Místo zranitelnosti SARS-CoV-2 Spike indukuje široce ochrannou protilátku proti antigenně odlišným omikronovým subvariantám
Nov 30, 2023
Rychlý vývoj variant těžkého akutního respiračního syndromu koronaviru 2 (SARS-CoV-2) Omicron zdůraznil potřebu identifikace protilátek se širokými neutralizačními schopnostmi pro budoucí monoklonální terapie a strategie očkování. Zde jsme identifikovali S728-1157, široce neutralizující protilátku (bnAb) zacílenou na receptor-vazebné místo (RBS), která byla odvozena od jedince dříve infikovaného WT SARS-CoV-2 před rozšířením varianty obav (VOC). S728-1157 prokázal širokou zkříženou neutralizaci všech dominantních variant, včetně D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu a Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). Kromě toho S728-1157 chránila křečky před in vivo napadením viry WT, Delta a BA.1. Strukturální analýza ukázala, že tato protilátka se zaměřuje na epitop třídy 1/RBS-A v doméně vázající receptor prostřednictvím mnoha hydrofobních a polárních interakcí s oblastí 3 určující komplementaritu těžkého řetězce (CDR-H3), navíc k běžným motivům v CDR-H1/ CDR-H2 třídy 1/RBS-A protilátky. Důležité je, že tento epitop byl snadněji dostupný v otevřeném a prefúzním stavu nebo v hexaprolinem (6P)-stabilizovaných hrotových konstruktech, ve srovnání s diprolinovými (2P) konstrukty. Celkově S728-1157 prokazuje široký terapeutický potenciál a může být základem pro návrhy cílových vakcín proti budoucím variantám SARS-CoV-2.
cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém
Úvod
Od začátku pandemie v prosinci 2019 vedl virus těžkého akutního respiračního syndromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) k více než 660 milionům případů onemocnění koronavirem 2019 (COVID-19) a více než 6.5. milionů mrtvých po celém světě. Přestože rychlý vývoj a distribuce vakcín a terapeutik do značné míry omezila účinek COVID-19, výskyt cirkulujících variant obav (VOC) nadále představuje velkou hrozbu kvůli možnosti dalšího úniku imunity a zvýšenou patogenitu. Varianta D614G byla první variantou, která se objevila a poté se stala všeobecně převládající. Ve srovnání s WT varianta D614G vykazovala spíše zvýšenou přenositelnost než zvýšenou patogenitu, a proto nebylo pravděpodobné, že by snižovala účinnost vakcín v klinických studiích (1). Mezi vznikem D614G do října 2021 se po celém světě vyvinuly 4 další významné VOC, včetně Alpha, Beta, Gamma a Delta. Mezi těmito variantami se Delta stala vážnou globální hrozbou kvůli své přenositelnosti, zvýšené závažnosti onemocnění a částečnému imunitnímu úniku, jak ukazuje snížená schopnost polyklonálního séra a mAb neutralizovat tento kmen (2–6). Krátce poté, v listopadu 2021, byla identifikována varianta Omicron a oznámena jako nová VOC. Tato varianta měla dosud největší počet mutací a zdálo se, že se šíří rychleji než předchozí kmeny (7, 8). V současné době existuje široká škála podlinií Omicron, které vedou k novým případům COVID{21}}, přičemž BQ.1, BQ.1.1 a XBB.1.5 se stávají dominantními nad BA.5 a představují většinu nových případů po celém světě v té době psaní. Varianty Omicronu mohou v různém rozsahu uniknout rozpoznání imunity spojené s vakcínou COVID{28}}, čímž se významně sníží neutralizační schopnost sérových protilátek od rekonvalescentních jedinců, plně očkovaných mRNA a jedinců posílených novou bivalentní WT/BA.5 mRNA vakcína (9, 10). Podobně byly varianty Omicron schopny uniknout vazbě několika terapeutických mAb s povolením k nouzovému použití (EUA), i když se dříve ukázalo, že jsou účinné proti dřívějším VOC (10–12). Kvůli snížené neutralizaci proti Omicron a pokračující hrozbě budoucích VOC je naléhavá potřeba identifikovat široké a silné neutralizační protilátky, které mohou chránit před různými, vyvíjejícími se liniemi SARS-CoV-2. V této studii jsme identifikovali silnou receptor-vazebnou doménu reaktivní (RBD-reaktivní) mAb z periferní krve rekonvalescentního jedince SARS-CoV-2, který účinně neutralizoval alfa, beta, kappa, delta, mu, a Omicron varianty (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 a XBB). Tato mAb, S728-1157, významně snížila BA.1 Omicron, Delta a WT virovou zátěž v plicích a nosní sliznici po in vivo expozici u křečků. S728-1157 váže receptor vazebné místo (RBS), které je plně exponováno, když je RBD na hrotu v konformaci nahoru. mAb využívá motivy nalezené v CDR-H1 a CDR-H2, které jsou společné pro protilátky IGHV3-53/3-66 třídy 1/RBS-A (13, 14), ale také prostřednictvím rozsáhlých unikátních kontaktů s CDR -H3 k obejití mutací ve špičkách VOC. To naznačuje, že racionální návrh budoucích booster vakcín pokrývajících Omicron varianty by měl být modifikován tak, aby představoval stabilizovaný hrot v většinou up konfiguraci pro optimální indukci třídy 1/RBS-A mAb, které mají podobné vlastnosti CDR-H3.
