Studie o účinku akteosidu (aktivní složka v CiStanche Deserticola) na NAFLD vyvoláním autofagie

2 výsledky

2.1 Porovnání LC 3- ⅱ hladiny proteinu v buňkách Hepg2 ošetřenýchAct and Ech relativní vyjádření LC 3- ⅱ ProteinV buňkách HEPG2 ošetřené BAFA1 (0. 67 ± 0. 0 4) bylo výrazně vyšší než v prázdné kontrolní skupině (0. 41 ± 0. 0 2). Relativní výraz LC {{1 {{2 0}}}} ⅱ Protein v hepg2 buňkách v rapamycin+bafa1 skupiny (1,24 ± {0}. (0. 28 ± {{4 0}}. 02). Exprese LC 3- ⅱ protein v HEPG2 buňkách ve skupině ECH+BAFA1 a skupiny ACT+BAFA1 [0,43 ± 0,02 a 1,36 ± 0,11, respektive, a to byly ve statistikách (0,18 ± 0,28 ± 0,02], a to, v respektivně], a to, respektive), a to, v respektivě], a v respektive P -respektive], a v respektive P -respektive], a to, respektive], a v respektive P -respektive] a v respektive P -respektive] a v respektive P -respektive] a v respektive P -respektive) a v respektive P -respektive) a v respektive P, respektive, a to, respektive P ± 0,28 ± 0,02], respektive P, a to, respektive.<0.05).

TCM Herb Cistanche pro ochranu jater

2.2 Porovnání LC 3- ⅱ hladiny proteinu v buňkách HepG2 ošetřených různými koncentracemi ACT

The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{1 0}}}}. 0 5); LC 3- ⅱ Hladiny proteinu exprese hepg2 buněk v BAFA1 v kombinaci s 25, 5 0 a 1 0 0 μmol/L ACT SKUPINY 1,83 ± 0. 53 a 0. 97 ± 0,25) byly významně vyšší než u 25, 50 a 100 μmol/l ACT skupin (P.<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.

Poznámka: A. proteinové imunoblotting; B. Výsledky semikvantitativní analýzy; Ve srovnání se skupinou ACT bez BAFA1, AP<0.05.
Obrázek 1 Porovnání LC 3- ⅱ hladiny exprese proteinu v buňkách HEPG2 ošetřených různými koncentracemi ACT

2.3 Srovnání životaschopnosti buněk HEPG2 ošetřených různými koncentracemi ACT po dobu 24 a 48 hodin

Hodnoty OD hodnot buněk HEPG2 po zásahu s 0, 2 0, 4 {{1 {12}}}}, 6 0, 8 {16}}, a 1 0 0 20 {{2 ACT pro 24 H. 0. 98 ± 0. 17, 0. 99 ± {{3 0}}. 15, 0. 0. 94 ± 0. 15, a 0. 94 ± 0. 20; a hodnoty OD HEPG2 buněk po intervenci po dobu 48 hodin byly 3,06 ± 0,27, 0,96 ± 0,27, 2,88 ± 0,27, 3,08 ± 0,15, 3,01 ± 0,13 a 0,09 ± 0,22. Nebyl žádný významný rozdíl v hodnotách OD HEPG2 buněk po 24 a 48 hodinách intervence s různými koncentracemi ACT (F =0. 213, 0,213, P =0 96, 0,36). Viz obrázek 2.

Poznámka: A. buňky HEPG2 byly ošetřeny různými koncentracemi ACT po dobu 24 hodin; B. buňky HEPG2 byly ošetřeny různými koncentracemi ACT po dobu 48 hodin.

Obrázek 2 hodnoty OD při 570 nm po 24 a 48 hodinách léčby různými koncentracemi ACT

2.4 Srovnání hladin TG a olejové červené O barvení v modelu buněk in vitro po intervenci ACT

Hladina TG buněk HEPG2 ve skupině modelu (34,15 ± 1,90) byla významně vyšší než hladina kontrolní skupiny (14,17 ± 2,74) a intervenční skupina ACT (19,11 ± 1,68) a rozdíly byly statisticky významné (P.<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).

Poznámka: Úroveň A. TG; B. Olejové barvení O (20 x); Ve srovnání se skupinou modelu AP<0.05.
Obrázek 3 Porovnání hladiny TG a barvení oleje v modelu NAFLD in vitro po léčbě ACT

2.5 Porovnání autofagosomů a lipidových kapiček po léčbě ACT ve srovnání s kontrolní skupinou Blank, lipidové kapičky hepg2 buněk ve skupině s léčbou rapamycinu a intervenční skupinou ACT se významně zvýšily a kokosalizované kapičky lipidů v kosmiku se významně zvýšily. Viz obrázek 4.

