SLC37A2, Molekula související s fosforem se zvyšuje v buňkách hladkého svalstva v kalcifikované aormě

Cévní kalcifikaceje hlavním zdrojemkardiovaskulární onemocněníu pacientů s chronickým onemocněním ledvin.Hyperfosfatemievede ke zvýšenému přílivu intracelulárního fosforu, což vede ke zvýšení počtu buněk podobných osteoblastům v buňkách hladkého svalstva cév. PiT-1 přenáší fosfát do buněk hladkého svalstva cév. Mechanismus kalcifikace cév však není zcela objasněn. Tato studie zkoumala kandidátní molekuly související s fosforem jiné než PiT-1. Předpokládali jsme, že molekuly související s fosforem patřící knosič rozpuštěné látky(SLC) superrodina by se podílela na vaskulární kalcifikaci. Jako výsledek analýzy DNA microarray jsme se zaměřili na SLC37A2 a ukázali jsme, že mRNA exprese těchto buněk se zvýšila na kalcifikovaných buňkách hladkého svalstva aorty (AoSMC). Bylo popsáno, že SLC37A2 transportuje výměny glukóza-6-fosfát/fosfát a fosfát/fosfát. In vitro analýza ukázala, že exprese SLC37A2 nebyla ovlivněna zánětem na AoSMC. Exprese SLC37A2 mRNA a proteinu se zvýšila v kalcifikovaných AoSMC. In vivo analýza ukázala, že exprese mRNA SLC37A2 v aortěchronické onemocnění ledvinkrys byl korelován s osteogenními markerovými geny. Kromě toho byl SLC37A2 exprimován v oblasti vaskulární kalcifikace vu potkanů ​​s chronickým onemocněním ledvin. V důsledku toho jsme ukázali, že SLC37A2 je jednou z molekul, které se zvyšujívaskulární kalcifikacein vitro a in vivo.

Klíčová slova: SLC37A2,vaskulární kalcifikacebuňky hladkého svalstva aorty,chronické onemocnění ledvin, hyperfosfatémie

KLIKNĚTE ZDE A ZÍSKEJTE PŘÍRODNÍ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 25 % ECHINAKOSIDU A 9 % AKTEOSIDU PRO FUNKCI LEDVIN

Supporting Service Of Wecistanche-Největší vývozce cistanche v Číně:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pro další specifikace Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Jako počet pacientů schronické onemocnění ledvin(CKD) se zvyšuje, počet pacientůvyžadující dialýzuse také zvýší. Většina úmrtí u pacientů podstupujícíchdialýzajsou kvůlikardiovaskulární chorobyjakosrdeční selhání, cerebrovaskulární poruchynebo infarkt myokardu. (,2) Hlavním zdrojemkardiovaskulární onemocněníje ektopická kalcifikace,() abnormalita způsobená tvorbou a ukládáním krystalů fosforečnanu vápenatého v měkkých tkáních. (4 6) Různé faktory, jako je zánět. oxidační stres a zvýšení hladin plazmatického vápníku (Ca) a fosforu (P) se podílí na progresi vaskulární kalcifikace. Z těchto faktorů je hyperfosfatemie nejsilněji spojena s vaskulární kalcifikací. (7.8) Hyperfosfatemie je způsobena nadměrným příjmem P za přítomnosti snížené funkce ledvin. Pacienti podstupující dialýzu proto potřebují omezit příjem P. (79-12). Bylo však hlášeno, ževaskulární kalcifikacepostupuje již při zahájení dialýzy; byl také pozorován u pacientů s časným stádiem CKD, kdy hyperfosfatemie není evidentní. (3) V důsledku toho je důležité předcházet vaskulární kalcifikaci u pacientů s časným stádiem CKD, aby se zlepšila životní prognóza.