cistanche výhody-posilují imunitní systém
Výsledek
Izolace RBD-reaktivních mAb, které vykazují různé vzorce neutralizace a účinnosti. Před rozšířením linií Omicron jsme dříve charakterizovali 43 mAb zacílených na odlišné epitopy na spike proteinu, včetně N-terminální domény (NTD), RBD a podjednotky 2 (S2). Žádná z těchto protilátek nebyla schopna neutralizovat varianty SARS-CoV-2 cirkulující v té době (15). V této studii byl exprimován další panel RBD-reaktivních mAb od 3 jedinců s vysokou odezvou, kteří měli robustní anti-spike IgG odpovědi, jak bylo definováno dříve (16) (doplňkové tabulky 1 a 3; doplňkový materiál dostupný online s tímto článkem; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). I když byl podíl B-buněk spike RBD-vazebných B-buněk podobný u vysoce reagujících ve srovnání se střední a nízkou odezvou (obrázek 1, A–C), míra somatických hypermutací těžkého řetězce byla významně vyšší ve skupině s vysokou odezvou (obrázek 1 , D a E), což naznačuje, že tito jedinci mohou mít nejvyšší potenciál vytvářet silné zkříženě reaktivní mAb (16). Tyto protilátky byly dále zkoumány proti mutantům RBD, aby se identifikovaly jejich klasifikace epitopů (17). Mezi 14 RBD-reaktivními mAb jsme identifikovali 4 mAb třídy 2, 2 mAb třídy 3 a 8 neklasifikovaných mAb, které vykazovaly malé nebo žádné snížení vazby proti jakýmkoli testovaným klíčovým RBD mutantům (obrázek 1F). Je třeba poznamenat, že protilátky třídy 2, třídy 3 a třídy 4 přibližně odpovídají epitopům RBS BD, S309 a CR3022 definovaným v předchozích studiích (13, 18). mAb třídy 2 a 3 RBD nerozpoznaly multivariantní mutant RBD obsahující substituce K417N/E484K/L452R/N501Y, uměle navržený RBD tak, aby zahrnoval klíčové mutace pro únik viru (17, 18), ani neprokázaly žádnou zkříženou reaktivitu s RBD SARS-CoV-1 a blízkovýchodní respirační syndrom (MERS)-CoV (obrázek 1F). Funkčně mAb třídy 2 a 3 RBD silně neutralizovaly varianty D614G a Delta, ale neutralizační aktivita byla omezenější proti Beta, Kappa a Mu (obrázek 1G). Žádná z testovaných protilátek třídy 2 nebo 3 neneutralizovala žádnou testovanou variantu Omicron.
