Abstraktní

Akutní poškození ledvin (AKI)je kritický stav charakterizovaný rychlým poklesemfunkce ledvinv důsledku mnoha faktorů, jako je nefrotoxicita, sepse a ischemie.Poranění ledvinje dlouhodobý, složitý proces s potenciálně progredujícím počátečním poškozenímchronické onemocnění ledvina dokonceselhání ledvin v konečném stádiu. AKI se projevuje poškozením renálního parenchymu, tubulární nekrózou a sníženou rychlostí glomerulární filtrace, což vede ke snížení výdeje moči, nerovnováze elektrolytů, akumulaci metabolického odpadu a zvýšeným hladinám dusíku močoviny v krvi (BUN), sérového kreatininu (Scr) a kyseliny močové. AKI se často objevuje jako součást klinických syndromů, jako je srdeční selhání nebo selhání jater, postihující 10–15 % hospitalizovaných pacientů a až 50 % pacientů na jednotkách intenzivní péče (JIP). Rychlý nástup a špatná prognóza AKI z něj udělaly globální výzvu v oblasti veřejného zdraví. Současná západní léčba spoléhá hlavně na podpůrné a substituční terapie, které jsou nákladné a často nedávají optimální výsledky. Tradiční čínská a mongolská medicína, zakořeněná v tisících let holistické praxe, nabízí vícecílový, vícecestný a víceúčinný přístup s vysokou účinností a bezpečností. Tradiční medicína se v posledních letech stala horkým výzkumným tématem léčby AKI. Zkoumání mechanismu mongolské medicíny obsahující Cistanche při léčbě AKI má tedy významnou hodnotu.

Mongolská složená medicína na bázi Cistanche je klasický recept složený zCistanche, granátové jablko, skořice, pepř dlouhý (Piper longum), Alpinia officinarum, Amomum villosumaBorneol. Podle tradiční mongolské lékařské teorie se ledvina nachází v pozici „Badagan“ mezi pěti vnitřnostmi a onemocnění ledvin jsou často badaganského typu, spouštěná chladem. O recepturách obsahujících cistanche, které jsou svou povahou teplé, se věří, že vylučují chlad z ledvin a mají ochranné účinky na funkci ledvin, v souladu s mongolským principem „léčení nachlazení teplem“. Předchozí studie ukázaly, že tyto přípravky, pokud se používají v kombinaci s jinými mongolskými léky, poskytují ochranu ledvin v modelech AKI. Na základě toho je cílem této studie využít síťovou farmakologii a experimentální validaci k prozkoumání bioaktivních složek, terapeutických cílů a klíčových cestMongolská medicína obsahující Cistanche při zlepšování AKI, čímž se položil teoretický základ pro jeho klinickou aplikaci a další rozvoj.

 

 

 

cistanche doplňky proPacienti s akutním poškozením ledvin (AKI).

Kliknutím na obrázek získáte další podrobnosti o doplňku bylinné cistanche

 

 

1. Materiály a metody

1.1 Farmakologická analýza sítě

1.1.1 Identifikace aktivních sloučenin a cílů

Pomocí klíčových slov „Cistanche, Piper longum, Alpinia officinarum, skořice, granátové jablko, Amomum villosum, Borneol“ jsme prohledaliDatabáze farmakologie systémů tradiční čínské medicíny (TCMSP)[http://tcmsp-e.com] k získání bioaktivních sloučenin a jejich cílů. Kritéria screeningu byla:orální biologická dostupnost (OB) větší nebo rovna 30 %apodobnost s drogou (DL) Větší nebo rovna 0,18. U Cistanche a cinnamon, které postrádají složky splňující tyto prahové hodnoty, jsme doplnili údaje o sloučenině/cíli pomocí přehledu literatury aSwissTargetPrediction[https://www.swisstargetprediction.ch/]. Protože hlavní složkou borneolu je chlorid amonný, byl z další analýzy vyloučen. Všechny sebrané proteinové cíle byly standardizoványNázvy genů homo sapienspomocíUniProtdatabáze [https://www.uniprot.org].

1.1.2 Konstrukce Compound-Target Network

Shromážděná data byla uspořádána do souborů NETWORK a TYPE a analyzována pomocíCytoscape 3.9.1vybudovat interakční síť sloučenina-cíl pro mongolskou medicínu založenou na Cistanche.

1.1.3 Screening cílů souvisejících s AKI

Cíle spojené s AKI byly získány pomocí klíčových slov „akutní poškození ledvin“ a „akutní selhání ledvin“ z:

GeneCards[https://www.genecards.org/]

OMIM[https://omim.org/]

Terapeutická cílová databáze (TTD)[https://db.idrblab.net/ttd/]

DrugBank[https://www.drugbank.com/]

PharmGKB[https://www.pharmgkb.org/]

Vennovy diagramy byly vytvořeny pomocí online nástroje [https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/] k identifikaci překrývajících se cílů mezi databázemi.

1.1.4 Identifikace základních sloučenin a cílů, výstavba sítě PPI

PomocíAnalyzátor sítěV Cytoscape jsme analyzovali síť složených cílů. Uzly sstupeň centralita, mezistanost centralitaablízkost centrálnostnad mediánem aprůměrná nejkratší délka cestypod mediánem, byly vybrány ve čtyřech kolech k identifikaci jádrových sloučenin. Do souboru byly vloženy společné cíle mezi sloučeninou a cíli souvisejícími s onemocněnímSTRINGdatabáze [https://cn.string-db.org/], druhy nastavené na Homo sapiens, k vytvořeníprotein-proteinová interakce (PPI)síť. Síť byla exportována ve formátu TSV pro další analýzu v Cytoscape. Výsledkem byla tři kola screeningupotenciální cílea vyšlo šest kolhlavní cíle. Thehlavní cíl–potenciální cílová síťbyl také konstruován v Cytoscape.

