Studie o separaci a imunokompetenci vodního extraktu polysacharidu z Cistanche Tubulosa

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Ailadan·Maimaitiaili1,LI Yang1,YAO Jun1,YUAN Jie2

(1. School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Čína; 2. Collage of Houbo, Xinjiang Medical University, Xinjiang Klamayi 834000, Čína）

ABSTRAKTNÍ CÍL:K izolaci vodního extraktu zpolysacharidy z Cistanche tubulosaa zkoumat jejich imunokompetenci in vitro. METODY: AB{{{{30}}}} makroporézní adsorpční pryskyřice byla použita k odbarvení polysacharidu C. tubulosa. Proces odbarvování byl optimalizován ortogonálním testem s mírou retence a rychlostí odbarvování polysacharidu jako komplexním skóre a s použitím rychlosti adsorpce, doby odbarvování a koncentrace vzorku jako faktorů. Byly provedeny ověřovací testy. K separaci vodného extraktu odbarveného polysacharidu C. tubulosa byla použita iontoměničová kolona DEAE-650M. CCK-8 test byl použit k detekci účinků různých koncentrací polysacharidu（6.25-100 ug/mL）před a po izolaci na rychlost proliferace myšího makrofága RAW264.7. Griessova metoda a test ELISA byly přijaty k detekci účinků nízké, střední a vysoké koncentrace polysacharidu（12,5,25,50 ug/ml）na uvolňování NO,IL-6 a TNF- v buňkách RAW264.7 indukovaných LPS. VÝSLEDKY: V optimálním procesu odbarvování AB-8 makroporézní adsorpční pryskyřice byl adsorpční průtok 1,2 BV/h, doba odbarvování byla 9 h a koncentrace vzorku byla 25 mg/ml. Komplexní skóre 3krát ověřovacích testů bylo 63,43％, 63,29％, respektive 63,34％, s průměrem 63,35％ (RSD＝0,11％,n＝3）). Z polysacharidu C. cistanche byl izolován jeden neutrální polysacharid (CTZ) a 5 kyselých polysacharidů (CT1,CT2,CT3,CT4,CT5), obsah byl 299,2,168.0,123,2,1241,6,5 11,2 mg/g. Ve srovnání s kontrolní skupinou, 6.25-100 ug/ml CTZ （kromě 6,25 μg/ml）, CT2, CT4,CT5 a ​​6,25 μg/ml CTC （polysacharid před separací） mohl významně zvýšit rychlost proliferace buněk RAW264.7(P＜{{80}}.05）), zatímco 6.25-100 ug/ml CT1, CT3 a 50 ug/ml CTC by mohlo snížit rychlost proliferace RAW264. 7 buněk (P＜0,05）). Ve srovnání se skupinou LPS bylo uvolňování NO významně sníženo ve skupinách s nízkou, střední a vysokou koncentrací CTC, CT2, CT3 a CT5, CTZ ve skupině nízké koncentrace＜0,05）, zatímco ve skupinách s vysokou koncentrací CT1 bylo významně zvýšeno a CT4 ＜0,05）. Uvolňování IL-6 （kromě skupiny s vysokou koncentrací CT1 a skupiny s nízkou koncentrací CT5）a TNF-（kromě skupiny se střední koncentrací CT1）bylo významně sníženo ve skupinách s nízkou, střední a vysokou koncentrací（P＜0,05 ). ZÁVĚRY: Optimalizovaná technologie odbarvování makroporézní adsorpční pryskyřice je stabilní a ve studii proveditelná. Z vodního extraktu polysacharidů C. tubulosa lze izolovat jeden neutrální polysacharid a 5 kyselých polysacharidů, z nichž polysacharid CT2 má silnější protizánětlivou schopnost.

KLÍČOVÁ SLOVA:polysacharid Cistanche tubulosa; Odbarvování; Separace; Imunokompetence

Cistanche tubulosaje suchý, dužnatý stonek se šupinovými listyCistanche tubulosa (Schenk) Wightz čeledi Lidanaceae. Moderní studie prokázaly, že Cistanche Tubula obsahuje fenetylalkoholové glykosidy, iridoidní glykosidy, lignany, polysacharidy, alkaloidy a další biologicky aktivní látky, které mají afrodiziakální, projímavé, jaterní ochranné a anti-aging vlastnosti. , Protiúnavová zvýšená imunita a nootropní účinky [1-4], lze použít ke klinické léčbě nedostatku jangu ledvin, nedostatku esence a krve, impotence a neplodnosti, slabosti pasu a kolen, slabosti svalů a kosti, suchá střeva a zácpa [5].

