Studie neuroendokrinně-imunitní funkce Cistanche Deserticola a jejích produktů napařovaných rýžovým vínem u modelu potkanů ​​indukovaných glukokortikoidy

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Bonan Liu, Ji Shi, Zhe Li, Chao Zhang, Pengpeng Liu, Wei Yao a Tianzhu Jia

1 Farmaceutická fakulta, Univerzita tradiční čínské medicíny Liaoning, Dalian 116600, Čína

2 Druhá nemocnice lékařské univerzity Dalian, Dalian 116600, Čína

Abstraktní

Pouštní obydlíBylina cistanchebyla poprvé zaznamenána v "Shen Nong Herbal Classic" a je v této publikaci uvedena jako nejlepší rostlinná medicína. /e Čínský lékopis zaznamenává ty kusy Cistanche deserticola(CD) a dušené rýžové vínoCistanche deserticola(WCD) lze použít na klinice jako hlavní typy odvarů. Po spaření s rýžovým vínem se zesílí protistárnoucí a tonizující ledvinovo-jangové účinky. V této studii jsme detekovali chemický obsah Cistanche Deserticola a WCD a farmakologický mechanismus povzbuzujícího deficitu ledvin-yang u modelových potkanů. Cíl. Účelem této studie bylo prozkoumat účinky Cistanche Deseticola a WCD na neuroendokrinníimunitní funkcedeficience jangu ledvin u modelu potkanů ​​předávkovaných glukokortikoidy. Materiály a metody. Byly vybrány krysy Sprague Dawley (SD). Krysám byla subkutánně injikována vodná suspenze kortikosteronu u modelu potkanů ​​předávkovaných glukokortikoidy. Potkanům s pozitivní kontrolou byly podány žaludeční sondou pilulky Jinkuishenqi a vysoké, střední a nízké dávkyCistanche Deserticola/WCD suspenze (1,646 g/(kg den), 5,48 g/(kg den), 2,74 g/(kg den), respektive 1,37 g/(kg den); slepým kontrolním (BC) a modelovým kontrolním skupinám (MC) byl podáván stejný objem destilované vody jako těm ve skupině s léčivem po dobu 40 po sobě jdoucích dnů v dávce 1 ml/100 g. Po posledním podání byla odebrána krev z abdominální aorty a sérové ​​hladiny T, CRH, ACTH, CORT, kortizolu, IL-10, IL-6, IL-2, TNF - a IFN-c byly měřeny. Byly vypočteny orgánové indexy brzlíku a sleziny. Exprese /e Bax, Bcl-2, kaspázy-3, Fas a FasL v nadledvince byla měřena imunohistochemicky. Patologické změny v brzlíku a nadledvince byly pozorovány pomocí HE barvení (×200). Podskupiny T lymfocytů v periferní krvi byly detekovány pomocí jiné cytometrie a exprese CaM mRNA v hypotalamu a tkáních hypofýzy byla také měřena pomocí RT-PCR. Výsledek. Ve srovnání se skupinou MC vykazovaly skupiny Cistanche Deserticola a WCD zvýšení aktivity, orgánového indexu brzlíku a sleziny, sérové ​​hladiny T, CRH, ACTH, CORT, kortizol, IL-2 a IL -10, poměr CD4 plus /CD8 plus a exprese Bcl-2, kaspázy-3, Fas, FasL a CaM ve tkáni hypofýzy. /ECistanche Deserticolaa WCD skupiny také vykazovaly snížení hladin IL-6, TNF- a IFN-c v séru a exprese CaM mRNA v hypotalamu. Závěry. Každá dávka přípravku Cistanche Deseticola a WCD by mohla působit proti dysregulovaným pohlavním hormonům a imunitním faktorům u potkaních modelů předávkovaných glukokortikoidy, a to zvýšením a obnovením účinnosti hypotalamických nervových buněk a zlepšenímimunitní funkce.