3 Diskuse

NAFLD je nejčastější chronickou onemocnění jater na světě, což představuje asi 1/4 celkové světové populace a stala se globálním problémem veřejného zdraví. Overutrition je hlavní faktor řídí NAFLD. Nadměrný příjem živin jaterními buňkami způsobuje nadměrné ukládání tuku v buňkách, což vede k lipotoxickým reakcím, jako je buněčný stres (oxidační stres a endoplazmatický stres retikula), aktivace zánětlivých a buněčných apoptóz a fibróza a fibróza a fibróza, a tkáň, tkáně, tkáně, [} {{} {} {{}}. V posledních letech studie ukázaly, že autofagie hraje důležitou roli při prevenci rozvoje lidského NAFLD. Výsledky detekce indexu související s autofagií v játrech pacientů s NAFLD a nealkoholickým mastným onemocněním jater a játra obézních a vysoce tuků dietních myší ukázaly, že autofagický proces v hepatocytech byl blokován, což vedlo k masivní akumulaci intracelulárního TG a dalšího lipidového kapky [16]. Jiné studie ukázaly, že poté, co byl klíčový gen 7 hepatocytové autofagie specificky vyřazen u myší krmených vysokotučným stravou, hladina TG v hepatocytech myší významně vzrostla [17]. Po nadměrné expresi genu ATG7 nebo intervence s induktory autofagie, jako je rapamycin a karbamazepin, však byla mastná degenerace v játrech myší významně snížena [18-20].
To naznačuje, že mastná degenerace jater může být významně snížena zlepšením aktivity autofagie jater, což poskytuje účinnou strategii pro léčbu NAFLD. Přírodní produkty, jako hlavní zdroj nového vývoje léčiv, se široce používají při prevenci a léčbě různých onemocnění jater. Jako vynikající produkt, který se běžně používá v tradiční čínské medicíně, přitahovala Cistanche Deserticola rozsáhlou pozornost pro své farmakologické účinky, jako je neuroprotekce, imunomodulace, antioxidant, protirakovira a ochrana jater. Doposud bylo z Cistanche Deserticola izolováno více než 120 sloučenin, včetně fenyletanoidních glykosidů, terpenoidů a jejich glykosidů, lignanů a jejich glykosidů, oligosacharidů, polyolů a polysacharidů [21]. Mezi nimi jsou fenylethanoidní glykosidy nejuznávanější třídou sloučenin v aktivních složkách CiStanche Deserticola. ECH a ACT jsou reprezentativní sloučeniny Cistanche Deserticola fenyletanoidní glykosidy, které mají pozitivní účinky na antioxidanty, chrání játra, myokardu, nervové buňky a zvyšují paměť [{2}}]. Neexistuje však žádná relevantní zpráva o literatuře o tom, zda jsou do procesu autofagie zapojeny fenyletanoidní glykosidy Cistanche deserticola fenyletanoidních glykosidů při ochraně jater.

Autofagie je proces sebevysazení, který je v těle všudypřítomný. Je to katabolický proces, ve kterém autofagosomy degradují buněčný metabolický odpad. Proces autofagie obecně zahrnuje tři procesy: iniciace autofagie, prodloužení autofagické membrány a tvorbu autofagických lysozomů, které jsou regulovány hlavně rapamycinem cílovým proteinem a fosfatidylinositol -3 signálních drah kinázy. Autofagosomy jsou markery buněčné autofagie. V procesu tvorby autofagosomů hraje důležitou roli řada proteinů souvisejících s autofagií včetně ATG5 ~ 12 a LC3. Tato studie proto vytvořila systém hodnocení autofagie, detekovala hladinu exprese autofagického markerového proteinu LC3 na molekulární úrovni a vyhodnotila indukční schopnost autofagie dvou fenylethanoidních glykosidů Cistanche Deserticola v buňkách HepG2. Výsledky ukázaly, že po přidání léčby BAFA1 na základě zásahu induktoru autofagie rapamycinu může intracelulární LC 3- ⅱ} ⅱ} ⅱ Hepg2 buněk významně zvýšil, což naznačuje, že systém autofagie indukce léčiv; Poté, co byly ECH a ACT ošetřeny BAFA1, exprese LC 3- ⅱ protein v HEPG2 buňkách ve skupině ECH+BAFA1 a skupina ACT+BAFA1 byla významně vyšší než ve skupině ECH a skupině ACT a ACT Group, a skupiny ACT a ACT a ve skupině ACT a ve skupině ACT, a rozdíly byly statisticky významné (P<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and Vymáhání ochrany jatera další biologické funkce. Za druhé, bezpečnost je primárním hlediskem při vývoji léčiv. Za účelem vyhodnocení bezpečnosti zákona tato studie dále testovala účinek ACT na životaschopnost buněk HEPG2. Výsledky ukázaly, že životaschopnost buněk HEPG2 byla téměř ovlivněna zásahem s různými koncentracemi ACT, což naznačuje, že ACT může být použit jako kandidátský lék k dalšímu studiu jeho farmakologických účinků a molekulárních mechanismů.

