Strukturální a funkční pohledy na polymorfismus synukleinových vláken, část 3

4.3. -Syn kmeny ve vzorcích lidské synukleinopatie

Strukturální a funkční rozdíly pozorované u rekombinantních kmenů lze ověřit identifikací a charakterizací fibril přímo ze vzorků pacientů se synukleinopatií.

Rekombinantní kmeny se týkají mikrobiálních druhů, které byly rekombinovány na genetické úrovni. V této oblasti bylo dosaženo obrovského pokroku, který nám poskytuje mnoho příležitostí. Vědci přitom neustále studují vliv rekombinantních kmenů na člověka a životní prostředí. Výsledky výzkumů z posledních let ukázaly, že rekombinantní kmeny mají pozitivní vliv na lidskou paměť.

Studie zjistily, že rekombinantní kmeny mohou ovlivnit lidské kognitivní schopnosti a paměť zlepšením metabolické aktivity mikroorganismů ve střevech a zvýšením prospěšné flóry ve střevech. Tento komunikační mechanismus osy střevo-mozek se nazývá „interakce střeva a mozku“.

Konkrétně může rekombinantní kmen podporovat opravu hematoencefalické bariéry zvýšením prospěšné flóry ve střevě, čímž podporuje normální fungování mozku. Rekombinantní kmen byl navíc schopen zvýšit uvolňování dopaminu a neuropeptidů, které jsou kritické pro dlouhodobou paměť a učení.

Vědci proto naznačují, že by lidé měli jíst více potravin bohatých na probiotika a prebiotika, jako jsou jogurty, káva a celozrnné potraviny. Kromě toho mohou lidé probiotika ve střevech doplňovat také konzumací některých specifických rekombinantních kmenů, čímž dále podporují účinek interakce střeva a mozku.

Stručně řečeno, existuje pozitivní vztah mezi rekombinantními kmeny a pamětí. Lidé by měli přijmout některá účinná opatření na podporu komunikace mezi střevy a mozkem, a tím zlepšit svou paměť a kognitivní schopnosti. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche deserticola dokáže výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola dokáže regulovat i rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů. Tyto látky jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může Cistanche deserticola také zlepšit průtok krve a podporovat dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek dostává dostatek živin a energie, a tím zlepšuje mozkovou vitalitu a vytrvalost.

Klikněte na vědět doplňky pro zlepšení paměti

První důkaz o kmeni odvozeném z mozku přišel ze zásadní studie Prusineret al. [270], která prokázala, že mozkové extrakty z MSA jsou přenosné na transgenní myši a buňky, což vede k hojné patologii -Syn [270]. Na rozdíl od toho to nebylo pozorováno pomocí mozkových extraktů z PD, což naznačuje, že kmen odvozený od PD se může lišit od MSA [270].

Pak přichází otázka, co může vést -Syn k přijetí odlišné konformace v MSA nebo PD? In vitro různé podmínky roztoku (jako je přítomnost nebo nepřítomnost soli) vedou ke vzniku fibril s různými strukturními a funkčními vlastnostmi [29]. Podobně je -Syn také vystaven několika mikroprostředím in vivo, což ovlivňuje jeho agregaci [271].

Dopaminergní neurony u PD a oligodendrocyty postižené u MSA patří k různým buněčným liniím a mají odlišná buněčná prostředí. Lee a spolupracovníci prokázali, že odlišná intracelulární prostředí dvou buněčných linií ovlivňují tvorbu MSA a PD [34]. -Syn fibrily odvozené z GCIs v oligodendrocytech (GCI- -Syn) a LBs v neuronech (LB- -Syn) nemocných mozků se významně liší a vykazují odlišné schopnosti výsevu [34].

Kmen GCI- -Syn je ve srovnání s LB- -Syn vysoce účinný při nasazování – Synaggregation, čímž přispívá k agresivitě MSA [34]. Agregáty Syn byly také detekovány v biologických tekutinách, jako je cerebrospinální mok (CSF) a plazma pacientů s PD [272,273]. -Syn agregace začíná roky před nástupem skutečných symptomů onemocnění, a proto detekce těchto agregátů v raných stádiích může umožnit identifikaci a charakterizaci konkrétního kmene v těchto tekutinách.

V této souvislosti byla nedávno vyvinuta amplifikace agregátů -Syn z mozkových extraktů pacientů s PD a MSA pomocí techniky cyklické amplifikace proteinu misfolding (PMCA). Tato technika zahrnuje amplifikaci chybně složených proteinů in vitro, jako je amplifikace DNA pomocí PCR [274]. Skládá se ze střídavých cyklů inkubace a sonikace, jejichž výsledkem je replikace amyloidu.