což vede ke zvýšenému přílivu P do buněk hladkého svalstva cév (VSMC). Influx P se provádí prostřednictvím PiT-1, transportéru na povrchu buněčné membrány VSMC. PiT- je členem superrodiny nosičů rozpuštěných látek (SLC), která zahrnuje transportér fosforečnanu sodného kódovaný SLC20A1.04 PiT- transportuje fosfát přes buněčné membrány závislé na Na a následně mineralizaci matrice díky zvýšeným hladinám p.s) Jako intracelulární Hladina P se zvyšuje, VSMC začíná exprimovat osteogenní transkripční faktory, jako je transkripční faktor 2 (Runx2) související s runt(16) Tento účinek je následován zvýšenou expresí genů specifických pro osteoblasty, jako je osteopontin a osteokalcin. Kromě toho snižuje expresi proteinů specifických pro hladké svaly. jako je protein hladkého svalstva 22-0 (SM22-0). V důsledku toho se VSMC transformuje na buňky podobné osteoblastům. (1718) Nedávné klinické studie ukázaly, že hladina vápníku v krvi. proteinové částice (CPP), které představují koloidní částice fosforečnanu vápenatého, přibývají s klesající funkcí ledvin. (19-21)Kromě toho byly hlášeny korelace s hladinami CPP a P v krvi.2o2i) Je možné, že CpP může spustit progresi vaskulární kalcifikace.22-24)

U pacientů s CKD v časném stadiu s normálními hladinami P v plazmě však byla pozorována vaskulární kalcifikace. (13) Kromě toho je mRNA PiT-1 exprimována všudypřítomně ve všech tkáních. Jiná molekula tedy může působit primárně v oblasti vaskulární kalcifikace. Existují zprávy, žezánětpodporuje kalcifikaci cév. Zánětlivé faktory, jako je interleukin (IL)-1B, IL-6, a tumor nekrotizující faktor-alfa (TNF-a) indukované diferenciaci VSMC na buňky podobné osteoblastům (2s26) TNF-a indukuje vaskulární kalcifikaci prostřednictvím cAMP dráhy, která hraje roli v diferenciaci osteoblastů.2728) IL-6 reguluje různé dráhy vedoucí k vaskulární kalcifikaci VSMC2-31) Dále. IllB, IL-6 a TNF-a jsou také faktory spojené se zvýšenou vaskulární kalcifikací vyvolanou vysokými hladinami p.3233) Nicméně. současné údaje plně nevysvětlují mechanismus vaskulárního

kalcifikace vyvolaná těmito faktory. Předpokládali jsme, že by mohly existovat další molekuly související s P, jako jsou ty v superrodině SLC, které se podílejí na vaskulární kalcifikaci. Zaměřili jsme se na membránové proteiny v superrodině SLC a zkoumali jsme potenciální kandidátské molekuly související s P jiné než PiT-1 pro zapojení do vaskulární kalcifikace. Dále jsme zkoumali vztah mezi kandidátními molekulami a vaskulární kalcifikací ve videu a in vivo.

Materiály a metody

Buněčná kultura. Normální lidské buňky hladkého svalstva (AoSMC) byly získány od Lonza (Basilej, Švýcarsko) AoSMC byly kultivovány podle pokynů výrobce. AoSMC byly udržovány v růstovém médiu (bazální médium pro buňky hladkého svalstva doplněné 5% fetálním bovinním sérem (FBS), epidermálním růstovým faktorem, inzulínem, fibroblastovým růstovým faktorem-B a gentamicinem/amfotericinem-B). Média se měnila každý druhý den. AoSMC byly pěstovány ve zvlhčeném 5% CO inkubátoru při 37 stupních a udržovány, dokud nebylo dosaženo konfluence, a poté použity v experimentech.

Kalcifikace AoSMC. Kalcifikace AoSMC byla indukována, jak bylo popsáno dříve.435) AOSMC byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu doplněném 15% FBS a penicilin-streptomycinem a kultivovány s 2,6 mM P po dobu 3, 6, 9, 12 a 14 dnů. Koncentrace P byla upravena pomocí P pufru NaH, PO/Na a HPO. pH 7,2). Jiné AoSMC nebyly kultivovány s 2,6 mM P.

