Studie o ochranném účinku celkových glykosidů Cistanche Deserticola na poškození primárních kultivovaných myších hepatocytů alkoholem
Mar 10, 2023
Objektivní: Studovat ochranný účinek celkových glykosidů Cistanche deserticola na primárně kultivované hepatocyty. Metody: Primární hepatocyty byly odebrány perfuzní metodou in situ a metodou MTT byl hodnocen účinek celkových glykosidů Cistanche deserticola na přežití primárně kultivovaných hepatocytů poraněných alkoholem; Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na morfologii primárně kultivovaných hepatocytů a jader poškozených alkoholem byl hodnocen fluorescenční mikroskopií; Průtokovou cytometrií byl detekován vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na apoptózu primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem; Imunocytochemické barvení bylo použito k detekci účinku celkových glykosidů Cistanche deserticola na expresi bcl-2 a c-fos. Výsledky: Po poranění alkoholem se míra přežití primárních hepatocytů snížila a byly patrné změny v apoptóze a nekróze. Exprese genu inhibujícího apoptózu bcl-2 se snížila a exprese genu podporujícího apoptózu c-fos se zvýšila. Celkové glykosidy Cistanche deserticola mohou významně zlepšit míru přežití buněk, zlepšit apoptózu a nekrózu, zvýšit expresi bcl-2 a inhibovat expresi c-fos. Účinek byl závislý na dávce. Závěr: Glykosidy Cistanche deserticola mohou chránit primárně kultivované hepatocyty zvýšením exprese genu inhibujícího apoptózu bcl-2, snížením exprese genu podporujícího apoptózu c-fos, snížením apoptózy a nekrózy a zvýšením míry přežití buněk.
Klíčová slovacelkové glykosidycistanche deserticola; primární kultura; hepatocyt; Alkoholické poškození jater; Apoptóza
Cistanche prášek
V posledních letech se se zlepšováním životní úrovně lidí rapidně zvyšuje spotřeba alkoholu doprovázená nárůstem různých nemocí souvisejících s alkoholem a jedním z důležitých problémů je alkoholické poškození jater. Studie ukázaly, že Cistanche deserticola má ochranné účinky na posílení imunitní funkce, proti stárnutí, proti radiaci, proti oxidaci, proti peroxidaci lipidů a na poškození jater vyvolané alkoholem [1]. Glykosidy jsou hlavními účinnými látkami Cistanche deserticola.V předchozích experimentech bylo experimenty na zvířatech ověřeno, že celkové glykosidy oCistanche deserticola mamůže snižovat produkci volných radikálů, zvyšovat schopnost vychytávání volných radikálů a jejich metabolitů, čímž inhibuje peroxidaci lipidů, a hraje ochrannou roli při poškození jater vyvolaném alkoholem[2]. Tento experiment bude zkoumat ochranný účinek celkových glykosidů Cistanche deserticola na alkoholické poškození jater na buněčné úrovni prostřednictvím primární kultury hepatocytů.
1 Materiál a metody
1.1 Činidlo a přístrojCelkové glykosidy zCistanche deserticola, tmavě hnědý prášek, poskytovaný Farmaceutickou fakultou Univerzity Lanzhou, obsahuje 88,6 procent celkových glykosidů fenylethanolu. Rozpusťte v dvakrát destilované vodě a zřeďte kultivační roztok na požadovanou koncentraci. Enzymový marker (Beckman Coulter AD340), fluorescenční mikroskop (Olympus, BX51), invertovaný fázový kontrastní mikroskop (Leica DMI3000B), průtoková cytometrie (Beckman colter cell, CellLabQuanta SC) atd.
Klikněte zde pro zobrazení Cistanche deserticolachránit játraprodukty
【Požádat o víc】 Email: xue122522@foxmail.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1.2 Primární hepatocyty byly izolovány a kultivovány perfuzní metodou in situ [3].