Úvod

Cistanche deserticola, který se nazývá "pouštní ženšen," je tradiční čínská medicína, která se po staletí používá jako jang-tonická bylina pro povzbuzení ledvin a posílení jangu [1]. V Číně bylo zaznamenáno osm druhů a jedna variace Cistanches Herba a pouze Cistanche deserticola YC Ma a Cistanche tubulosa (Schenk) Wight jsou zaznamenány v čínském lékopisu [2]. Farmakologické studie prokázaly, že Cistanches Herba vykazuje neuroprotektivní [3], imunomodulační [4], kardioprotektivní [5], protiúnavové [6], protizánětlivé [7], hepatoprotektivní [8], antioxidační [9], antibakteriální [10], laxativní [11] a protinádorové účinky [12]. Široké spektrum uváděných biologických aktivit tohoto rodu bylo připisováno složitému a rozmanitému fytochemickému složení. Cistanche deserticola obsahuje fenylethanoidní glykosidy, iridoidy, polysacharidy [13] atd. Obsah fenylethanoidových glykosidů je nejvyšší v původních léčivých materiálech [14]. Zpracování čínské Materia Medica (CMM) je tradiční farmaceutická technika pro splnění různých požadavků pro léčbu, dávkování a výrobu přípravků podle teorie tradiční čínské medicíny. Tyto zpracované produkty se nazývají odvarové kusy, které se používají na klinikách. Cílem zpracování je zvýšit účinnost a/nebo snížit toxicitu surových léčiv. Čínský lékopis z roku 2015 zaznamenal, že tlusté plátky Cistanche (CD) a Cistanche dušené v rýžovém víně (WCD) lze na klinice použít jako kousky odvaru. Naše výzkumná skupina prokázala, že po napaření Cistanche s rýžovým vínem došlo ke zmírnění laxativního účinku a zesílení účinků proti stárnutí a povzbuzení ledvin a jang [15].

Funkce osy hypotalamus-hypofýza-nadledviny-brzlík (HPAT) je u syndromu ledvin-jangové deficience narušena [16]. Pacienti s nedostatkem ledvin-yang mají také rozsáhlou imunitní dysfunkci. Dysfunkce osy HPA úzce souvisí s imunodeficiencí. Teorie neuroendokrinně-imunitní sítě (NEI) ukazuje, že imunitní a neuroendokrinní systém sdílejí mnoho ligandů a receptorů [17] a hypotalamus je považován za klíč spojující neuroendokrinní s imunitním systémem.

V této studii jsme replikovali deficit ledvin-yang u modelových potkanů ​​s exogenní injekcí kortikosteroidů a prozkoumali mechanismus deficitu ledvin-yang v reakci na různé zpracované produkty Cistanche deserticola z pohledu endokrinníhoimunitní funkce.

Materiály a metody

Materiály a činidla.

Cistanche deserticolabyla shromážděna od Alashana Neimenggu v roce 2019,5 a identifikovaná jako sušené masité stonky Cistanche deserticola YC Ma profesorem Yanjunem Zhaiem (Farmaceutická škola, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Čína). Vzorky voucherů byly uchovány v Liaoning Processing Engineering Technology Center.

Standardní sloučeniny jugolu byly zakoupeny od Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Čína); cistanosid F, echinakosid, cistanosid A a isoakteosid byly zakoupeny od společnosti Must Company (Sichuan China); akteosid byl zakoupen od Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Čína). Acetonitril a methanol jakosti MS byly zakoupeny od Merck KGaA (Darmstadt, Německo). Kyselina mravenčí pro HPLC byla zakoupena od Merck KGaA (Darmstadt, Německo). Rýžové víno bylo zakoupeno od Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Čína).

Kortikosteron (CAS: 50-22-6, čistota > 98 procent, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pilulky chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), krysí ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 a IL{6}} ELISA detekční soupravy byly zakoupeny od Nanjing Jian cheng Co., Ltd. ., krysí CD4 protilátka, CD8a protilátka (č. 561833 a 559976), RBC lyzát (Solarbio, R1010), PBS pufrovací roztok (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM a -actin upstream a downstream primery poskytla Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transscription Kit (č. RR037A) a cDNA Synthesis Kit (č. 10000068167) poskytla Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Chloroform, isopropanol, 75 procent ethanol, a uretanový roztok byly všechny analyticky čisté a vyrobené společností Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultračistá voda byla vyrobena systémem Milli-Q (18,2 MQ, Millipore, MA, USA).

Experimentální přístroje

Enzymový marker (Thermo, model 3530911931), automatická myčka destiček (model HBS- 4009), měřič síly s digitálním displejem (model VICTOR- 50N), vysokorychlostní mrazicí odstředivka (model Sigma 3k15 ), ultra mikrospektrofotometr (model B-50Q), genový zesilovač (model L96G), fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase (model StepOne), průtokový cytometr (model AC66051710132), parafínový mikrotom (model Laika), mikroskop (Olympus , model BS-53) a přístroj na čistou vodu (model F7JA36507).

Příprava vzorků pro UPLC-Q-TOF-MS a farmakologické experimenty.

WCD bylo zpracováno ze stejné šarže Cistanche deserticola v naší laboratoři. Pro přípravu WCD byly suché kousky CD (tloušťka 5 mm) (100 g) napuštěny rýžovým vínem (30 ml), napařeny při vysokém tlaku (1,25 kPa) po dobu 4 hodin a poté sušeny při 55 stupních.

