Vlastnosti a složky související s pokožkou z extraktu nadzemních částí Persicaria Senticosa

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Yun-Hyeok Choi, 1 Jae Yeon Lee, 2 Ji Eun Lee, 1 Yeon Woo Jung, 1 Wonsik Jeong, 1 Seong Su Hong, 1 Young-Rak Cho, 2 a Chun Whan Choi 1

1. Úvod

Persicaria senticosaje jednoletá rostlina z čeledi Polygonaceae, která je rozšířena v celé Koreji. Od nepaměti se tato rostlina používá jako lidové léčitelství s blahodárnými účinky k léčbě různých onemocnění jako je odstraňování otoků rány nebo karbunklů a celulitidy a prokrvení a odstraňování stagnace krve. Nedávné studie to ukázalyPersicaria senticosaměl protizánětlivé účinky [1]; tato rostlina však nebyla hlášena jako bioaktivní kosmetická složka. A předchozí fytochemické studie na květech, stonku a kořenech rodu Polygonum odhalily různé flavonoidy a fenolické sloučeniny, jako je kyselina hydroxybenzoová, rutin, kvercetin-3--O-glukuronid, kvercetin-3--glukosid a luteolin-7-O-rutinosid byl považován za hlavní aktivní složku [2, 3]. Tyto aktivní sloučeniny vykazují rozmanité farmakologické účinky, jako jsou protizánětlivé, protivředové, antihypertenzní a protirakovinné účinky [4]. Během screeningu kosmetických přísad měřením účinku vychytávání radikálů na 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH), vychytávání radikálů ABTS, inhibice elastázy,tyrosinázainhibice a testu oxidu dusnatého bylo zjištěno, že několik extraktů Polygonum vykazuje silnou aktivitu.

Klikněte naCistanche používá ke snížení aktivity tyrosinázy.

2. Materiály a metody

2.1. Rostlinné materiály a obecné postupy NaturalProducts.

Persicaria senticosabyla shromážděna z Seo-myeon, Chuncheon-si, Gangwon-do, Korea, v 2016 (GPS: N 37 stupeň 55′30,1″, E 127 stupeň 37′ 57,0″, nadmořská výška: 434 m). Poukazové vzorky (G071) byly ověřeny Dr. Chun Whan Choi.Persicaria senticosabyly uloženy v herbáři Biocenter, Gyeonggido Business & Science Accelerator, Suwon, Jižní Korea (obr. S3). 99,9% methanolový extrakt ze 34 Polygonum byl získán z Korea Plant Extract Bankat, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Daejeon, Korea). Experimenty 1H a 13C NMR byly prováděny na spektrometru Bruker Ascend 700 MHz s tetramethylsilanem (TMS). LC-ESI-MS byla získána na přístroji Triple TOF 5600 plus (AB SCIX, USA) a HRESI-MSon na přístroji LTQ Orbitrap XL (Thermo, USA). Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) byla prováděna na deskách silikagelu 60F254 (Merck, Německo) a silikagelu 60 RP-18 F254S (Merck, Německo). Sloupcová chromatografie (CC) byla provedena pomocí Silikagelu 60 (70~230 mesh, Merck, Německo), ODS-A (12 nm S-7 μm, YMC GEL, Japonsko) a preparativní HPLC byla provedena na LC{{ 23}}A (Shimadzu, Japonsko).

2.2. NE Test.

Buňky RAW 264.7 byly nasazeny na 96-jamkové destičky (5 × 104 buňky/jamka) a byly ošetřeny vzorkem po dobu 1 hodiny před stimulací LPS (1 ug/ml) po dobu 24 hodin. Negativní kontrola byla ošetřena médiem bez séra. Množství dusitanu, stabilního metabolitu NO, bylo měřeno pomocí Griessova činidla (1 procento sulfanilamidu a 0,1 procenta naftylethylendiamindihydrochloridu ve 2,5 procentech kyseliny fosforečné). Absorbance byla následně měřena při 540 nm za použití čtečky ELISA. Množství dusičnanů bylo stanoveno ze standardní křivky pro dusitan sodný [5–7].