Klikněte na produkty Cistanche herba

Vodní extrakt zPolysacharid Cistanche tubulosaje hnědožlutá. Předchozí experiment naší výzkumné skupiny zjistil, že kroměCistanche tubulosa polysacharid, vodní extrakt také obsahuje necílové složky, jako jsou ve vodě rozpustné pigmenty a proteiny. To přispívá k separaci a čištění polysacharidů. Výzkum biologické aktivity způsobil velké potíže. Tradiční ošetření odbarvováním organickým rozpouštědlem zničí chemickou strukturu cílové složky v surovém extraktu a sníží farmakologickou aktivitu osoby a zavedení škodlivých složek do lidského těla [6]. Makroporézní adsorpční pryskyřice je běžným materiálem pro odbarvování polysacharidů v extraktech čínské medicíny. Jedná se o cenově výhodný polymerní adsorpční materiál se stabilními fyzikálními a chemickými vlastnostmi. Může být zacílen svou selektivní adsorpcí a prosévacím výkonem pro pigmentové složky. K odstranění pigmentů ve výtažcích tradiční čínské medicíny se navíc dá regenerovat mořením a alkalickým praním, proto je hojně využíván [7]. Tato studie má v úmyslu použít makroporézní adsorpční pryskyřici k odbarvení vodního extraktu polysacharidu Cistanche Tubula a použít ortogonální experiment k optimalizaci podmínek odbarvování; po odbarvení extraktu se podle odlišné povahy skupiny nesené polysacharidem plánuje použít Metoda iontoměničové sloupcové chromatografie dále odděluje neutrální a kyselé polysacharidové složky v polysacharidu zCistanche tubulosa.

Studie to ukázalyrostlina cistanchepolysacharidy mají imunomodulační účinky a jsou přírodními imunomodulátory, které mohou aktivovat komplementový systém a imunitní buňky, jako jsou T/B lymfocyty, makrofágy, přirozené zabíječské (NK) buňky, a mohou také podporovat různé uvolňování cytokinů a podporovat produkci protilátek atd. [8-11]. Lipopolysacharid (LPS) může aktivovat zánětlivou signální dráhu makrofágů, indukovat oxid dusnatý (NO) a prozánětlivé cytokiny, jako je interleukin 6 (IL-6) a tumor nekrotizující faktor-alfa (TNF- ). Syntéza a uvolnění, čímž se v těle spustí řada zánětlivých reakcí [12]. Tato studie má za cíl vytvořit LPS-indukovaný myší makrofágový zánětlivý model RAW264.7, vycházející z účinků polysacharidu Cistanche Tubula na proliferaci makrofágů, sekreci zánětlivých faktorů a produkci NO a předběžné hodnocení jeho účinku na imunitní aktivitu těla. Jeho cílem je poskytnout teoretický základ pro hloubkové studium základu protizánětlivých účinných látekCistanche tubulosapolysacharid a vývoj jeho polysacharidových zdrojů.

Předběžné studie zjistily, že když se polysacharidy v Cistanche cistanche extrahují vodou, rozpustí se společně více látek rozpustných ve vodě, což ovlivňuje čistotucistanche cistanche polysacharidy. Proto jejich další separace a čištění může položit základ pro studium základu polysacharidového materiálu a biologické aktivity. Metoda makroporézní adsorpční pryskyřice je běžně používaná metoda odbarvování [17-19]. Protože stále není jasné složení pigmentuCistanche tubulosa, takže výzkumná skupina použila statické adsorpční experimenty ke screeningu nejvhodnější makroporézní adsorpční pryskyřice AB-8 z makroporézních adsorpčních pryskyřic různých polarit. Polysacharid z Cistanche deserticola má dobrou retenční schopnost. Aby bylo dosaženo lepšího odbarvovacího efektu, je tento výzkum založen na předchozím výzkumu a ke stanovení procesu odbarvování (promývání) byly optimalizovány ortogonální experimenty (promývání). V důsledku toho byla optimální metoda odbarvování pro polysacharid z Cistanche tubulosa eluční průtok 1,2 BV/h, doba odbarvování 9 hodin a hmotnostní koncentrace vzorku 25 mg/ml. Výsledky ověřovacího experimentu ukazují, že metoda odbarvování je proveditelná.