Jedna myš Kunming byla anestetizována {{0}},5% pentobarbitalem 0,5ml intraperitoneální injekcí. Po rutinní dezinfekci kůže otevřete břicho, posuňte gastrointestinální trakt doleva, obnažte portální žílu, opatrně propíchněte infuzní jehlu infuzního zařízení ze vzdáleného konce portální žíly a podvázejte ji a zafixujte. Otočte průtok infuzní soupravy na maximum (asi 4 ml/min) a kápněte preperfuzní roztok bez vápníku předehřátý na 37 stupňů. Když jsou játra oteklá, rychle odřízněte distální konec dolní duté žíly a přerušovaně stlačujte proximální konec dolní duté žíly tak, aby se játra střídavě stahovala a roztahovala. Když je zbytková krev vymyta a játra jsou rovnoměrně žlutá a bílá, použije se teplý perfuzní roztok 0,05 procenta kolagenázy (Sigma) pro perfuzi trávení. Trávení se zastaví, když játra změknou a nepruží, pod jaterním pouzdrem se objeví malé vakuoly nebo dokonce praskliny v jaterní tkáni. Pečlivě disociujte játra, přeneste je na sterilní misku obsahující správné množství kultivačního média DMEM s vysokým obsahem cukru (Sigma), odloupněte jaterní obal a jemně jej protřepejte, poté rozsypte hepatocyty v kultivačním médiu, shromážděte je do kužele zkumavku, protřepejte a kultivujte po dobu 10 minut (frekvence vibrací je 100krát/min), odstřeďte 3 minuty (4 stupně, 1000 ot./min) a odstraňte supernatant. Buňky byly suspendovány v kultivačním médiu, přefiltrovány přes nylonovou síť 200 mesh a filtrát byl opakovaně třikrát centrifugován (4 stupně, 1000 ot./min.), aby se získaly buňky jaterního parenchymu. Upravte koncentraci buněk na 5 x Po 106 buňkách/ml je naočkujte do 25ml kultivační baňky předem ošetřené kolagenem z krysího ocasu a poté je inkubujte v inkubátoru při 37 stupních, 5% CO2. Po 24 hodinách vyměňte roztok, zlikvidujte neadherentní buňky a pokračujte v kultivaci pro použití v následujících experimentech.
1.3 Stanovení růstové křivky primárně kultivovaných myších hepatocytů
Upravte purifikované hepatocyty na 5 x 1{9}}6 buněk/ml bylo naočkováno na 24-jamkovou destičku a do každé jamky byl naočkován 1 ml buněčné suspenze. Celkem bylo naočkováno 21 jamek a kultivační médium DMEM s vysokým obsahem cukru obsahující 10 procent fetálního bovinního séra (Sigma) bylo kultivováno po dobu 7 dnů. Vezměte 3 náhodně každý den, strávte a vyfoukněte 0,25 procenta trypsinu rovnoměrně, počítejte na počítací desce a nakreslete křivku růstu
1.4 Vytvoření modelu alkoholického poškození hepatocytů.
Logaritmické hepatocyty získané výše uvedeným způsobem byly naočkovány do {{0}}jamkové destičky předem ošetřené kolagenem z potkaního ocasu a 100 buněk bylo naočkováno do každé jamky μ 50. DMEM kultivační médium 10% fetálního hovězího séra byl kultivován po dobu 24 hodin a poté měněn na dalších 24 hodin. Byla vytvořena slepá skupina a bylo vytvořeno pět alkoholových intervenčních skupin (50, 75, 100, 125, 150 mmol/l) a každá skupina měla pět reperforací. Poté, co byly hepatocyty kultivovány s různými koncentracemi alkoholu po dobu 24 hodin, bylo do každé jamky přidáno 0,5 procenta MTT (Sigma) 20 μ 50. Pokračujte v kultivaci po dobu 4 hodin, odstraňte supernatant a do každé jamky μ 50 přidejte DMSO150. třepacím stolem a míchejte 15 minut, změřte hodnotu absorbance při 570 nm a vypočítejte míru přežití buněk. Hodnota míry přežití buněk u podávané skupiny/kontrolní skupiny × 100 procent
1.5 Vliv celkových glykosidů cistanche deserticola na míru přežití primárně kultivovaných hepatocytů
Zranění alkoholem Naočkujte hepatocyty získané výše uvedenými metodami na {{0}}jamkovou destičku předem ošetřenou kolagenem z potkaního ocasu a naočkujte každou jamku 100 μ 50. DMEM kultivační médium 10% fetálního bovinního séra bylo kultivováno po dobu 24 hodin a poté vyměněno. Po dalších 24 hodinách byly do skupiny, které byla podávána, přidány GC s konečnou koncentrací 0,2, 0,4 a 0,8 g/l. Modelová skupina ethanolu a slepá skupina pokračovaly v kultivaci bez přidání léků a každá skupina byla nastavena s pěti více jamkami. Po 24 hodinách byl modelové skupině a intervenční skupině GC přidán alkohol s konečnou koncentrací 100 mmol/l. Po 12 hodinách kultivace byla měřena míra přežití buněk metodou MTT.