Naproti tomu většina neklasifikovaných mAb se vázala na multivariantu RBD a zkříženě reagovala na SARS-CoV-1 RBD (obrázek 1F). Mezi nimi jsme identifikovali 3 mAb, S451-1140, S626-161 a S728-1157, které vykazovaly vysokou neutralizační účinnost proti D614G a křížově neutralizované beta, Delta, Kappa, Mu a Omicron BA.1 s 99% inhibiční koncentrací (IC99) v rozmezí 20–2 500 ng/ml (obrázek 1G). Vzhledem k široké neutralizační síle těchto 3 mAb jsme kromě platformy pro stanovení plaků provedli také neutralizační aktivitu proti autentickým BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 a XBB viry využívající neutralizační test redukce ohniska (FRNT) (obrázek 1G). Z nich S728-1157 vykazoval vysoké neutralizační aktivity proti panelu variant Omicron včetně BA.1, BA.2, BA.4 a BA.5, s IC99 až 100 ng/ml, měřeno pomocí plakový test. Podobný scénář byl pozorován při použití FRNT, kde si S728-1157 udržel svou vysokou neutralizační aktivitu vůči BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 a XBB s IC50 v rozmezí 8–300 ng /ml (obrázek 1G). S451-1140 neutralizoval BA.1, BA.2, BA.2.75 a BL.1 silně, ale ne BA.4 a BA.5, jak bylo pozorováno na obou platformách neutralizačního testu. Na druhou stranu, S626-161 neprokázal neutralizační aktivitu proti variantám Omicron nad rámec BA.1 varianty (obrázek 1G). Ačkoli S626-161 měl nižší neutralizační schopnost proti testovaným VOC než ostatní 2 protilátky, byla to jediná mAb, která vykazovala zkříženou reaktivitu nejen vůči SARS CoV-1 RBD, ale byla také schopna neutralizovat netopýra koronaviry WIV-1 a RsSHC014 (obrázek 1, F a G). Tato data naznačují, že S626-161 rozpoznává konzervovaný epitop, který je sdílen mezi těmito liniemi arbovirů, ale chybí v kmenech BA.2 a pozdějších. Navíc ve srovnání s S728-1157 a S451-1140 má S626-161 delší CDR-H3, která by mohla poskytnout vylepšenou schopnost rozpoznat vysoce konzervovanou záplatu zbytků sdílených mezi arboviry, jak je popsáno v předchozí studii (19) (doplňkový obrázek 1). Při porovnání variabilních genů imunoglobulinového těžkého (IGHV) a lehkého řetězce (IGLV nebo IGKV) těchto 3 mAb s dostupnou databází mAb neutralizujících SARS-CoV-2 (13, 15, 20–27) jsme zjistili, že těžký řetězec variabilní geny používané S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) a S626-161 (IGHV4-39) mají dříve bylo hlášeno, že kóduje několik silně neutralizujících SARS-CoV-2 protilátek cílených na RBD (21, 22, 28, 29). Avšak pouze S728-1157 měl jedinečné páry variabilních genů těžkého a lehkého řetězce, které nebyly uvedeny v databázi (doplňková tabulka 3), což naznačuje, že se nejedná o veřejný klonotyp.
Obrázek 1. Charakterizace RBD-reaktivních mAb izolovaných z COVID-19 – rekonvalescentních jedinců
Tyto 3 mAb (S451-1140, S626-161 a S728-1157) byly dále charakterizovány, aby se určila jejich vazebná šířka vůči SARSCoV-2 VOC (obrázek 2, A a B) . Prefuzně stabilizovaný hrot obsahující 2-prolinové substituce v podjednotce S2 (2P; diprolin) se ukázal jako lepší imunogen ve srovnání s hrotem WT a je základem několika současných SARS-CoV-2 vakcíny, včetně vakcín na bázi mRNA (30, 31). Nedávno bylo popsáno, že spike protein stabilizovaný 6 proliny (6P; hexaprolin) zvyšuje expresi a je dokonce stabilnější než původní diprolinový konstrukt; v důsledku toho bylo navrženo