Hrubé prášky CD a WCD byly namočené v 10krát 95% ethanolu po dobu 0,5 hodiny, extrahovány pod zpětným chladičem 3krát pokaždé po dobu 1 hodiny a přefiltrovány a filtráty z 3krát byly spojeny. ethanol byl získán za sníženého tlaku a extrakt byl získán pro podávání. Extrakt /e (1 ml) byl přidán do 50% methanolu, čímž byl celkový objem upraven na 20 ml, a skladován při 4 stupních pro analýzu obsahu.

Podmínky UPLC-QqQ-MS pro analýzu CD a WCD extraktů

Ke sběru a zpracování dat byl použit systém UPLC-MS/MS se softwarem MassLynx 4.1 Analyst. /e analytická kolona byla Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) při teplotě 40 stupně C. /e mobilní fází byl 0,1% vodný roztok kyseliny mravenčí (A) a acetonitril obsahující 0,1% kyseliny mravenčí (B). /e eluční gradient byl 0.00–1.{17}} min se 3 procenty B, 1,01–2.00 min se 3 procenty –11,5 procenty B, 2,01–3.{{{{101} 29}} min s 12 procenty B, 3,01–4.00 min s 15 procenty B, 4,01–5.00 min s 20 procenty B, 5,01–6.00 min s 22 procent B, 6,01–8.00 min s 25 procenty B a 8,01–9.{54}} min s 10 procenty B. Průtok /e byl 0,3 ml/min a vstřikovaný objem byl 1,0 μl.

V režimu záporných iontů byl použit Watersův trojitý čtyřnásobný hmotnostní spektrometr (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) vybavený zdrojem elektrosprejové ionizace (ESI). desolvatačním plynem byl dusík s průtokem 500 l/h při teplotě 250 stupňů. Všechny detekované sloučeniny byly měřeny v režimu monitorování více reakcí (MRM); V tabulce 1 jsou uvedeny energetické parametry a v tabulce 2 jsou uvedeny kalibrační křivky pro analyzované komponenty.

Příprava referenčních látek

Tubulosid A (3.02 mg), echinakosid (3.00 mg), 2'-acetylakteosid (2,34 mg), akteosid (2,45 mg), isoakteosid (0,61 mg), cis tanosid F (2,14 mg), salidrosid (3,39 mg), kyselina geniposidová (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) a katalpol (2,39 mg) byly rozpuštěny v methanolu za účelem přípravy zásobního roztoku. Zásobní roztok byl zředěn methanolem, aby se získaly vhodné koncentrace pro pracovní standardní roztoky. Všechny připravené roztoky byly před použitím skladovány při 4 stupních.

Příprava a seskupování zvířecích modelů

Potkaní samci SD (180–220 g) byli zakoupeni od společnosti Liaoning Chang sheng Biotechnological Co., číslo povolení pro zvířata: SCXK (Liao) 2015–0001. Všechny krysy byly udržovány s volným přístupem k potravě a vodě při teplotě 25 stupňů a relativní vlhkosti 30–50 procent. Zvířata byla chována 7 dní před experimenty.

Sto krys bylo náhodně rozděleno do 1{{30}} skupin: slepá kontrolní skupina (BC), modelová kontrolní skupina (MC), pozitivní kontrolní skupina (PC), kontrolní skupina s rýžovým vínem (WC), CD skupina s vysokou dávkou (CD-HD), skupina CD se střední dávkou (CD-MD), skupina CD s nízkou dávkou (CD-LD), skupina s vysokou dávkou WCD (WCD-HD), WCD se střední dávkou (WCD-MD ) skupina a skupina s nízkou dávkou WCD (WCD-LD). /e dávky CD-HD/WCD-HD, CD-MD/ WCD-MD a CD-LD/WCD-LD byly 5,48 g/(kg ∙ d), 2,74 g/ (kg ∙ d) a 1,37 g /(kg ∙ d), resp. /e dávka pro skupinu PC byla 1,646 g/(kg ∙ d) a pro skupinu WC 1 ml/100 g po dobu 40 dnů. /e 6. den po podání byla potkanům subkutánně injikována kortikosteronová voda (kortikosteron plus 0,1 procenta dimethylsulfoxidu plus 0,1 procenta Tween-80 plus 0,9 procenta sodíku chlorid) kromě skupiny BC [18]. koncentrace kortikosteronu byla 5 g/l a dávka byla 0,1 ml/100 g. /e krysám ve skupině BC byl injekčně podáván fyziologický roztok plus 0,1 procenta dimethylsulfoxidu plus 0,1 procenta Tween- 80 plus 0,9 procenta chloridu sodného injekcí ve stejné dávce.

Stanovení funkcí osy HPA

Test hmotnosti, teploty a přídržné síly:Každé 3 dny byl prováděn váhový test a každých 6 dní byla měřena teplota. během experimentu. 39. den byla změřena maximální síla zadní končetiny úchopovým metrem. Krysy byly umístěny na hladké plošiny tak, aby jejich zadní končetina chytila ​​tyč. Krysy instinktivně uchopí jakýkoli předmět, aby zabránily pohybu vzad, když je zataženo za ocas, dokud tažná síla nepřesáhne sevření. Když potkan ztratil sevření, předzesilovač mohl automaticky zaznamenat maximální sílu stisku.

