčba a nově se objevující terapie[J]. Pigment Cell & Melanoma Research, 2021, 34(6):1000-1014.

[2] Yardman‑Frank J M, Fisher D E. Pigmentace kůže a její kontrola: Od ultrafialového záření ke kmenovým buňkám[J]. Experimentální dermatologie, 2021, 30(4):560‑571.

[3] Neagu N, Conforti C, Agozzino M, et al. Léčba melasmy: Systematický přehled[J]. Journal of Dermatological Treatment, 2022, 33(4):1816‑1837.

[4] Hossain MR, Ansary TM, Komine M, et al. Různorodé stimuly indukované zánětlivé dráhy způsobují pigmentaci kůže[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(8):3970.

[5] Song X, Ni M T, Zhang Y a kol. Porovnání inhibičních schopností epigalokatechin‑3‑galátu a galokatechin galátu proti tyrosináze a jejich kombinovaných účinků s kyselinou kojovou[J]. Food Chemistry, 2021, 349(1):129172.

[6] Zolghadri S, Beygi M, Mohammad TF a kol. Cílení na tyrosinázu u hyperpigmentace: Současný stav, omezení a budoucí sliby[J]. Biochemická farmakologie, 2023, 212:115574.

[7] Cicero AL, Delevoe C, Gilles-Marsens F, et al. Exozomy uvolněné keratinocyty modulují pigmentaci melanocytů[J]. Nature Communications, 2015, 6:7506.

[8] Serre C, Busuttil V, Botto J M. Vnitřní a vnější regulace melanogeneze a pigmentace lidské kůže[J]. International Journal of Cosmetic Science, 2018, 40(4):328‑347.

[9] Irfan M, Shafeeq A, Siddiqui U, et al. Mechanistický přístup pro hodnocení toxicity a rizik těžkých kovů, hydrochinonu a mikroorganismů v kosmetických krémech[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 433:128806.

[10] Zheng Y, Du XS, Zhang L a kol. Hydrochinonem indukované kožní dráždivé reakce lze dosáhnout aktivací žírných buněk prostřednictvím receptoru X2[J] spřaženého s G proteinem. Experimentální dermatologie, 2023, 32(4):436‑446.

[11] Meng H, Liu X K, Li J R a kol. Bibliometrická analýza účinků ženšenu na kůži[J]. Journal of Cosmetic Dermatology, 2022, 21(1):99‑107.

[12] Liu F, Qu L K, Li H, a kol. Pokroky v biomedicínských funkcích přírodních bělicích látek při léčbě onemocnění pigmentace kůže[J]. Pharmaceutics, 2022, 14(11):2308.

[13] Wang T T, Zhang D, Wang Y J a kol. Synergická péče o pleť s polyfenoly Lonicera japonica a etanolovým extraktem z Vaccinium vitis‑idaea L.[J]. Fine Chemicals, 2023, 40(3):627-637.

[14] Wu Y, Liu Q, Tang W, a kol. Aplikace komplexů těkavého oleje Salvia miltiorrhiza a extraktu z pampelišky v kosmetice[J]. Fine Chemicals, 2022, 39(3):562-568.

[15] Chen J R, Zhu X Y, Cui H Y, a kol. Analýza variací aktivních složek a antioxidačních aktivit Cistanche deserticola z různých plemen a částí v provincii Xinjiang[J]. Food Industry Science and Technology, 2024, 45(21):227‑233.

[16] Xiao LY, Yao J, Miao Y Y, et al. Tubulosid B, izolovaný z Cistanche tubulosa, slibný prostředek proti aktivaci makrofágů M1 prostřednictvím synergického cílení na Mob1 a ERK1/2[J]. Biomedicína a farmakoterapie, 2022, 153:113414.

[17] Xu H H. Studie fenylethanoidních glykosidů Herba cistanches transdermální podávání a inhibiční účinky na syntézu melaninu u pigmentace vyvolané B u hnědého morčete[D]. Urumqi: Lékařská univerzita v Xinjiang, 2020.

[18] Huang J, Xie C, Pan Z. Synergické bělení, antioxidační a protizánětlivé aktivity glabridinu, resveratrolu a poldatinového komplexu[J]. Kosmetika s příchutí, 2024 (3): 99–107 233.

[19] Wang S Q, Zhu Y Z, Zheng X B. Studium a aplikace metody Chou-Talalay pro protinádorovou kombinaci léčiv[J]. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2013, 30(4):449‑453.

[20] Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Činidla pro bělení kůže: perspektiva inhibitorů tyrosinázy z lékařské chemie[J]. Journal of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry, 2017, 32(1):403‑425