pro použití v příští generaci vakcín COVID{17}} (32, 33). Abychom určili, zda existují rozdíly v antigenicitě mezi konstrukty s hroty diprolinu a hexaprolinu, byly do našeho testovacího panelu zahrnuty oba imunogeny. Při měření pomocí ELISA jsme zjistili, že 3 mAb vázaly 6P-WT spike antigen ve větší míře ve srovnání s WT-2P spike (obrázek 2, A a B). Všechny 3 mAb vykazovaly srovnatelnou vazbu s hroty virů Alpha, Beta, Gamma a Delta, relativně k vazbě WT-2P (obrázek 2, A a B). Avšak vazebné reaktivity těchto 3 mAb byly podstatně sníženy proti panelu antigenů rodiny Omicron (obrázek 2, B a C). S451-1140 vazba byla citlivá na mutace nalezené v BA.1 a BA.2, což vedlo k velkému poklesu vazby a 31-násobnému poklesu neutralizace proti těmto variantám ve srovnání s WT-2 P antigen a D614G virus, v daném pořadí (obrázek 2B). Zkříženě neutralizující mAb sarbecovirus, S626-161, také vykázala 1.2- až 3{43}}násobně sníženou vazbu na hrot BA.1 antigenu, což může být příčinou {{45} }násobné snížení neutralizační aktivity proti BA.1 (obrázek 1G a obrázek 2, B a C). U nejúčinnější široce neutralizující protilátky (bnAb), S728-1157, byla vazba na omikronové antigeny snížena v menší míře (v rozmezí od 11- do 44-násobku) ve srovnání s WT-2P se zvýšil a neutralizační aktivita nebyla ovlivněna (obrázek 1G a obrázek 2, B a C). Podstatné snížení vazby Omicron-neutralizující mAb na špičku BA.1 může být způsobeno změnami v její mobilitě a souvisí s pevným uspořádáním Omicron 3-struktury snižující RBD a preferencí pro 1- nahoru RBD, které pomáhají vyhnout se protilátkám, jak uvádí předchozí studie (34). Stabilizační mutace 2P a 6P mají také rozdílné účinky ve variantách Omicron, kde všechny 3 mAb vykazovaly více než 2,{67}}násobně zvýšenou vazbu na hrot BA.{68}}P ve srovnání s BA.1-2P verze, ale pouze okrajově zvýšená vazba na spike BA.2 a BA.4/5 6P verze ve srovnání s jejich 2P verzemi o 1,2 × až 1,4 ×, což naznačuje mírně lepší dostupnost Omicron-neutralizačních mAb k hexapólovým verzím, zejména pro konstrukci hrotu BA.1. Kromě ELISA byla ke kvantifikaci vazebné rychlosti a rovnovážných konstant (kon, koff a KD) těchto 3 mAb použita biovrstva interferometrie (BLI) na panel spike antigenů (doplňkový obrázek 2). Konverze rozpoznání vazby fragmentu antigenu (Fab) na hroty hexaprolinu byly 1.{83}} až 3{85}}krát rychlejší ve srovnání s hroty diprolinu (doplňkový obrázek 2, B a C), což ukazuje, že protilátky se navázaly na konstrukt 6P rychleji než na konstrukt 2P. To by se dalo očekávat, kdyby byly epitopy na RBD v otevřeném stavu na hexaprolinovém hrotu dostupnější. S výjimkou S626- 161 se Fabs oddělily od špičky hexaprolinu pomaleji (měly nižší koff) než špičky diprolinu, takže celková KD ukázala, že S728-1157 a S451-1140 se vážou na hexaprolinový hrot s větší afinitou (doplňkový obrázek 2, B a C). Zvýšení vazby na hexaprolinovou špičku bylo ještě výraznější pro intaktní IgG pomocí modelu interakce 1:2, jak ukazují S728-1157 a S{96}} mAb, což je v souladu s expozicí více epitopů se stabilizací 6P umožňující zlepšená avidita (doplňkový obrázek 2, A a C). Dohromady tyto výsledky naznačují, že cílené epitopy mohou být srovnatelně dostupnější na 6P-stabilizovaném hrotu, když je RBD v otevřeném stavu. Dále byly provedeny strukturální analýzy pro ověření této domněnky.