Stanovení hladiny T, CRH, ACTH, CORT a kortizolu v séru: Jednu hodinu po posledním podání byly krysy anestetizovány intraperitoneální injekcí uretanového roztoku (20 g/100 ml). Byly odebrány vzorky krve, centrifugovány při 3500 r po dobu 15 minut, aby se získalo sérum, a skladovány při -20 stupních. Koncentrace T, CRH, ACTH, CORT a kortizolu byly měřeny pomocí souprav ELISA pro potkany podle pokynů výrobce.

Mikroskopická pozorování: Morfologická struktura tkáně nadledvin byla pozorována pomocí HE barvení. Tkáň nadledvin byla fixována v 10% paraformaldehydu, dehydratována v ethanolu, zprůhledněna roztokem xylenu, zalita konvenčními metodami, nařezána na plátky o tloušťce 4 μm, zbavena vosku roztokem xylenu, hydratována gradientem ethanolu a poté obarvena hematoxylinem a eosinem barvicí roztok. Po zprůhlednění xylenem byla destička uzavřena neutrální gumou a pozorována pod mikroskopem.

Imunohistochemické barvení exprese Bax, Bcl{0}}, kaspázy-3, Fas a FasL v nadledvinách

Řezy krysích nadledvin fixované ve formalínu a zalité v parafínu byly zbaveny parafinu a rehydratovány po nařezání na tloušťku 4 μm. Pro blokování aktivity endogenní peroxidázy byly řezy preinkubovány v bloku peroxidu vodíku po dobu 10 min. Řezy byly ponořeny do 0,01 M citrátu (pH 6,0) a zahřátý k varu. /e proces byl opakován po 5–10 minutách. Po ochlazení byly řezy 1–2krát promyty PBS (pH 7,2–7,6), ponechány při pokojové teplotě přibližně 5 minut a 2–3krát promyty PBS (pH 7,2–7,6). Při teplotě místnosti byl přidán 5% blokovací roztok BSA a přebytek kapaliny na řezu byl vytřepán o 20 minut později. Byly přidány naředěné primární protilátky specifické pro Fas/FasL, Bcl-2/Bax a kaspáza-3 (1:100 zředěné PBS) a inkubovány při 37 stupních po dobu 1 hodiny nebo 4 stupňů přes noc. Řezy byly promyty 2–3krát PBS (pH 7,2–7,6). /cs, byl přidán biotinylovaný kozí anti-myší IgG a řezy byly sušeny při 20–37 stupních po dobu 20 minut a promyty PBS (pH 7,2–7,6) 4krát po dobu 5 minut. Po důkladném promytí v PBS byly řezy inkubovány se směsí činidel A a B po dobu 30 minut, inkubovány s PBS po dobu 45 minut a nakonec vyvinuty s DAB substrátem (DAKO) po dobu 30 minut, než byly mírně kontrastně obarveny hematoxylinem, dehydratovány, a namontován.

Stanovení imunitních funkcí

Výpočet indexu imunitních orgánů:Jednu hodinu po posledním podání byly krysy anestetizovány intraperitoneální injekcí urethanového roztoku (20 g/100 ml) a poté byla odstraněna slezina a brzlík a okamžitě zváženy ve sterilní kukle. Hmotnostní koeficienty sleziny nebo brzlíku ( procenta ) hmotnost sleziny nebo brzlíku (mg)/tělesná hmotnost (g).

Experimentální výsledky

Analýza UPLC-QqQ-MSA:Pro dosažení nejlepší separace, tvaru píku a krátké doby analýzy byly v našem předběžném experimentu studovány chromatografické podmínky včetně kolony, mobilní fáze a gradientového programu. Typické chromatogramy s režimem MRM jsou uvedeny na obrázku.Z tabulky 4 jsme mohli vidět, že obsahy fenylethanolových glykosidů ve WCD se zvýšily ve srovnání s CD, zejména u echinakosidu a akteosidu, zatímco obsah iridoidů byl ve WCD snížen.

Regulace funkce osy HPA: Potkani ze skupiny MC a experimentálních skupin vykazovali příznaky deficitu ledvin-yang postupně po podání kortikosteronu. Symptomy, jako je úbytek hmotnosti, hypotermie, ztráta lesku vlasů, povislá nálada, zpoždění v reakci, významný pokles spotřeby vody a aktivity, se výrazně zlepšily ve skupinách CD a WCD. Obrázek 2(a) ukazuje změny hmotnosti. /e hmotnost každé z lékových skupin se zvýšila, zejména ve skupinách CD-HD a WCD-HD. Hmotnostní přírůstek ve skupině MC byl nejnižší. Obrázek 2(b) ukazuje změny teploty, které byly nejnižší ve skupině MC, a teplota se zvýšila ve skupinách WCD-HD, WCD-MD a WCD-LD.