Nejprve se stopové množství amyloidu inkubuje s přebytkem nativního proteinu, aby se indukoval růst polymeru. Poté je směs vzorku podrobena sonikaci, která rozbije fibrily, což má za následek několik jader.

Každé nově vytvořené jádro pak bude v dalším cyklu fungovat jako semeno a dále indukovat růst fibril. Tímto způsobem se po každém cyklu počet semen exponenciálně zvýší a umožní detekci nepatrného množství špatně složených agregátů přítomných na začátku [274]. Soto a spolupracovníci použili PMCA k amplifikaci -Syn agregátů z CSF pacientů s diagnózou PD a MSA [52].

Zjistili, že fibrily odvozené od PD a MSA vykazují odlišné biofyzikální a biochemické vlastnosti a odpovídají odlišným konformačním kmenům -Syn [52]. Ukázalo se, že i agregáty -Syn amplifikované z mozkových homogenátů PD a MSA vykazují různou toxicitu a neurodegeneraci u lidských dopaminergních neuronů, což odráží různou závažnost onemocnění pozorovanou u pacientů s PD a MSA v důsledku různých kmenů -Syn [275].

Tato zjištění přesvědčivě naznačují, že synukleinopatie lze rozlišit na základě typu kmene -Syn přítomného v mozku. Složitost detekce agregátů však nastává, když je u stejného onemocnění pozorována heterogenita mezi pacienty. Tato heterogenita v agregátech -Syn amplifikovaných z mozkových extraktů pacientů s PD je větší než v mozkových extraktech MSA [276].

Strohaker a kol. uvedli, že fibrily odvozené z PD a MSA nevykazují výrazně odlišné strukturální vlastnosti [276], na rozdíl od nálezů uváděných Sotem a spolupracovníky [52].

Možným důvodem protichůdných pozorování by mohly být rozdíly v protokolech PMCA používaných těmito dvěma skupinami [277]. Kromě toho Strohaker et al. použil mnohem menší velikost vzorků než Sotova skupina [52 276]. Další faktory, jako je genetické pozadí pacientů, věk vybraných pacientů, zatížení agregátů -Syn u různých pacientů, přítomnost dalších složek v extraktech a oblast mozku, odkud byla extrakce provedena, mohou být také odpovědné za tyto rozdíly [276].

Podobné rozpory existují také v oblasti patologie AD. Nedávné poznatky o vzorcích tau pocházejících z mozku naznačují, že heterogenita mezi pacienty v konformacích tau fibril existuje v rámci stejného onemocnění, AD [278]. Goedert a kolegové však pozorovali stejný typ konformace tau ve všech dosud analyzovaných případech AD, což naznačuje, že tau fibrily z jediné choroby (jako je AD nebo Pickova choroba) přijaly společný strukturální záhyb [218,219].

Ačkoli důvody a faktory, které řídí tuto strukturální specifičnost u tauopatií, nejsou jasné, mohlo by to být způsobeno více izoformami tau, PTM, interakcemi s jinými molekulami proteinů, kofaktory atd.

Nedávno Scheres a Godert představili hierarchickou klasifikaci taufibril z různých tauopatií na základě záhybů jejich filament [279]. Zda podobná klasifikace existuje pro -Syn fibrily izolované ze vzorků synukleinopatie, zbývá určit. Nedávno bylo vynaloženo velké úsilí na vyřešení struktury -Synderived z lidského mozku Schweighauserem et al., pomocí Cryo-EM [280].

Skupina zjistila, že vlákna -Syn z mozku pacientů s DLB se nekroutí a jsou tenčí než vlákna odvozená z mozku pacientů s MSA [280], což je v souladu s předchozími zjištěními [3]. Absence zkroucení ve fibrilách odvozených z DLB znemožňovala stanovení 3D struktury pomocí kryo-EM a rozdíly ve fibrilách -Syn odvozených od pacientů s MSA a DLB byly nakresleny na základě dvourozměrného průměrování tříd [280].

Ačkoli potřebujeme více struktur s vysokým rozlišením odvozených od pacientů se synukleinopatií, abychom dosáhli definitivního závěru, současné zprávy jistě posilují tvrzení o existenci odlišných typů fibril -Syn.

Navíc struktury filament -Syn z případů PD nejsou zatím dostupné, ale jejich řešení v budoucnu může významně pomoci pochopit mechanismus onemocnění a vytvořit terapeutické přístupy proti synukleinopatiím.