Obrázek 2. Vazebná šířka mAb neutralizujících Omikrony
Strukturální analýza široce neutralizujících mAb. Jako první přiblížení navázaných epitopů byl použit kompetiční test ELISA k určení, zda tyto 3 široce neutralizující mAb sdílejí nějaké překrývání s naším současným panelem mAb, souborem mAb se známými epitopovými specificitami z předchozích studií (15, 25, 35) a 2 další mAb v současné době klinicky používané, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) a REGN10933 (Regeneron) (37). Vazebná místa S451-1140 a S{11}} se částečně překrývala s CC12.3 (23, 25), neutralizační protilátkou třídy 1, a většinou protilátek třídy 2, včetně LY-CoV555 a REGN10933, ale ne s protilátkami třídy 3 a třídy 4 (obrázek 3A). S626-161 sdílel významný překryv ve vazebné oblasti s třídou 1 CC12.3, několika protilátkami třídy 4, včetně CR3022, a dalšími neklasifikovanými protilátkami, přičemž se částečně překrýval s několika protilátkami třídy 2 a jedinou protilátkou třídy 3 (obrázek 3A). Analogicky, soutěžní test BLI odhalil, že S451-1140 a S728-1157 spolu silně soutěží o vazbu na hrot WT-6P, zatímco S626-161 nikoli (doplňkový obrázek 3). Celkově tato data naznačují, že S451-1140 a S728-1157 rozpoznávají podobné epitopy, které se liší od S626-161.
Obrázek 3. Mechanismus široké neutralizace S728-1157
Protilátka S728-1157 byla kódována IGHV3-66 a měla krátkou oblast určující komplementaritu 3 (CDR-H3). Zejména mAb, které se vážou na RBS ve vazebném módu 1 (tj. místo RBS-A nebo třídy 1), typické pro CC12.1, CC12.3, B38 a C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), mají tendenci používat IGHV3-53 nebo 3-66 a jsou citliví na mutace VOC (40). Oblast CDR-H3 S728-1157 je však vysoce odlišná od jiných protilátek této třídy, což potenciálně odpovídá za její širší aktivitu. Abychom porozuměli strukturnímu základu široké neutralizace pomocí S728-1157 na tomto epitopu, vyřešili jsme kryo-elektronovou mikroskopickou (kryo-EM) strukturu (obrázek 3B) IgG S728-1157 v komplexu s hrotem WT{ {31}}P-Mut7, verze spike WT-6P mající interprotomerní disulfidovou vazbu na C705 a C883, v globálním rozlišení přibližně 3,3 Á (doplňkový obrázek 4E). Pomocí expanze symetrie, cílené klasifikace a metod zpřesňování jsme dosáhli místního rozlišení na rozhraní RBD-Fv přibližně 4 Á (doplňkový obrázek 4E a doplňková tabulka 8). Krystalová struktura S728-1157 Fab byla stanovena při rozlišení 3,1 Á a použita k vytvoření atomového modelu na rozhraní RBD-Fv. Naše struktury potvrzují, že S728-1157 navázal epitop RBS-A (nebo třída 1) v konformaci RBD-up (obrázek 3B a doplňkový obrázek 4E), podobně jako ostatní IGHV3-53/{{55} } protilátky (obrázek 3C). Stérická blokáda vazebného místa angiotenzin-konvertujícího enzymu 2 (ACE2) působením S728-1157 vysvětluje jeho vysokou neutralizační schopnost proti SARS-CoV-2. Motiv 32NY33 a motiv 53SGGS56 (23) v S728-1157 CDR-H1 a -H2 interagují s RBD téměř stejným způsobem jako CC12.3 (doplňkový obrázek 4, B a C). Ve srovnání s VH 98DF99 v CC12.3 však VH 98DY99 v S728-1157 CDR-H3 tvoří rozsáhlejší interakce, včetně hydrofobních i polárních interakcí, s RBD, což může odpovídat za širokou neutralizaci proti VOC (obrázek 3D a doplňkové tabulky 6 a 7). Diglycin VH 100GG101 v S728- 1157 CDR-H3 může také usnadnit rozsáhlejší vazbu ve srovnání s VH Y100 v CC12.3, pravděpodobně díky flexibilitě glycinových zbytků, která vede k odlišné konformaci špičky CDR -H3 smyčka a relativní posun zbytků na 98DY99.
cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém
Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity
【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Ačkoli Omicron VOC mají rozsáhlé mutace v RBD, většina těchto zbytků neinteraguje s S728-1157, protože vazba je stále pozorována (doplňkový obrázek 4A). Z našeho špičkového modelu WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157 se předpokládá, že Y505 až VL Q31 a E484 až VH Y99 vytvoří vodíkové vazby (doplňkový obrázek 4D a doplňková tabulka 6 ), které mají potenciál být narušeny omikronovými mutacemi Y505H a E484A. Mutace Y505H by však stále umožňovala vodíkovou vazbu s VL Q31 a mutace E484A by přidala další hydrofobní postranní řetězec blízko hydrofobních zbytků VL Y99, F456 a Y489. Tyto kontakty mohou částečně vysvětlovat mechanismus, který umožňuje S728-1157 zachovat si neutralizační aktivitu, i když sníženou, proti hrotovému antigenu BA.1 (obrázek 1G a obrázek 2B). Antigen BA.1 zase možná souvisí s mutacemi Omicron, které mění konformační krajinu spike proteinu (34). Nicméně několik somaticky mutovaných zbytků, tj. VH L27, L28, R31, F58 a VL V28 a Q31, v S728-1157 se účastní interakce se SARS-CoV-2 RBD (doplňkový obrázek 1 a Doplňková tabulka 7), což může také přispívat k jeho široké reaktivitě ve srovnání s CC12.3. Celkově naše strukturální studie odhalily základ široké neutralizace S728-1157, která dokáže pojmout většinu mutací v SARS-CoV-2 VOC.
Obrázek 4. Ochranná účinnost bnAb proti infekci SARS-CoV-2 u křečků.
S728-1157 snižuje replikaci SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta a WT SARS-CoV-2 u křečků syrských. K vyhodnocení ochranné účinnosti našich široce neutralizujících mAb jsme použili zlatý model infekce syrského křečka, který byl široce používán pro SARS-CoV-2. Křečci dostali 5 mg/kg našich testovaných mAb nebo izotypovou kontrolu cílenou na irelevantní antigen (glykoprotein ebolaviru) intraperitoneální injekcí 1 den po infekci viry SARS CoV-2. Plicní a nosní tkáně byly odebrány 4 dny po infekci (obrázek 4A). Terapeutické podávání S728-1157 vedlo ke snížení titrů variant WT, BA.1 Omicron a Delta v nosních skořepinách i v plicích infikovaných křečků (obrázek 4, B–D). Zajímavé je, že účinek S728-1157 v plicích byl dramatický a snížil virovou zátěž WT a BA.1 Omicron přibližně o 104 PFU, přičemž virové titry varianty BA.1 Omicron byly zcela zrušeny (obrázek 4C). Na rozdíl od neutralizace in vitro (obrázek 1G), S451-1140 nesnížil replikaci BA.1 Omicron viru v plicních a nosních skořepinách, což ukazuje na rozpor mezi neutralizací in vitro a ochranou in vivo pro tento klon (obrázek 4E) . Pro srovnání, podávání S626-161 vedlo k okrajově významnému snížení plicních virových titrů po expozici WT a BA.1 (obrázek 4, F a G). Tato data zdůrazňují, že pro přesné definování široce protektivních mAb je nutné vyhodnotit účinnost ochrany souběžně s neutralizační aktivitou. V budoucnu bude zajímavé prozkoumat, do jaké míry je ochranná kapacita S728-1157 závislá na Fc. Celkově S728-1157 představuje slibnou mAb se širokou neutralizační účinností proti variantám SARS CoV-2, které jsou schopné dramaticky snížit replikaci WT, Delta a BA.1 in vivo.