2.3. Test buněčné cytotoxicity.

Buňky RAW 264.7 byly naneseny v hustotě 5 x 104 buněk/jamku na 96-jamkové destičky. Buňky byly ošetřeny vzorky po dobu 1 hodiny před stimulací LPS (1 ug/ml) po dobu 24 hodin. MTT (5 mg/ml v PBS) byl přidán do každé jamky a inkubován po dobu 2 hodin. Médium bylo odstraněno z jamek odsátím, do každé jamky byl přidán DMSO a destička byla protřepána. Absorbance každé jamky byla měřena při vlnové délce 540 nm pomocí čtečky ELISA. Data jsou uvedena jako průměr ± standardní odchylka ze tří replikátů.

2.4. Test aktivity DPPH zachycující radikály.

Aktivita vychytávání radikálů DPPH byla měřena pomocí metody popsané v Blois [8] a Ozgen et al. [9]. Ke vzorku, který byl zředěn na požadovanou koncentraci, byl přidán roztok DPPH rozpuštěný v methanolu a reakce byla prováděna při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Absorbance byla měřena při 517 nm pomocí čtečky ELISA. Jako pozitivní kontrola byl použit antioxidant butylovaný hydroxyanisol (BHA) a byla stanovena hodnota IC50 vzorku.

2.5. ABTS Radical Scavenging Activity.

Aktivita vychytávání radikálů ABTS byla měřena pomocí dříve popsané metody [10, 11]. ABTS plus byl vytvořen smícháním 7 mM roztoku ABTS a 2,45 mM roztoku persíranu draselného (K2S2O8) s ABTS: K2S2O8 (poměr 2: 1) po dobu 12–16 hodin za vzniku kationtu (ABTS plus). Absorbance byla měřena při 734 nm pomocí čtečky ELISA. BHA, antioxidant, byl použit jako pozitivní kontrola.

2.6. Test inhibice tyrosinázy.

tyrosinázainhibiční aktivita byla měřena za použití metody popsané Yagiet al. [12]. Reakce byla provedena v 0,1M pufru fosforečnanu draselného (pH 6,5) obsahujícím 1,5 mM L-tyrosinu a 1250 jednotek/ml houbové tyrosinázy. Reakční směs byla inkubována při 37 stupních po dobu 20 minut. Testované vzorky byly testovány na inhibici tyrosinázy měřením jejího účinku natyrosinázaaktivita pomocí SpectraMax 190PC mikrodestičkové ELISA čtečky při 490 nm. Arbutin a kyselina kojová byly použity jako pozitivní kontrola a byla stanovena hodnota IC50 vzorku.

2.7. Test inhibice elastázy.

Reakce byla provedena v {{0}},5 mM Tris pufru (pH 8,5) obsahujícím 1 mg/ml N-sukcinyl-(Ala)3-p-nitroanilidu a 0,6 jednotek/ml elastázy . Reakční směs byla inkubována při 25 stupních po dobu 10 minut. Testované vzorky byly testovány na inhibici elastázy měřením její efektové aktivity elastázy za použití čtečky ELISA při 405 nm. Ursolicacid byla použita jako pozitivní kontrola a byla stanovena hodnota IC50 vzorku [13].

2.8. Statistická analýza.

Statistická analýza dat byla provedena softwarem PRIZM5 (GraphPad, CA, USA) a data jsou prezentována jako průměr ± SD. Pro analýzu významnosti rozdílu mezi skupinami byl použit jednostranný Studentův t-test a P < 0:05="" byl="" považován="" za="" statisticky="">

3. Výsledky a diskuse

3.1. Vlastnosti rostlinných extraktů z čeledi Polygonaceae související s pokožkou.

Účinek vychytávání radikálů na DPPH, vychytávání radikálů ABTS, inhibice elastázy,tyrosinázaBylo zjištěno, že inhibice a test oxidu dusnatého na několika extraktech Polygonum vykazují silnou aktivitu. Výsledky ukázaly, že Persicariajaponica a Rumex longifolius mají test NO (IC{{0}}.3 a méně než 25,0 ug/ml). Pro DPPH byla IC50 methanolického extraktu Polygonum ciliinerve, Polygonum alpinum a Persicaria Chinensis, v tomto pořadí, 36,9, 15,4 a 19,2 ug/ml. Při aktivitě pohlcující radikály ABTS byla IC50 methanolicexdátu z Polygonum cuspial 2pinum.5 a 5,3 ug/ml, v daném pořadí. vtyrosinázainhibiční aktivita, IC50 methanolického extraktu z kořene Polygonum sachalinens a Polygonum cuspidata byla 289,0 a 483,9 ug/ml, v daném pořadí. V testu inhibice elastázy byla IC50 methanolového extraktu z Polygonum sachalinense, Polygonum cuspidatum, Persicaria hydropiper, Persicaria sieboldi, Polygonumorientale, Persicaria lapathifolia, Persicaria dissitiflora, Rumexacetosella, Rumexacetosella, Rumexelongta, Persicaria Crisria, Polygonumta, Persicaria Persicaria conspicua, Rheum palmatum a Persicaria lapathifolia byla pod 100 ug/ml (tabulka 1).