DNA microarray. Byla použita celková RNA vzorků AoSMC kultivovaných a nekultivovaných s 2,6 mM P. Celková RNA 5.0 ug byla analyzována pomocí DNA microarray (Agilent Technologies, Tokyo. Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray bylo použito k prozkoumání asi 26,000 genů. Poměr byl vypočten dělením úrovně exprese AoSMC kultivované s 2,6 mM po dobu 12 dnů úrovní exprese AoSMC nekultivované s 2,6 mM P

DNA mikročip

Byla použita celková RNA vzorků AoSMC kultivovaných a nekultivovaných s 2,6 mM P. Celková RNA 5.0 ug byla analyzována pomocí DNA microarray (Agilent Technologies, Tokyo. Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray bylo použito k prozkoumání asi 26,000 genů. Poměr byl vypočten dělením úrovně exprese na AoSMC kultivovaných s 2,6 mM po dobu 12 dnů úrovní exprese na AoSMC nekultivovaném s 2,6 mM P. Exprese SLC37A2 při vaskulárním zánětu. K vyvolání zánětlivé reakce v AoSMC byly buňky kultivovány s růstovým médiem, dokud nedosáhly konfluence, a poté ošetřeny 1 ugmL lipopolysacharidů (LPS) (LPS z escherichia coli 0111:B4; Sigma, St. Louis, MO) po dobu 24 a 72 bez 2,6 mM P. Jiné AoSMC nebyly kultivovány analýzou polymerázové řetězové reakce (PCR) v reálném čase. Celková RNA byla extrahována z AoSMC ošetřených LPS po dobu 24 a 72 hodin a buněk neošetřených LPS. Kvantitativní PCR v reálném čase na bázi SYBR green byla provedena pomocí syntetizované cDNA a vhodné sady primerů pro každý cílový gen pomocí systému PCR v reálném čase StepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Sekvence primerů byly následující: lidský IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' a 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; lidský SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' a 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- a 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 a SLC37A2 hladiny exprese mRNA byly vypočteny po normalizaci pomocí GAPDH37A2. Exprese v SLC AoSMC. Total byly extrahovány z AoSMC nekultivovaných s 2,6 mM P a AoSMC buněk kultivovaných s 2,6 mM P po dobu 3, 6, 9, 12 a 14 dnů. PCR v reálném čase byla provedena s použitím syntetizované cDNA. Sekvence primerů byly jako následuje: lidský Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' a 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Hladiny exprese mRNA Runx2 a SLC37A2 byly vypočteny po normalizaci pomocí APPH.

Western blotting analýza.

Celkový protein byl shromážděn ze vzorků AoSMC kultivovaných za stejných podmínek jako pro analýzu PCR v reálném čase. Tyto vzorky byly lyžovány pomocí Tris-pufrovaného fyziologického roztoku (pH 75) doplněného 5% NP-40 a 1% koktejlem inhibitoru proteázy. Vzorky koncentrace proteinu byly měřeny pomocí soupravy BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). a koncentrace byla upravena westernovým přenosem, 10 ug proteinu bylo separováno v 10% polyakrylamidovém gelu pomocí elektroforézy na dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu sodného. Membrána byla ošetřena protilátkou SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) nebo protilátkou GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) jako primárními protilátkami, inkubována s protilátkou konjugovanou s králičí lgG křenovou peroxidázou (R&D Systems, Minneapolis, MN) jako sekundární protilátkou a vizualizovány pomocí Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Anglie) a analyzátoru luminiscenčního obrazu (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokio, Japonsko). Pás byl kvantifikován pomocí lmagelu.

Experimentální

Všechny protokoly studie byly schváleny etickou komisí University of Hyogo, School of Human Science and Environment. Dvanáctitýdenní samci krys Sprague-Dawley byli zakoupeni od Japan SLC (Shizuoka, Japonsko). Krysy byly chovány v cyklu 12-světlo, 12-h tma (09:00-21:00) a byl jim umožněn volný přístup k potravě a extra čisté vodě.