1.6 Vliv celkových glykosidů cistanche deserticola na morfologii primárně kultivovaných hepatocytů a jader poškozených alkoholem
Předsterilizované krycí sklo vložte do 6-jamkové destičky s inokulační koncentrací 5 × 106 buněk/ml buněčné suspenze, modelová skupina, skupina Cistanche deserticola（0.2 , 0.4, {{20}}.8 g/L) a prázdnou skupinu. Po 24 hodinách kultivace přidejte 100 mmol/l alkoholu s konečnou koncentrací. Po 24 hodinách kultivace vyjměte 95% ethanol ze sklíčka a fixujte je po dobu 15 minut. PBS se dvakrát promyje a poté se znovu disperguje v PBS. Upravte koncentraci buněk na 5 × 104 buněk/ml, přidejte 10 μl směsi akridinové oranže a ethylidenbromidu (Sigma) (0,01 μG/ml roztoku akridinové pomeranče, 0,02 μG/ml roztoku prometazinu, poměr objemů směsi: 1/ 1), inkubováno po dobu 30 minut, pozorováno a fotografováno pod fluorescenčním mikroskopem.
1.7 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na apoptózu primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem
Upravte hustotu štěpené buněčné suspenze na 5 × 1{4}}6 buněk/ml, naočkujte do šestijamkové destičky a kultivujte po dobu 24 hodin, sestavte modelovou skupinu, skupinu cistanche deserticola (0.2 , 0.4, 0,8 g/l) a prázdná skupina. Po 24 hodinách kultivace přidejte alkohol s konečnou koncentrací 100 mmol/l, inkubujte 24 hodin, štěpte a sbírejte buňky, dvakrát je promyjte PBS, fixujte je při 4 stupních přes noc pomocí 70 procent předchlazeného ethanolu, promyjte je PBS roztoku dvakrát, přidejte RNA enzym (Sigma), PI (100 μ G/ml) (Sigma) a vložte do 37 stupňové vodní lázně na 30 minut. Rychlost apoptózy byla měřena průtokovou cytometrií.
1.8 Celkové glykosidy Cistanche deserticola mohou inhibovat apoptózu primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem, bcl-2 a proapoptotickým genem c-fos
Účinek exprese fos byl vzat ze tří šestijamkových kultivačních destiček, z nichž každá byla skupinou tří jamek. Byla vytvořena modelová skupina, skupina Cistanche deserticola (0.2, 0.4, 0.8 g/l), a prázdná skupina. Do každého otvoru bylo umístěno jedno sterilní sklíčko. Byly odebrány buňky z logaritmické růstové fáze a štěpení trypsinem bylo použito k přípravě suspenze jednotlivých buněk a hustota buněk byla upravena na 5 x 106/ml a naočkována na 6-jamkovou destičku, 2 ml/jamka. Po 24 hodinách kultivace přidejte alkohol o konečné koncentraci 100 mmol/l a pokračujte v kultivaci 24 hodin. Vyjměte sklíčka plná buněk, dvakrát je promyjte PBS a obarvěte je rutinní imunohistochemickou metodou ABC. Krátké kroky jsou následující: fixujte je 40% paraformaldehydem na 10 minut, uzavřete je normálním ovčím sérem na 30 minut, kápněte a přidejte bcl-2 polyklonální protilátku (Invitrogen) (1:75) nebo c-fos polyklonální protilátka (Invitrogen) (1:50), reagujte při teplotě místnosti po dobu 1,5 hodiny, přidejte komplex ABC při teplotě místnosti po dobu 2 hodin, obarvěte DAB a uzavřete je želatinou. Exprese Bcl-2 a c-fos proteinu byla porovnána pomocí světelné mikroskopie a fotografie.
1.9 Statistické zpracování Experimentální data byla zpracována softwarem SPSS13.5. Vyjadřuje se jako průměr ± standardní odchylka (x ± s) a pro srovnání mezi skupinami se používá t-test. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.
2 Výsledky
2.1 Křivka růstu primárně kultivovaných myších hepatocytů je znázorněna na obrázku 1. Je vidět, že počet hepatocytů se zvyšoval s inkubační dobou a vstoupil do logaritmické růstové fáze 4. den.
Obr. 1 Růstová křivka primárně kultivovaných myších hepatocytů
2.2 Vliv různých koncentrací alkoholu na míru přežití primárně kultivovaných myších hepatocytů
Z tabulky 1 lze vidět, že alkohol má silný škodlivý účinek na primárně kultivované hepatocyty a účinek je závislý na dávce. Podle potřeb testu se jako pracovní koncentrace v následném testu použije 100 mmol/l a míra přežití buněk je 43,40 procenta.