Čistota a druh přírodních polysacharidů jsou důležitými faktory, které ovlivňují její aktivitu. Proto je relevantní výzkum metod izolace a čištění polysacharidů stále těžištěm výzkumné práce přírodních aktivních polysacharidů. Mezi běžně používané metody separace polysacharidů patří precipitace, gelová chromatografie, aniontoměničová chromatografie, sloupcová chromatografie na makroporézní pryskyřici a ultrafiltrace [20]. Vzhledem k různému složení monosacharidů mají polysacharidy různé nábojové vlastnosti. Lze je rozdělit na neutrální polysacharidy a kyselé polysacharidy. Neutrální polysacharidy jsou polymery složené ze dvou nebo více různých monomerů na bázi cukru, které neobsahují organické kyseliny. Kyselé polysacharidy jsou komplexnější než neutrální polysacharidy, pokud jde o složení a strukturu, kromě toho, že obsahují více než dva monomery na bázi cukru. , Obsahuje také kyselinu uronovou mono Body [21]. Aniontoměničová sloupcová chromatografie využívá rozdílu v náboji polysacharidů k ​​oddělení neutrálních polysacharidů od kyselých polysacharidů [22]. Z tohoto důvodu tato studie použila DEAE-650M iontoměničovou kolonu pro chromatografii na separaci polysacharidů Cistanche Tubula a celkem byl separován 1 neutrální polysacharid a 5 kyselých polysacharidů. Makrofágy jsou imunokompetentní buňky, které mohou regulovat imunitu pohlcováním a zabíjením patogenních mikroorganismů. Studie ukázaly, že když je lidské tělo stimulováno patologickým nebo mechanickým poškozením, léková intervence může aktivovat makrofágy ke zvýšení fagocytární kapacity makrofágů indukovaných LPS, a tím inhibovat produkci NO a řady zánětlivých buněk, jako je IL{{ 9}} a sekreci faktoru TNF, čímž chrání hostitele před patogeny [23]. Za tímto účelem tato studie testovala účinky různých polysacharidů Cistanche tubulosa na rychlost proliferace buněk RAW264.7, stejně jako účinky na LPS-indukované makrofágy na uvolňování NO, IL-6 a TNF-. Výsledkem bylo, že v rozmezí hmotnostních koncentrací 12,5, 25 a 50 ug/ml nejen podporovalo proliferaci buněk RAW264.7, ale také významně inhibovalo proliferaci buněk RAW264.7.

Thepolysacharid z Cistanche tubulosav buňkách RAW264.7 indukovaných LPS k uvolňování NO, IL-6 a TNF- jsou CT2. Relevantní studie ukázaly, že složení monosacharidů a molekulová hmotnost polysacharidů ovlivní jeho složeníimunomodulačníaktivita. Monosacharidy jako galaktóza, arabinóza, manóza a glukóza pozitivně korelují s imunitní aktivitou polysacharidů [24]. Polysacharidy s větší molekulovou hmotností mohou obsahovat vyšší strukturu mnohočetných vysoce repetitivních uzlů, mohou křížově propojovat povrchové receptory plazmatické membrány vícesměrně a specifickyposílit imunomodulaciúčinek [25]. Monosacharidové složení kyselého polysacharidu CT2 v této studii proto může obsahovat speciální monosacharidy nebo mnohočetné monosacharidy, které pozitivně souvisí s imunitní aktivitou, a molekulová hmotnost může být větší než u neutrálních polysacharidů a jiných kyselých polysacharidů, ale k potvrzení je zapotřebí dalšího výzkumu. . Stručně řečeno, optimalizovaný proces odbarvování makroporézní adsorpční pryskyřice v tomto výzkumu je stabilní a proveditelný; Z vodního extraktu Cistanche cistanche cistanche lze oddělit 1 neutrální polysacharid a 5 kyselých polysacharidů, mezi nimiž je imunologická aktivita kyselého polysacharidu CT2 Stronger. Tato studie může položit experimentální základ pro vývoj a využití polysacharidů Cistanche Tubula.