Autofagie je vysoce konzervovaný biologický proces v buňkách a mírné změny v koncentracích léčiva ovlivní úroveň buněčných autofagosomů. Pro další stanovení optimální koncentrace ACT k indukci tvorby autofagosomů v buňkách HepG2 použila tato studie různé koncentrace ACT kombinované s BAFA1 k léčbě buněk HEPG2 a detekovala úroveň exprese LC 3- ⅱ proteinu v buňkách. Výsledky ukázaly, že ACT 50 μmol/l by mohl významně zvýšit hladinu autofagosomů v buňkách HEPG2. Tato studie proto použila akt 50 μmol/l k zasažení do modelu NAFLD buněčného modelu konstruovaného in vitro a předběžně prozkoumala vztah mezi jehoochrana jaterfunkce a autofagie.
Související studie o modelech NAFLD buněk ukázaly, že po intervenci in vitro s volnými mastnými kyselinami se hladina TG buněk HEPG2 významně zvýšila a v buňkách by mohla být jasně pozorována agregace mastných lipidových kapiček [24-25]. V této studii bylo 100 μmol/L PA použito k zasažení do buněk HEPG2 in vitro po dobu 24 hodin. Hladina TG buněk HEPG2 ve skupině modelu byla výrazně vyšší než v úrovni kontrolní skupiny. Současně by v buňkách mohla být jasně pozorována agregace kapiček lipidů, což naznačuje, že model NAFLD byl úspěšně konstruován. Za účelem dalšího pozorování účinku ACT na model NAFLD buněk byl použit k zasažení do modelu NAFLD in vitro in vitro a účinek ACT na NAFLD byl vyhodnocen detekcí úrovně TG a barvením oleje. Výsledky ukázaly, že po intervenci ACT byla hladina TG a počet mastných lipidových kapiček v buňkách HEPG2 významně nižší než v modelové skupině, což naznačuje, že ACT má aktivitu snižování TG v PA-indukovaném modelu NAFLD buněk. Za účelem dalšího studia vztahu mezi aktivitou snižování lipidů ACT a buněčnou autofagií použila tato studie LC 3-} ⅱ specifické proteinové protilátky a Bodypií fluorescenční sondy, aby se stala autofagosomy a lipidové kapičky. Bylo pozorováno, že počet autofagosomů v buňkách HEPG2 po intervenci ACT byl významně zvýšen ve srovnání s kontrolní skupinou, což bylo v souladu s výsledky proteinového imunoblotování v této studii, což dále potvrzuje, že ACT má aktivitu indukující autofagii v buňkách HepG2. Kromě toho po intervenci léčiva intracelulární autofagosomy a lipidové kapičky společně lokalizovány, což naznačuje, že účinek ACT na zlepšení PA-indukované degenerace NAFLD může zahrnovat zapojení buněčné autofagie. V modelu NAFLD buněk však ACT vyvíjí svou farmakologickou aktivitu snižování intracelulárních hladin TG prostřednictvím lipofagické dráhy stále vysvětleno blokováním procesu intracelulární autofagie.
Stručně řečeno, mezi dvěma sloučeninami fenylethanolu glykosidu Cistanche Deserticola má ACT významnou schopnost indukovat autofagii v HEPG2 buňkách. Současně v modelu buněk jaterních steatózů vyvolaného PA indukovaný PA CT významně snížil hladinu TG v buňkách HepG2. Po intervenci ACT měly autofagosomy a lipidové kapičky v buňkách HepG2 určitý ko-lokalizační vztah, což naznačuje, že autofagie může být novou cestou zapojenou do farmakologického procesu ACT z hlediska ochrany jater. Viz obrázek 5. V následných studiích bude mechanismus účinku ACT při snižování lipidů dále podrobně studován pomocí autofagických blokátorů, aby položil základ pro budoucí vývoj nových léčiv.