2.3 Účinek celkových glykosidů zcistanche deserticolana míru přežití primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem
Lze vidět v tabulce 2. Po poranění alkoholem je míra přežití hepatocytů významně snížena. Celkové glykosidy cistanche deserticola mohou významně zvýšit míru přežití hepatocytů (P<0.05), and the effect is dose-dependent (P<0.05).
Pouštní žijící cistanche
2.4 Účinek celkových glykosidů zcistanche deserticolao morfologii primárně kultivovaných hepatocytů a jader poškozených alkoholem.
Azidinová oranž po vstupu do buněk vykazuje zelenou fluorescenci, zatímco promethazin může obarvit pouze nekrotické buňky s neúplnou buněčnou membránou. Pozorováním (obr. 2) bylo zjištěno, že hepatocyty ve slepé skupině byly jednotně zelené a nebylo zde žádné barvení nekrotických buněk bromovou červení (A); Po ošetření alkoholem se hepatocyty zmenšily a objevilo se velké množství nekrotických buněk obarvených bromovou červení a apoptotických buněk s koncentrací chromatinu v jádře (jádro bylo jasně zelené) (B). Proto se má za to, že alkohol může také způsobit nekrózu buněk, zatímco indukuje apoptózu hepatocytů. GC mohou významně snížit nekrózu a apoptózu a účinek pozitivně koreluje s dávkou (C, D, E).
2 Pozorování vlivu celkových glykosidů cistanche deserticola na morfologii primárních kultivovaných jaterních jader pod fluorescenčním mikroskopem (barvení akridinovou oranží, 400) Obr.
A: Prázdná skupina; B: Modelová skupina; C:{{0}}.2g/L-GCs; D:{6} 0,4 g/L-GC; E: 0,8 g/L-GC
2.5 Účinek celkových glykosidů zcistanche deserticolana apoptóze primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem
Prášek z extraktu cistanche
【Požádat o víc】 Email: xue122522@foxmail.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Na obrázku 3-B je vidět, že míra apoptózy hepatocytů po poškození alkoholem je významně zvýšená (34,7 procenta) a celkové glykosidy cistanche deserticola mohou významně zvýšit míru přežití hepatocytů v závislosti na dávce, což je v souladu s výsledky pozorovanými pod fluorescenčním mikroskopem.
3 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na apoptózu primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem Obr.
A: Prázdná skupina; B: Modelová skupina; C:{{0}}.2g/L-GCs; D:{6} 0,4 g/L-GC; E: 0,8 g/L-GC
Imunocytochemií bylo zjištěno, že po poškození jaterních buněk se exprese faktoru inhibujícího apoptózu bcl-2 snížila (4-B) a zvýšila se exprese c-fos (5-B) alkoholem. Celkové glykosidy Cistanche deserticola mohou významně zvýšit expresi bcl-2 (4-C, D, E) a inhibovat expresi c-fos (5-C, D, E). Výsledky jsou zobrazeny na obr. 4-5.
Obr. 4 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na expresi bcl-2 v primárně kultivovaných hepatocytech poraněných alkoholem (400) Obr.
A: Prázdná skupina; B: Modelová skupina; C:{{0}}.2g/L-GCs; D:{6} 0,4 g/L-GC; E: 0,8 g/L-GC
Obr. 5 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na expresi c-fos v primárně kultivovaných hepatocytech poraněných alkoholem (400) Obr.
A: Prázdná skupina; B: Modelová skupina; C:{{0}}.2g/L-GCs; D:{6} 0,4 g/L-GC; E: 0,8 g/L-GC
3 Diskuse
Čínská bylina cistanche
Berry a kol. nejprve zavedli in-situ perfuzní metodu použití kolagenázy k perfuzi jater k získání hepatocytů za fyziologických podmínek a později ji vyvinuli Seglen et al. [4], aby byla tato kolagenázová perfuzní technologie dokonalejší. Tato metoda má vysoký výtěžek buněk a vysokou míru přežití. V tomto experimentu byly primární hepatocyty získány perfuzí myších hepatocytů in situ a kultivovány. Metoda byla stabilní a buněčná aktivita byla silná. Pomocí testu růstové křivky bylo zjištěno, že získané primární hepatocyty vstoupily do logaritmické růstové fáze po 4 dnech.
MTT kolorimetrická mikroanalýza je citlivá metoda pro detekci buněčného růstu a přežití s dobrou opakovatelností. Sukcinátdehydrogenáza v mitochondriích živých buněk dokáže redukovat žluté MTT na modrofialové krystaly, zatímco mrtvé buňky takovou funkci nemají [5]. Buněčná aktivita se může projevit měřením optické hustoty. V tomto experimentu byla metoda MTT použita ke zjištění, že míra přežití hepatocytů po poškození alkoholem byla významně snížena a celkové glykosidy Cistanche deserticola mohly významně zvýšit míru přežití hepatocytů (P<0.05), and the effect was dose-dependent (P<0.05).