5. Strukturální modely existujících -Syn fibrilních kmenů s vysokým rozlišením

Dosud byly použity různé biofyzikální techniky, jako je ssNMR, mikroelektrondfrakce, EPR, cirkulární dichroismus (CD), výměna vodík/deuterium NMR (HDXNMR) a kryo-EM, ke stanovení struktury -Syn fibril při různých rozlišeních.

Tyto techniky položily základ polymorfismu na molekulární úrovni ve fibrilách. Struktura -listu jádra fibril pomocí ssNMR odhalila dvě fibrily, formu A a formu B, postupným přiřazením 48 zbytků jádra [56].

Studie objasnila přítomnost dvou polymorfů fibril, které se mohly vytvořit v důsledku různých mechanismů fibrilace [56]. Podobně dvě kontrastní fibrilové struktury, 'stuhy' a 'fibrily', generované in vitro, vykazovaly rozdíly v délce, distribuci a počtu -listových prvků v jejich fibrilové struktuře analyzované pomocí ssNMR [29].

Nicméně, navzdory několika pokusům, jak se polymorfy -Syn fibril liší v atomové struktuře, zůstalo velkou neznámou. Revoluce ve strukturním polymorfismu přišla poté, co byla struktura -Syn fibril vyřešena pomocí kryo-EM na atomární úrovni rozlišení. Stahlberg a skupina odhalili, že fibrily -Syn (zbytky 1–121) se skládají ze dvou identických protofilament [61].

-Plátky z každého protofilamentu interagují a stabilizují strukturu pomocí hydrofobní geometrie zipu [61]. Je pozoruhodné, že zbytky 50–57 umístěné na rozhraní protofilament jsou také místem familiárních PD mutantů (A53T/V/E), H50Q a G51D [61]. V tomto ohledu se předpokládalo, že tyto mutace mohou změnit fibrilární strukturu, což povede k různým typům fibril.

Následné kryo-EM studie struktury plné délky -Syn ukázaly rozdíl v chiralitě a šroubovicovém zkroucení [281] ve srovnání s C-terminální zkrácenou fibrilární strukturou -Syn (zbytky 1–121) [61]. Předpokládalo se, že tyto rozdíly ve strukturách fibril plné délky (1–140) a C-koncově zkrácených fibril mohou být způsobeny polymorfismem fibril.

Přímý důkaz těchto teorií byl získán nedávnými zásadními studiemi, které použily kryo-EM k vymezení modelů polymorfů -Syn fibril. Li a kol. identifikovali dva polymorfy fibril, „tyč“ a „twister“, se společnou strukturou jádra protofilament, ale odlišnými rozhraními mezi protofilamenty [57]. Twisterové polymorfy vykazují uspořádaný ohnutý- -archmotiv, zatímco tyčové polymorfy rekrutují některé další zbytky, aby vytvořily motiv „řeckého klíče“, jak uvádí i jiné skupiny [55,61,281].

Existence polymorfů ve formách rodand twister naznačuje, že rozdíly v balení stejné struktury jádra mohou vést k polymorfismu. Podobná pozorování byla také učiněna pro další amyloidní proteiny, jako je -amyloid a tau, kde protofilamenta se stejnou strukturou jádra, ale odlišným uspořádáním balení vedou k polymorfním strukturám [40,282].

Dále, dvě nové polymorfní formy -Syn fibril generované in vitro, nazvané polymorfy 2a a 2b, v tomto pořadí, se liší od dříve uváděných polymorfů 1a a 1b [57,61,281]. V polymorfu 1a [61] jsou interakce mezi zbytky na rozhraní protofilament je zprostředkováno vytvořením hydrofobní geometrie sterického zipu, zatímco u polymorfů 2a a 2b jsou zprostředkovány solnými můstky [41,61].

Bližší prozkoumání strukturních rozdílů mezi polymorfy 1a/1b a novými polymorfy 2a/2b odhalilo další rozdíly v uspořádání motivů -oblouku, které mění rozhraní protofilament mezi polymorfy 1 a 2 [41].

Tyto studie posilují hypotézu, že stejný prekurzorový protein -Syn se může in vitro sestavit do mnohočetných polymorfů fibril, které se od sebe radikálně liší, pokud jde o atomové rozlišení. Goedert a jeho kolegové nedávno studovali kryo-EM struktury tau fibril odvozených z Alzheimerovy a Pickovy choroby mozky pacientů [40,218,219].

U obou onemocnění našli odlišné záhyby filament tau, což naznačuje, že u různých tauopatií existují různé konformery tau. Stejná skupina uváděla dva typy vláken -Syn, typ I a typ II, z mozků jedinců trpících MSA [280]. Zjistili, že každé vlákno je tvořeno dvěma neidentickými protofilamenty.