1.1.5 Analýza obohacení GO a KEGG

Analýza obohacení byla provedena vRStudio 4.3.1pomocíBioconductor a ClusterProfilerbalíčky. Anotace genové ontologie (GO) zahrnovaly biologický proces (BP), buněčnou složku (CC) a molekulární funkci (MF).Obohacení dráhy KEGGbyl také proveden. Vizualizace byla dokončena přesBioinformatics.com.cn[https://www.bioinformatics.com.cn/].

1.1.6 Konstrukce sítě Core Compound–Target–Disease–Pathway

Identifikované základní sloučeniny, potenciální cíle, související onemocnění a signální dráhy byly integrovány do konstrukce azákladní síť sloučenin – cíl – nemoc – dráhapomocí Cytoscape 3.9.1.

1.1.7 Molekulární dokování

Struktury jádrových sloučenin byly staženy zPubChem[https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/] ve formátu SDF a převedené na MOL2 pomocíOpen Babel 2.4.1. Struktury jádrového proteinu byly získány zPNR[https://www.rcsb.org/], vybrané na základě původu Homo sapiens, vysoké rozlišení a pokud možno jednotlivé řetězce. Molekulární dokování bylo provedeno pomocíAutoDockTools 1.5.7, s 50 běhy pomocí metody genetického algoritmu. Byla vybrána nejlepší vazebná konformace s nejvyšší vazebnou afinitou a většinou vodíkových vazeb. Výsledky byly vizualizovány vPyMOL 2.5.7.

1.2 Experimentální ověření

1.2.1 Pokusná zvířata

SPF-grade 4 týdny staří samci KM myší (22 ± 2 g) byli zakoupeni od SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. (Licenční č. SCXK (Jing) 2024-0001). Myši byly umístěny ve zvířecí laboratoři Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science and Technology. Podmínky: 12 h cyklus světlo/tma, 24 ± 2 stupně, vlhkost 55 ± 5 %, krmení ad libitum. Experimenty na zvířatech byly schváleny Institucionálním etickým výborem (č. schválení BYDY-DL2023-36).

1.2.2 Příprava léčiva

Mongolský lék na bázi cistanche (šarže č

1.2.3 Reagencie a přístroje

Klíčová činidla:

CMC-Na (Solarbio, Peking)

Lipopolysacharid (Sigma-Aldrich, Shanghai)

Sady pro extrakci RNA a reverzní transkripci (Sevier Biotech, Wuhan)

qPCR master mix, RIPA lyzační pufr, BCA kit, protilátky: PI3K, Akt, p-Akt, -actin (Proteintech, Wuhan)

Detekční sada ECL (Sevier Biotech, Wuhan)

Klíčové nástroje:

Čtečka mikrodestiček (Thermo Fisher)

Centrifuga (JIDI-16R)

Systém PCR v reálném čase (Thermo Fisher)

Gel Imaging System (Tanon, Shanghai)

1.2.4 Seskupování, modelování a správa

32 myší bylo náhodně rozděleno do 4 skupin (n=8):

Řízení

Model

Skupina s nízkou dávkou Cistanche (450 mg/kg)

Skupina s vysokou dávkou Cistanche (900 mg/kg)

Skupiny Cistanche dostávaly denně orální sondu po dobu 7 dnů. V den 7, 2 hodiny po podání dávky, byla všem skupinám kromě kontroly intraperitoneálně podána injekceLPS (10 mg/kg)k vyvolání AKI. Kontrolní skupina dostávala fyziologický roztok.

1.2.5 Morfologie ledvin, tělesná hmotnost a index ledvin

24 hodin po modelaci byla zaznamenána tělesná hmotnost a hmotnost ledvin. Index ledvin=celková hmotnost ledvin (g) / tělesná hmotnost (kg).

1.2.6 Biochemické testy

Hladiny BUN, Scr a kyseliny v séru byly měřeny pomocí komerčních souprav.

1.2.7 Histopatologická analýza

Tkáně ledvin byly fixovány ve 4% paraformaldehydu, dehydratovány, zality v parafínu, nařezány a obarveny pomocíHE barvení. Poškození tkáně bylo hodnoceno pod světelným mikroskopem.

1.2.8 qRT-PCR pro TNF-, IL-6, IL-1

Celková RNA z ledvinové tkáně byla extrahována, reverzně transkribována a amplifikována pomocí SYBR Green qPCR. GAPDH byl použit jako vnitřní kontrola. Relativní exprese mRNA byla vypočtena za použití2^-ΔACt metoda.

1.2.9 Western blotting pro cestu PI3K/Akt

Proteiny byly extrahovány z ledvinové tkáně pomocí RIPA pufru. Koncentrace proteinu byla měřena testem BCA. Proteiny byly separovány pomocí SDS-PAGE, přeneseny na PVDF membrány, blokovány a sondovány primárními a sekundárními protilátkami. Signály byly vyvinuty pomocí ECL a kvantifikovány pomocíImageJsoftware.

1.3 Statistická analýza

Data byla analyzována pomocíGraphPad Prism 9.5. Výsledky byly vyjádřeny jakoprůměr ± SD. Pro normálně distribuovaná data se stejným rozptylemjednosměrná ANOVAnásledujeLSD-t testbyl použit. Pro nenormální nebo nestejné údaje o rozptyluKruskal-Wallisův H testbyla aplikována. AP-hodnota < 0,05byl považován za statisticky významný.