Hladiny T, CRH, ACTH, CORT a kortizolu: Obrázek 3 ukazuje, že ve srovnání s hladinami ve skupině BC se hladina T, CRH, ACTH a CORT v potkaním séru snížila (P < 0.="" 01)="" a="" hladina="" kortizolu="" se="" snížila="" (p="">< 0.05)="" ve="" skupině="" mc.="" ve="" srovnání="" s="" hladinami="" ve="" skupině="" mc="" se="" zvýšila="" hladina="" t="" ve="" skupinách="" wcd-hd="" a="" wcd-md="" (p="">< 0.01),="" hladina="" crh="" ve="" skupinách="" wcd-ld,="" skupiny="" wcd-md="" a="" wc="" se="" zlepšily="" (p="">< 0,01),="" obsah="" acth="" se="" zvýšil="" ve="" skupinách="" cd-hd,="" wcd-md="" a="" wcd-hd="" (p="">< 0,01),="" úroveň="" cort="" se="" zvýšila="" v="" roce="" skupiny="" cd-md,="" wcd-md="" a="" wcd-hd="" (p="">< 0,01)="" a="" zvýšené="" ve="" skupinách="" cd="" hd="" a="" wcd-ld="" (p="">< 0,05)="" a="" hladina="" kortizolu="" se="" zvýšila="" v="" každé="" z="" lékových="">

Výsledky mikroskopického pozorování: Tkáň nadledvinek lze rozdělit na kortikální vrstvu a vrstvu dřeně. Kortikální vrstvy zahrnují globulární, svazkové a retikulární vrstvy. Buňky obsahují více lipidů a vrstva dřeně se skládá převážně z buněk feochromocytomu a malého množství vazivové tkáně. Jak je znázorněno na obrázku 4, zjistili jsme, že vše bylo normální ve skupině BC, zatímco ve skupině MC měla kůra nadledvin zjevnou hyperplazii, buněčnou atrofii a zvyšující se hustotu. Baňatý proužek zesílil a průsvitná fascikulární zóna, úzká zona reticularis a menší buňky vykazovaly nerovnoměrné zbarvení a překrvení kapilár. Ve skupině PC byly viditelné kortikální a medulární hranice. Buňky kulovitých a svazkových pruhů byly uspořádány rovnoměrně a morfologická struktura byla obnovena. Stejně lepší obnova byla pozorována ve skupinách WCD a účinky ve skupině WCD-MD byly lepší než u skupin WCD-HD a WCD-LD. Morfologie nadledvin ve skupinách CD nebyla tak dobrá jako ve skupinách WCD.

Imunohistochemie: Neuronální apoptóza je řízena mnoha apoptotickými a antiapoptotickými geny, zejména genem Bax podporujícím apoptózu a antiapoptotickými geny genové rodiny Bcl-2. Bcl-2 je lokalizován v reaktivních organelách produkujících kyslík, jako jsou mitochondrie, endoplazmatické retikulum a jaderné membrány. Bcl-2 má malý vliv na volné radikály kyslíku, ale může zabránit oxidativnímu poškození buněk. Bax transportuje z cytoplazmy do mitochondriální membrány, mění strukturu mitochondriální membrány a podporuje uvolňování cytochromu c a indukci apoptózy.

V cytoplazmě nadledvin došlo k expresi Bax a Bcl{{0}} proteinu. /e barvení ukázalo všechny žluté částice. Ve srovnání s BC skupinou se průměrná optická hustota Bax proteinu ve skupině MC významně zvýšila (P < 0,01).="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" mc="" se="" průměrná="" optická="" hustota="" ve="" skupinách="" cd-ld="" a="" wcd-ld="" významně="" snížila="" (p="">< 0,01)="" (obrázek="">Výsledky ukázaly, že CD a WCD mohou vyvolat apoptózu v zánětlivých buňkách a snížit poškození nadledvin podporou exprese proteinu FasL a vazbou na protein Fas, aktivací kaspázového{0}} proteinu a spuštěním kaspázové kaskády. Nejlepší byl účinek skupiny WCD-HD.