Dutina vytvořená těsným zabalením protofilament uzavírá další molekuly, které je třeba ještě určit [280]. Průměrování třídy 2D také odhalilo různé fibrily od pacientů s MSA a DLB, což naznačuje existenci odlišných konformerů spojených se synukleinopatií.

Dále by bylo zajímavé zeptat se, zda fibrily získané od pacienta vykazují nějakou úroveň podobnosti s fibrilami generovanými in vitro. Charakterizace na molekulární úrovni a srovnání vzorků fibril pocházejících z mozku s fibrilami vytvořenými in vitro odhalilo, že tyto dva jsou strukturálně odlišné [276,280]. Hlavním rozdílem mezi MSA-odvozenými a syntetickými vlákny je velikost a uspořádání protofilament ve fibrilách MSA [280].

Kromě toho vědci používají drsné podmínky k vytvoření a izolaci syntetických fibril, jako je míchání, koncentrace soli atd., které ovlivňují uspořádání a uspořádání vláken [10,283–285]. V důsledku toho je obtížné korelovat výsledky in vitro se scénáři in vivo.

Na druhé straně lze získat předem vytvořené fibrily pouze ze vzorků extrahovaných nemocí, ale nemusí pochopit, jak vznikly a jaké faktory řídily tvorbu různých fibril v různých vzorcích mozku. Je náročné izolovat přechodné toxické druhy nebo meziprodukty ze vzorků mozku, abychom pochopili patogenezi onemocnění.

V důsledku toho se musíme spoléhat na vzorky in vitro, abychom vymezili mechanismy fibrilace, dráhy a kinetickou analýzu. Podobně musíme otestovat totéž pomocí fibril odvozených z mozku, abychom vytvořili rozsáhlejší znalostní základnu. Celkově by struktury polymorfů -Syn s vysokým rozlišením mohly pomoci výzkumníkům v jejich hledání potenciálních terapeutických cílů.

Je však nutné důkladné prozkoumání, abychom pochopili dopad buněčných podmínek, mutací, PTM, přítomnosti kofaktorů atd. na strukturu -Syn fibril a spojení různých polymorfů fibril s klinickou variabilitou pozorovanou u PD.

6. Familiární mutace -Syn formy odlišných vláknitých konformací

-Syn oligomerizace a agregace jsou spojeny s patogenezí PD. V genu SNCA bylo dosud objeveno sedm familiárních missense mutací souvisejících s časným a pozdním nástupem PD [83–90].

Mezi těmito mutacemi spojenými s PD E46K, H50Q, A53T a nově objevené mutanty A53V zrychlují rychlost agregace -Syn, zatímco mutace A30P, G51D a A53E zpomalují kinetiku agregace in vitro [91,93,96]. souvislost mezi rychlostí agregace (in vitro) a věkem počátku onemocnění (in vivo) není přímočará [103].

Ačkoli oligomery vytvořené během raných fází agregační kinetiky jsou potenciálně toxické [286], pouze A30P vykazuje rychlejší oligomerizaci a opožděnou konverzi oligomerů na fibrily [102]. G51D na druhé straně vykazuje pomalou oligomerizaci a pomalou tvorbu fibril [287,288], přesto je spojen s časným nástupem onemocnění.

Kvůli této složitosti chování familiárních mutantů je náročné nastavit jednotící mechanismus, kterým způsobují onemocnění. Předchozí zprávy naznačovaly, že -Syn přijímá helikální strukturu po vazbě s membránami in vivo [289,290].

Jakákoli změna jedné aminokyseliny v N-koncové doméně -Syn může změnit schopnost vázat membránu a zvýšit cytosolovou koncentraci proteinu podporou rychlejší agregace [291,292]. Údaje o vazbě na membránu familiárních mutantů -Syn z naší laboratoře [92] a dalších [110,288,292,293] ukázaly, že mutanty H50Q, A53T a E46K vykazují zvýšenou membránovou vazbu, zatímco mutanty A53E, G51D a A30P vykazují sníženou membránovou vazbu.

To naznačuje, že, podobně jako u agregace, schopnost vázat membránu nekoreluje se zvýšenými sklony k onemocnění familiárními mutacemi -Syn. Proto existuje nedostatek korelace mezi agregací a schopností vázat membránu se skutečnou patogenezí onemocnění způsobenou familiárními mutanty -Syn.