3.2. Vlastnosti frakcí Persicaria senticosa související s kůží.

Účinek vychytávání radikálů na 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH), vychytávání radikálů ABTS, inhibice elastázy a stanovení oxidu dusnatého na několikaPersicaria senticosabylo zjištěno, že frakce vykazují silnou aktivitu. Výsledky ukázaly, že CH2CI2 a EtOAc frakce mají NO test (pod 25 a 44,64 ug/ml, v daném pořadí). Aktivita vychytávání radikálů DPPH a ABTS frakcí EtOAc byla 13,7 a 5.0 ug/ml. V testu inhibice elastázy byla IC50 frakcí n-hexanu a CH2CI2 pod 100 ug/ml (tabulka 2).

3.3. Izolace a stanovení sloučenin z extraktu Persicaria senticosa.

Persicaria senticosanadzemní části (1,4 kg), vysušené ve stínu a rozdrcené na prášek, byly přidány do 4{{10}} Lof 70 procent ethanolu (HPLC kvalita) a dvakrát při pokojové teplotě (pokaždé po dobu 2 dnů) a byly zakoncentrovány ve vakuu při 40 stupních za získání 180,4 g extraktů. Extrakty byly suspendovány v destilované vodě a poté rozděleny s n-hexanem (4:0 l x 3), CH2CI2 (4:0 l x 3), EtOAc (4:0 l x 3) a n-butanolem (4:0 l x 3). za vzniku n-hexanu (11,7 g), CH2CI2 (7,4 g), EtOAc (21,7 g), butanolu (22,5 g) a ve vodě rozpustných frakcí (110,1 g) (schéma 1). Frakce EtOAc (21,7 g) byla oddělena pomocí MPLC, která používala gradientové směsi jako eluenty (F001-003). Sloučeniny 1 (3,2 mg) a 5 (3,9 mg) byly izolovány z F002, které byly použity preparativní HPLC. Frakce F001 byla separována pomocí MPLC, která používala jako eluenty gradientové směsi (F011-F018). Sloučenina 6 (1,5 mg) byla izolována z F016, která byla použita preparativní HPLC. Sloučenina 7 (2,7 mg) byla izolována z F017, který byl použit preparativní HPLC. F012 byl separován pomocí MPLC, která používala gradientové směsi jako eluenty (F121-F124). Sloučenina 4 (10,8 mg) byla izolována z F124, který byl použit preparativní HPLC. Kromě toho byl F014 separován preparativní HPLC s použitím gradientových směsí jako eluentů (F141-F143). Sloučenina 3 (2,3 mg) byla izolována z F141 za použití preparativní HPLC. Sloučenina 2 (4,8 mg) byla izolována z F142 za použití semipreparativní HPLC. Čištění vrstvy rozpustné v EtOAc bylo provedeno separací sloupcovou chromatografií a MPLC analýzou na sloučeniny 1-7. Byl identifikován jako loliolid (1) [14], kvercetin-3-O-glukosid (2) [15], kvercecín-3-O-glukuronid (3) [16], 4-methoxy kyselina kaftrarová (4) [17],kaempferol-3-(6-methylglukuronid) (5) [18], kvercetin-3-(6-methylglukuronid) (6) [19, 20] a kvercetin (7) [21]. Struktura byla objasněna kombinací 1D a 2D NMR a MS spektrometrie, stejně jako srovnáním s uvedenou literaturou (obrázek 1).

3.4. Vlastnosti sloučenin z Persicariasenticosa související s pokožkou.

Radikální účinek na DPPH,tyrosinázainhibice a stanovení oxidu dusnatého na několika sloučeninách zPersicaria senticosabylo zjištěno, že vykazuje silnou aktivitu (obr. S4–7). Výsledky ukázaly, že sloučenina 7 má NOassay (IC50 29,7 ug/ml). Pro DPPH byla IC50 sloučenin 2, 3, 5 a 7 39,6, 31,2, 37,0 a 22,7 ug/ml, v daném pořadí. V inhibiční aktivitě tyrosinázy byla IC50 sloučeniny 7 14,3 ug/ml (tabulka 3).