Apoptóza je zvláštní forma buněčné smrti. Když buňky projdou apoptózou, dojde ke zvláštním morfologickým a biochemickým změnám [6-8]. Experiment potvrdil, že většina hepatocytů byla po ošetření alkoholem apoptotická a buňky vykazovaly zjevné morfologické změny, které byly následující: buňky se zmenšily, mikroklky na buněčném povrchu zmizely, buněčný povrch se zmenšil, byly zde vakuoly, jádro kondenzace a tvorba apoptotických tělísek; Je doprovázena nekrózou. Po léčbě celkovými glykosidy Cistanche deserticola se výrazně snížila rychlost apoptózy a také se zmírnila situace nekrózy.
Gen bcl-2 je protoonkogen. V současné době bylo nalezeno pět genových rodin bcl-2 (bcl-2, bcl-2 x, bax, mcl-1 a A1), ve kterých bcl{{7 }} může inhibovat programovanou buněčnou smrt (PCD). Práce bcl-2Mechanismus může zahrnovat: (1) inhibici uvolňování Ca2 plus . Bcl-2 je transmembránový protein, který se nachází hlavně na jaderné membráně. Vnitřní a vnější jaderné membrány jsou spojeny lumen endoplazmatického retikula. Ten je hlavním úložištěm intracelulárního Ca2 plus, který hraje důležitou roli v procesu buněčné apoptózy. Pomocí transgenních metod bylo zjištěno, že vysoká exprese bcl-2 by mohla inhibovat uvolňování Ca2 plus z endoplazmatického retikula, takže se spekulovalo, že inhibiční účinek bcl-2 na apoptózu může souviset na Ca2 plus v endoplazmatickém retikulu [9]. (2) Bcl-2 hraje antiapoptotickou roli tím, že blokuje přenos signálu proapoptotických genů nebo blokuje tyto indukovatelné genové produkty. Studie ukázaly, že protein bcl-2 může inhibovat apoptózu indukovanou P53 a c-fos [10]. (3) Bcl-2 může hrát antiapoptotickou roli inhibicí volných radikálů. bcl-2 má roli antioxidantu, který může inhibovat produkci a působení superoxidu, čímž inhibuje výskyt apoptózy [11].
Časné okamžité geny (IEG) jsou geny, které se objevují časně a mají krátké trvání pod různými škodlivými podněty. c-fos je jeden z protoonkogenů, který se nachází na chromozomu 14q21-q31. Jedná se o 9kb DNA, složenou ze čtyř exonů a tří intronů [12]. Základní transkripce je nízká, ale může být spuštěna různými molekulami druhého posla pro rychlou a přechodnou expresi. Proteinový produkt c-fos je FOS a protein kódovaný protoonkogenem c-Jun je JUN. FOS obsahuje leucinový anti-chain (LZ) [13]. FOS a JUN tvoří heterodimer v jádře prostřednictvím struktury LZ, nazývané transkripční faktor AP-1, který se kombinuje s místem AP-1 cílového genu a působí jako třetí posel jádra, což umožňuje exprese genu efektu po dlouhou dobu [14]. Morgan věří, že různé výrazy c-fos naznačují rozmanitost a složitost jeho funkcí. Přechodná exprese se může podílet na ochraně, opravě, remodelaci a regeneraci buňky, zatímco trvalá nadměrná exprese souvisí se sekundárním poškozením. Expresní mechanismus těchto dvou je odlišný. Proto lze mít za to, že IEG, jako je c-fos, hrají dvojí roli. Když je opravný obranný systém zcela inhibován, účastní se apoptózy; Pokud není inhibován, má ochranný účinek na buňky v okolí léze a podílí se na procesu buněčné opravy a regenerace [15]. WebsterKR používá antisense nukleotidy ke snížení transkripce c-fos a prevenci výskytu apoptózy, což naznačuje, že nadměrná exprese c-fos je neoddělitelně spojena s výskytem a rozvojem různých onemocnění [16].
V tomto experimentu po poškození jaterních buněk alkoholem byla exprese faktoru inhibujícího apoptózu bcl-2 významně snížena a exprese c-fos byla zvýšena, což naznačuje, že celkové glykosidy Cistanche deserticola by mohly chránit játra buňkami zvýšením exprese bcl-2, inhibicí exprese c-fos, snížením poškození jaterních buněk a apoptózou.
【Požádat o víc】 Email: xue122522@foxmail.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692