Stanovení imunitní funkce

Index imunitních orgánů

Ve srovnání s BC skupinou se koeficient brzlíku a index sleziny u skupiny MC významně snížily (P < {{0}}.01).="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" mc="" měla="" skupina="" wcd-md="" největší="" rozdíl="" (p="">< 0,05).="" koeficient="" brzlíku="" byl="" téměř="" zpět="" na="" normální="" úrovni.="" u="" indexu="" sleziny="" vykazovaly="" skupiny="" wcd="" md,="" wcd-ld="" a="" cd-md="" významné="" rozdíly="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" mc="" (p="">< 0,01)="" (viz="" obrázek="" 6).="" léčba="" wcd="" a="" cd="" tedy="" mohla="" chránit="" imunitní="" orgány="" a="" účinky="" wcd="" byly="">

Detekce podskupin T lymfocytů v periferní krvi

Procento CD4 plus buněk v levém horním kvadrantu a CD8 plus buněk v pravém dolním kvadrantu v BC a každé lékové skupině bylo vyšší než ve skupině MC. Ve srovnání s BC skupinou se poměr CD4 plus /CD8 plus významně snížil ve skupině MC (P < 0.01).="" ve="" srovnání="" s="" poměrem="" ve="" skupině="" mc="" se="" poměr="" cd4="" plus="" d8="" plus="" významně="" zvýšil="" ve="" skupině="" pc,="" skupině="" wcd="" a="" skupině="" cd-hd="" (p="">< 0,01)="" (obrázek="" 7).="" stanovení="" úrovně="" il{="" {12}},="" il-6,="" il-2,="" tnf-="" a="" ifn-c="" v="">

Obrázek 8 ukazuje, že ve srovnání s BC skupinou se hladina IL-6, TNF- a IFN-c významně zvýšila (P < 0,01).="" úroveň="" il-10="" a="" il-2="" se="" ve="" skupině="" mc="" snížila.="" ve="" srovnání="" s="" mc="" skupinou="" se="" hladina="" il-6,="" tnf-="" a="" ifn-c="" snížila="" a="" il-10="" a="" il{12}}="" v="" séru="" vzrostly="" v="" každé="" z="" lékových="" skupin.="" účinek="" wcd="" byl="" lepší="" než="" účinek="" cd,="" zejména="" ve="" skupině="" wcd-md,="" kde="" byl="" účinek="" blízký="" účinku="" skupiny="">

Výsledky experimentu pozorování tkáňového mikroskopu brzlíku

Obrázek 9 ukazuje, že ve skupině BC bylo přítomno velké množství lymfocytů. Lymfocyty a retikulocyty byly volně uspořádány uprostřed s rozptýlenými kulatými nebo oválnými thymocyty. nebyla žádná nekróza, žádná zánětlivá buněčná infiltrace a žádné abnormální změny.

Skupina MC vykazovala velké množství tkáně lymfoidní nekrózy, s neuspořádaným uspořádáním lymfocytů a retikulocytů ve středu. Kulaté nebo oválné thymocyty zmizely, byla evidentní masivní buněčná degenerace nebo nekróza a došlo k zánětlivé buněčné infiltraci s abnormálními patologickými změnami.

Ve skupinách CD se morfologické charakteristiky lymfocytů vrátily k normálu a uspořádání centrálních lymfocytů a retikulocytů bylo téměř normální. Kulaté nebo oválné thymocyty se obnovily, ale zůstalo malé množství degenerativních nebo nekrotických lymfocytů a infiltrujících zánětlivých buněk.

Ve skupinách WCD a PC skupině byly morfologické charakteristiky lymfocytů lépe opraveny. Lymfocyty a retikulocyty ve středu byly dobře zarovnány, kulaté nebo oválné thymocyty byly téměř normální, ale zůstal zde malý počet infiltrujících a degenerativních lymfocytů.

Genová exprese CaM proteinu

Hodnota RQ (CaM mRNA/-aktin mRNA) byla uvažována pro zkoumání exprese CaM mRNA. RQ skupiny BC bylo 1. Exprese CaM mRNA v hypotalamu ve skupině MC významně vzrostla (P < 0.01),="" zatímco="" hodnota="" se="" snížila="" u="" wcd-hd,="" skupiny="" wcd-md,="" wcd="" ld="" a="" cd-hd="" (p="">< {{10}}.05)="" (obrázek="" 10).="" exprese="" cam="" mrna="" v="" hypofýze="" ve="" skupině="" mc="" byla="" nižší="" než="" ve="" skupině="" bc="" (p="">< 0,01).="" exprese="" ve="" skupinách="" wcd-hd,="" wcd-md,="" wcd-ld,="" cd-hd="" a="" cd-ld="" se="" zvýšila="" (p="">< 0,05)="" a="" účinek="" ve="" skupinách="" wcd="" byl="" lepší="" než="" účinek="" ve="" skupinách="">

Diskuse

Čínský lékopis [2] uvádí, že CD a WCD mohou být použity na klinice jako hlavní typy odvarů. Po napaření s rýžovým vínem byly zesíleny protistárnoucí a tonizující ledvinovo-jangové účinky. Prostřednictvím UPLC-QqQ-MS jsme detekovali kvantitativní změny v chemické materiálové bázi během procesu paření rýžového vína. Iridoidní glykosidy byly nestabilní a obsah těchto glykosidů se snížil, dokonce se stal nedetekovatelným. Změnil se i obsah fenylethanolglykosidů, což mohlo vyvolat změny ve farmakodynamice a klinickém účinku.