4. závěr

Persicaria senticosaje jednoletá rostlina z čeledi Polygonaceae rozšířená v celé Koreji. Od pradávna se tato rostlina používá jako lidové léčitelství s blahodárnými účinky při léčbě různých nemocí. Tato studie hodnotila vlastnosti a složky související s pokožkou z extraktu z vzdušných částí Persicaria senticosa a třiceti čtyř rostlin Polygonaseae. V průběhu screeningu kosmetických přísad měřením účinku vychytávání radikálů na DPPH, vychytávání radikálů ABTS, protivrásek byla hodnocena pomocí inhibice elastázy, bělení bylo studováno pomocítyrosinázainhibice a protizánětlivý byl testován pomocí testu oxidu dusnatého. Bylo zjištěno, že několik extraktů Polygonum vykazuje silnou aktivitu. Výsledky ukázaly, že extrakt z Persicaria senticosamethanolic má DPPH a ABTS radikály vychytávající aktivity (IC50 61.0 a 17,5 ug/ml). V testu inhibice elastázy a testu oxidu dusnatého byla IC50 methanolického extraktu Persicaria senticosa 241,5 ug/ml a 71,8 ug/ml, v daném pořadí. 70% ethanolický extrakt Persicaria senticosa byl rozdělen mezi n-hexan, CH2CI2, EtOAc, n-BuOH a vodné frakce.

Frakce rozpustná v EtOAc vykazovala silnou aktivitu související s pokožkou (obrázek 2 a tabulka 3). Tyto výsledky naznačují, že aktivní složky vPersicaria senticosaodpovědné za aktivitu související s kůží byly koncentrovány v EtOAc rozpustné frakci Persicaria senticosa (schéma 1). Na druhé straně frakce rozpustná v n-hexanu, dichlormethanu a frakce rozpustná v BuOH pocházející z extraktu z Persicaria senticosa vykazovaly ekvipotentní aktivitu na test oxidu dusnatého, DPPH a aktivitu vychytávání radikálů ABTS, zatímco zbývající vodní frakce vykazovala slabé inhibiční účinky (tabulka 2 ).

Biotestem řízené čištění tří aktivních frakcí, tj. frakce rozpustné v EtOAcPersicaria senticosabyla provedena za účelem čištění aktivních principů odpovědných za aktivitu související s kůží, po které následoval proces popsaný ve schématu 1, v tomto pořadí.

Čištění EtOAc rozpustné vrstvy zPersicaria senticosa70% ethanolický extrakt byl proveden separací sloupcovou chromatografií a MPLC analýzou na sloučeniny 1-7. Byl identifikován jako loliolid (1), kvercetin3-O-glukosid (2), kvercetin-3-O-glukuronid (3), 4-methoxykaftrarová kyselina (4), kaempferol{{ 11}}(6-methylglukuronid) (5), kvercetin-3-(6-methylglukuronid) (6) a kvercetin (7). Struktura byla objasněna kombinací 1D a 2D NMR a MS spektrometrie, stejně jako porovnáním s uváděnou literaturou (obr. S2). Účinek vychytávání radikálů 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl(DPPH),tyrosinázaBylo zjištěno, že inhibice a test oxidu dusnatého na několika sloučeninách z Persicaria senticosa vykazují silnou aktivitu. Výsledky ukázaly, že sloučenina 7 má test NO (IC5029,7 uM). Pro DPPH byla IC50 sloučenin 2, 3, 5 a 7 39,4, 32,1, 37,0 a 22,7 uM, v daném pořadí. vtyrosinázaInhibiční aktivita, IC50 sloučeniny 7 byla 14,3 uM. Jak ukazuje obrázek 3, sloučeniny 2 a 5 jsou hlavními sloučeninami v EtOAc rozpustné frakci Persicaria senticosa (-obr. S1). A sloučeniny 2 a 5 vykazovaly vynikající antioxidační aktivitu (obrázek 4), což je v souladu s předchozími studiemi [18, 22].

Tato současná studie to prokázalaPersicaria senticosaa Polygonaseae obsahují chemické sloučeniny s aktivitami souvisejícími s kůží a mohly by být zajímavé jako nový zdroj bioaktivních látek pro kosmetický průmysl.