To vyvolává otázku, jak bodová mutace v nativně nestrukturovaném proteinu vykazuje drastické rozdíly v nástupu a progresi onemocnění. Domníváme se, že by mohlo být možné, že různé mutanty -Syn produkovaly různé typy a množství oligomerů a také mohou jedinečně měnit očkovací kapacitu proteinu divokého typu [103].

Proto mutanty ovlivňují nejen celkovou rychlost agregace proteinu, ale také mikroskopické kroky podílející se na tvorbě amyloidu, tj. iniciaci a amplifikaci -Syn prostřednictvím sekundárního nukleačního procesu [294]. Zajímavé je, že Lazaro et al. zjistili, že navzdory tomu, že mají identickou náchylnost k oligomerizaci v kultivovaných buňkách, A30P, E46K, H50Q, G51D a A53T vykazují odlišné schopnosti tvořit kluze [295]. A30P vykazoval snížený sklon k tvorbě inkluzí v buňkách, zatímco mutanty E46K a G51D vykazovaly opačný účinek [295].

Inkluzní formace v buňkách [295] opět nekorelovala se sklonem k agregaci mutants in vitro [12,91–93,102]. Řešení těchto otázek o tom, jak divoký typ -Syn a jeho mutanty přispívají k časnému a pozdnímu nástupu PD, se tedy stává důležitým pro pochopení rozdílné patogeneze synukleinopatií.

Tvorba fibril je vysoce citlivá na změny v lokálním a/nebo globálním mikroprostředí proteinu. To naznačuje, že změna jedné aminokyseliny může vést k polymorfismu v důsledku odlišné místně specifické konformační dynamiky, jak je ukázáno u divokého typu a fibril E46K, A30P a A53T [296]. V této souvislosti Knowles a spolupracovníci nedávno studovali systematické srovnání -Syn a jeho s onemocněním asociovaných mutantů pomocí biofyzikálních technik [297]. Mutanty PD generují polymorfy fibril s odlišnou morfologií a sekundárními strukturami ve srovnání s proteinem divokého typu [297].

Několik zpráv nezávisle potvrdilo, že různé -Syn mutanty tvoří fibrily s charakteristickou morfologií odhalenou transmisní elektronovou mikroskopií (TEM) a mikroskopií atomární síly (AFM), jedinečnými obrazci rentgenové difrakce (XRD) a rozdíly v prvcích sekundární struktury (obrázek 4A, B).

Kromě toho je rozhraní dvou protofilament ve struktuře -Syn fibril tvořeno zbytky 50–57, které také obsahují tři familiární mutace [61]. To naznačuje, že i jednobodová mutace může změnit dynamiku a balení protofilament.

Bližší prohlídka fibril tvořených mutanty pomocí cryo-EM [298–300] odhalila plasticitu těchto fibril ve smyslu zkroucení, počtu interagujících protofilament, uspořádání balení, prvků sekundární struktury a kvartérního tvaru atd. (obrázek 4C, D. Boyer a jeho skupina studovali mutanty H50Q a našli úzké (1c) a široké fibrily (1d) s jedním nebo dvěma protofilamenty [300].

Navzdory sdílení stejné struktury konzervovaného jádra, jaká byla dříve popsána pro divoký typ -Syn, mutantní fibrily vykazovaly nové uspořádání protofilament a sítě vodíkových vazeb [300]. Dále A53 leží ve středu rozhraní interagujících protofilament v divokém typu -Syn [61] a je také horkým místem pro mnoho bodových mutací [16,89,90].

Studie Cryo-EM s N-koncově acetylovaným mutantem A53T neodhalily žádnou změnu v záhybu divokého typu -Syn [299]. Mutace však narušuje interakce zbytků a přeuspořádává orientaci rozhraní protofilament, což má za následek odlišné typu fibril [299]. To by mohl být i případ dalších dvou mutací A53, tj. A53E a A53V, ale tato možnost musí být teprve objevena.

Kryo-EM modelování fibril tvořených mutací E46K také podpořilo převažující hypotézu. Odhalila tvorbu fibrilových polymorfů s odlišným uspořádáním protofilament a rozhraními ve srovnání s divokým typem -Syn [298,301]. Kromě toho vytvořila stabilnější a patogennější variantu divokého typu -Syn [298]. Celkově tyto studie naznačují, že balení protofilament a rozhraní jsou rozhodující při určování struktury fibril.

Každá familiární mutace se může chovat jako kmen -Syn, jedinečně mění strukturu a dynamiku výsledných fibril. Tyto rozdíly ve struktuře fibril mohou vést k různým klinickým a patologickým výsledkům, a tím přispívat k heterogenitě onemocnění u synukleinopatií.

For more information:1950477648nn@gmail.com