Klasický model deficitu ledvin-yang byl replikován subkutánní injekcí kortikosteronu [19]. Předávkování kortikosteronem by mohlo inhibovat sekreci CRH v hypotalamu. Mezitím bylo také potlačeno tajemství ACTH. Snížila se hladina hormonu kůry nadledvin a tím byla snížena funkce osy HPA. Hypofunkce osy HPA je běžnou charakteristikou deficitu ledvin-yang [20]. Potom krysy vykazují fenomén "vyčerpání" a symptomy jsou v souladu s příznaky nedostatku ledvin-yang na klinice.

Ve skupině MC se hladina CRH, ACTH, T a CORT v potkaním séru významně snížila (P < 0,01).="" po="" léčbě="" cd="" a="" wcd="" se="" obsah="" crh,="" acth,="" t,="" cort="" a="" kortizolu="" do="" určité="" míry="" zvýšil="" a="" účinek="" wcd-md="" byl="" nejlepší,="" téměř="" stejný="" jako="" ve="" skupině="" pc.="" tyto="" výsledky="" ukázaly,="" že="" relativní="" hormonální="" rovnováha="" v="" ose="" hpa="" byla="" zničena="" ve="" skupině="" mc,="" cd="" a="" wcd="" by="" mohly="" zlepšit="" funkční="" zotavení="" abnormálních="" hladin="" hormonů="" osy="" nadledvin,="" ale="" účinek="" wcd="" byl="">

Modulace podílu členů rodiny Bcl{0}} je jedním ze základních mechanismů, kterými Fas/FasL zprostředkovává dráhu receptoru smrti, a rodina Bcl-2 reguluje mitochondriální dráhu [21]. Faktor Bcl-2 inhibující apoptózu a faktory indukující apoptózu, jako je Bax, všechny patří do rodiny Bcl-2 [22]. Buněčná apoptóza může být určena relativním poměrem faktorů inhibujících apoptózu a faktorů indukujících apoptózu [23]. Mitochondrie měly funkci centrálních kontrolních bodů pro mnoho forem apoptózy [24]. Současná studie ukázala, že CD-MD a WCD mohou odvodit expresi Bax a zvýšit Bcl-2, aby se zlepšil deficit ledvin-yang. Fas je hlavní receptor smrti, který indukuje apoptózu ligací s Fas ligandem (FasL) [25]. Exprese Fas a FasL ve skupině MC se zvýšila, zatímco tato exprese se významně zvýšila ve skupině WCD-MD (P < 0,01)="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" mc.="" oba="" systémy="" fas/fasl="" a="" bax/bcl-2="" přenášejí="" apoptotické="" signály="" do="" rodiny="" kaspáz="" [26].="" kaspáza{21}}="" je="" jednou="" z="" klíčových="" proteináz,="" které="" iniciují="" buněčnou="" apoptózu.="" aktivace="" kaspázy-3="" naznačuje,="" že="" apoptóza="" vstupuje="" do="" nevratného="" stadia="" [27].="" exprese="" kaspázy-3="" ve="" skupině="" mc="" se="" zvýšila="" a="" významně="" zvýšila="" ve="" skupinách="" wcd-hd="" a="" wcd-md="" (p=""><>

Nedostatekimunitní funkceje jedním z důležitých projevů ledvinovo-jangové deficience [28]. V této studii jsme zjistili, že index sleziny a brzlíku skupiny WCD-MD se významně obnovil (P < 0.01,="" p="">< 0.{{3{="" {32}}}}5).="" imunitní="" odpověď="" imunitního="" systému="" je="" regulována="" především="" podskupinami="" [29].="" il-2="" je="" růstový="" faktor="" pro="" t="" buňky,="" secernovaný="" t="" buňkami="" a="" makrofágy,="" účastní="" se="" zánětlivé="" regulace,="" reguluje="" imunitu="" a="" zvyšuje="" odolnost="" vůči="" infekcím="" [30].="" hladina="" il-2="" ve="" skupině="" mc="" se="" snížila="" (p="">< 0,01)="" a="" po="" léčbě="" cd="" a="" wcd="" se="" hladina="" il-2="" obnovila.="" il-6="" a="" tnf-="" jsou="" prozánětlivé="" cytokiny.="" zvýšené="" hladiny="" il-6="" a="" tnf-="" cytokinů="" způsobují="" nerovnováhu="" cytokinů="" a="" zhoršují="" zánět.="" hladiny="" il-6="" a="" tnf-="" se="" ve="" skupině="" mc="" zvýšily,="" zatímco="" po="" léčbě="" se="" hladiny="" il-6="" a="" tnf-="" snížily.="" t="" buňky="" se="" dělí="" na="" buňky="" cd4="" a="" buňky="" cd8="" a="" poměr="" cd4="" plus/cd8="" plus="" lze="" použít="" jako="" důležitý="" index="" imunitní="" regulace="" [31].="" cd4="" plus="" d8="" plus="" ve="" skupině="" mc="" zjevně="" poklesly="" (p="">< 0,01),="" zatímco="" ve="" skupinách="" wcd="" a="" cd="" hd="" vzrostly="" (p=""><>