Experimentální diety zahrnují kontrolní dietu P (1.0% P, 0.6Ca, 20% bílkovin), adeninovou dietu (0,75% adeninu , 1.0% P, 0,6%Ca, 2,5% bílkovin), dieta s nízkým P (LP) (0,2% P,0 0,6 % Ca, 10 % bílkovin) a dieta s vysokým obsahem P (HP) (1,0 % P, 0,6 % Ca, 10 % bílkovin) založená na dietě AIN93-G (orientální Kvasinky, Tokio, Japonsko) s kaseinem jako zdrojem bílkovin.3637) Bylo popsáno, že dieta s nízkým obsahem bílkovin podporuje vaskulární kalcifikaci u potkanů ​​s adeninem indukovaným selháním ledvin, takže byla provedena restrikce proteinů.3738)Před zařazením do skupin byli všichni potkani (n=23) byli týden krmeni standardní MF stravou (orientální kvasnice), aby se aklimatizovali. Ve věku 13 týdnů byli potkani rozděleni do 2 skupin: kontrolní skupina (n=5) a skupina s adeninem indukovaným CKD (n=18). Kontrolní skupina dostávala kontrolní P dietu po dobu 6 týdnů . Skupina s adeninem indukovaným CKD dostávala adeninovou dietu asi 3 týdny a poté byla dále rozdělena do 2 podskupin: skupina CKD-LP (n=8) nebo skupina CKDHP (n=10). Potkani ze skupiny CKD-LP a skupiny CKD-HP dostávali LP dietu a HP dietu po dobu 3 týdnů, respektive během experimentálního období, příjem potravy byl zaznamenáván denně. Během adeninové diety byly vzorky krve odebírány z ocasní žíly mezi 10:{46}} a 11:{48}} jednou týdně do druhého týdne a poté jednou za 2 dny za účelem sledování plazmatických hladin. Během LP diety nebo HP diety byly vzorky krve odebírány jednou týdně. Jednou týdně byly odebírány vzorky moči a zaznamenáván objem moči. Krysy byly usmrceny anestetikem s použitím isofluranu (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japan) a laparotomií. Vzorky krve odebrané z dolní duté žíly a torakoabdominální aorty byly odebrány pro analýzu.

Exprese SLC37A2 na aortě.

Přibližně jedna třetina odebrané torakoabdominální aorty byla použita k vizualizaci kalcifikace a imunobarvení. Aorta byla ponořena do parafínu a byly vyříznuty 4-um řezy. Řezy byly obarveny za použití soupravy Von Kossa Method for Calcium Kit (Polysciences. Warrington, PA) podle pokynů výrobce. analýza imunobarvení byla provedena se sériovými řezy. Řezy byly inkubovány s protilátkou SLC37A2 přes noc při 4 stupních a poté ošetřeny pomocí Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokio, Japonsko) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Poté byly řezy ošetřeny soupravou DABsubstrate kit (Nichirei).

Celková RNA byla extrahována ze zbytku zmrazené torakoabdominální aorty. PCR v reálném čase byla provedena za použití syntetizované cDNA. Sekvence primerů byly následující: potkaní osteo-pontin,5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' a 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' a; potkaní SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' a 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Hladiny exprese mRNA osteopontinu a mRNA SLC37A2 byly vypočteny po normalizaci pomocí GAPDH

Statistická analýza.

Data jsou uvedena jako průměr + SE. Rozdíly mezi skupinami byly analyzovány pomocí t-testu. V experimentech s kalcifikovanou AoSMC indukovanou fosfátem byly rozdíly analyzovány pomocí jednocestné analýzy rozptylu následované Dunnettovou metodou. V modelových experimentech CKD byly rozdíly analyzovány pomocí K ruskal-Wallisova testu následovaného metodou Steel-Dwass. Korelační koeficienty (rs) byly stanoveny pomocí Spearmanova testu pořadí korelačních koeficientů. Na všechny testy. dvoustranné hodnoty p<0.05 were considered statistically significant.