HPA osa je nejdůležitějším regulačním systémem, protože reguluje sekreci glukokortikoidů a endokrinní systém pro udržení sekreční funkce kůry nadledvin [32]. Nadměrná exprese CaM mRNA v tkáni hypotalamu souvisela s nedostatkem jangu ledvin. CD a WCD by mohly blokovat vápníkové kanály, inhibovat expresi CaM mRNA v hypotalamu a snižovat příliv vápníku, čímž by se snížila aktivita komplexu Ca2 plus ·CaM.

Tvorba deficitu ledvin-yang má chronický proces vývoje onemocnění. Ledviny již nejsou čistě anatomickým pojmem a je to obecný termín pro neuroendokrinní imunitu a urogenitální systém. Neuroendokrinně-imunitní (NEI) síť je důležitým integrovaným regulačním systémem [33]. CD a WCD mohou regulovat funkci osy HPAT a zlepšit obnovu deficitu ledvin-yang. Tento výsledek poskytuje experimentální základ pro klinickou prevenci a léčbu deficitu ledvin-yang.

Reference

[1] Y. Zhang, H. Wu a SN Wang, "Porovnání funkcí výživy ledvin a posilování jangu u tří různých druhů Herba Cistanches," Čína J Chin Mater Med, sv. 19, č. 3, s. 169–171, 1994.

[2] Komise pro čínský lékopis, Lékopis Čínské lidové republiky: Jedno vydání, China Medical Science Press, Peking, Čína, 2015.

[3] M. Zhu, C. Lu a W. Li, "Přechodná expozice echinakosidu je dostatečná k aktivaci signalizace TrK a ochraně neuronálních buněk před rotenonem," Journal of Neurochemistry, sv. 124, č.p. 4, s. 571–580, 2013.

[4] LL Li, XW Wang, XF Wang a kol., "Glycosides of Cistanche anti-lipid peroxidation and anti-radiation effect," Traditional Chinese Medicine, sv. 22, č. 6, s. 364–367, 1997.

[5] E. Preutthipan, CF Ng, CM Koon, ECW Wong, B. Tomlinson a CBS Lau, "/e ochranný účinek Herba Cistanches na statinem indukovanou myotoxicitu in vitro," Journal of Ethnopharmacology, sv. 190, s. 68–73, 2016.

[6] HS Wong, J. Chen, PK Leong, HY Leung, WM Chan a KM Ko, „Herba snižuje přírůstek hmotnosti u obézních myší vyvolaných dietou s vysokým obsahem tuku, pravděpodobně prostřednictvím mitochondriálního odpojení,“ Journal of Functional Foods, sv. 10, s. 292–304, 2014.

[7] Y. Jia, Q. Guan, Y. Jiang a kol., "Zlepšení kolitidy vyvolané dextransulfátem sodným u myší pomocí echinakosidu obohaceného extraktu z Cistanche tubulosa," Phytotherapy Research, sv. 28, č. 1, s. 110–119, 2014.

[8] Y. Leung, L. Li, T. Wen a Y.-Q. Li, "Ochranné účinky echinakosidu na hepatotoxicitu u potkanů ​​vyvolanou chloridem uhličitým," Toxicology, sv. 232, č.p. 1-2, str. 50–56, 2007.

[9] JH Yang, JP Hu a NS Du, "Vztahy mezi strukturou a aktivitou fenylethanoidních glykosidů v rostlinách Cistanche salsa na antioxidační aktivitu," Journal of Chinese Medicine, sv. 32, č. 7, s. 1067–1069, 2009.

[10] XQ Han a YP Zhu, "Cistanche proces extrakce polysacharidů a výzkum bakteriostatického působení," J Anhui Agric Sci, sv. 37, č.p. 32, str. 15855-15856, 2009.

[11] PF Tu, ZG Zhang a ZQ Lou, "Analýza fenylethanoidních glykosidů Cistanche pomocí RP-HPLC," Acta Pharm Sin, sv. 32, č. 4, s. 294–300, 1997.