Infekce SARS-CoV-2 zřídka vyvolává silné zkříženě neutralizující mAb podobné S728-1157. Vzhledem ke zkřížené neutralizaci a profylaktickému potenciálu S728-1157 jsme se snažili vyhodnotit, zda jsou protilátky podobné S728–1157 běžně indukovány mezi polyklonálními odpověďmi u pacientů se SARS-CoV-2. Abychom to vyhodnotili, provedli jsme kompetitivní ELISA s použitím rekonvalescentního séra k detekci titrů protilátek proti RBD, které by mohly soutěžit o vazbu s S728-1157 (obrázek 5A). Subjekty byly rozděleny do 3 skupin na základě velikosti protilátkových odpovědí, jak bylo definováno dříve (15, 16). Ačkoli vysoce a středně reagující pacienti měli vyšší titry S728-1157–kompetitivních sérových protilátek ve srovnání s osobami s nízkou odezvou (obrázek 5B), titry byly ve všech skupinách poměrně nízké, což naznačuje, že je neobvyklé získat vysoké hladiny S{{ 18}-podobné protilátky v polyklonálním séru po infekci WT SARS-CoV-2. Kromě S728-1157 jsme testovali konkurenci rekonvalescentního séra s dalšími mAb, včetně S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 a CC12.3. Podobně jako u S728-1157 jsme pozorovali relativně nízké titry protilátek konkurujících S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 a CC12.3 v polyklonálním séru většiny rekonvalescentů jednotlivci (obrázek 5, C–F a H). Nicméně pacienti s vysokou odezvou měli tendenci mít významně vyšší titry proti těm, které neutralizovaly mAb, než osoby s nízkou odezvou (obrázek 5, B–F a H). Naproti tomu protilátky zacílené na místo epitopu CR3022 byly výraznější u rekonvalescentních jedinců, což naznačuje obohacení RBD protilátek třídy 4 v polyklonálním séru (obrázek 5G). Pozoruhodné je, že mezi 3 skupinami respondentů nebyl žádný významný rozdíl v titrech CR3022, což naznačuje, že protilátky v místě CR3022-byly konzistentně indukovány během infekce WT SARS-CoV-2 u většiny jedinců. Je zajímavé, že ve srovnání s CC12.3 byl S728-1157 detekován v 4-krát nižších hladinách v séru vysoce respondérů. Navzdory tomu, že protilátky třídy 1 jsou často indukovány přirozenou infekcí a očkováním (14, 20, 28, 29, 41–43), naše data naznačují, že protilátky podobné S728–1157, které představují podskupinu této třídy, jsou poměrně vzácné.
Kromě toho jsme zkoumali rozdíl v reaktivitě na 2P oproti 6P-stabilizovanému hrotu v našem rekonvalescentním kohortovém séru (obrázek 5, I–K). Zjistili jsme, že všechny 3 skupiny respondérů nasadily anti-spike reaktivní protilátky proti 6P-stabilizované spike WT ve větší míře než 2P-stabilizované spike WT, faktorem 6– až 11–krát (obrázek 5J), což naznačuje, že hlavní antigenní epitopy byly lépe vystaveny nebo stabilizovány na 6P-stabilizovaném antigenu. Při použití stejných vzorků měli pacienti s vysokou a střední odezvou také nižší titry protilátek proti BA.1-2P než BA.{18}}P, 4 až 5krát (obrázek 5K). Je třeba poznamenat, že respondenti s nízkou odezvou měli menší násobek změny vazebné reaktivity proti špičce BA.1 Omicron-2P a 6P (2-násobné snížení) ve srovnání s vrcholem WT-2P a 6P ({ {28}}násobné snížení) (obrázek 5, J a K), což naznačuje, že sérové protilátky proti BA.1 omikron-reaktivním epitopům mohou být omezenější u subjektů s nízkou odezvou. Celkově tato data naznačují, že existuje zlepšená polyklonální vazba indukovaná přirozenou infekcí na 6P-stabilizovaný hrot, a to jak pro viry WT, tak pro viry Omicron.
Protilátky podobné S728–1157 jsou optimálně indukovány v rámci hybridní imunity. Primární infekce SARS-CoV-2 bez očkování se v současném globálním prostředí stala vzácnou a několik studií uvádí, že imunita vůči SARS-CoV-2 se u jedinců se specifickou historií očkování/infekce liší. V důsledku toho jsme se dále snažili prozkoumat, které běžné expozice, kromě infekce WT samotným předkovým SARS-CoV-2, by účinně indukovaly protilátky podobné S728–1157 v plazmě od očkovanců na bázi monovalentní mRNA s předchozími a bez nich. infekce. Potřebný biovzorek jsme získali od kohorty studie Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2 (PARIS), která dlouhodobě sledovala zdravotnické pracovníky od začátku pandemie (44). Vybrali jsme vzorky plazmy od plně imunizovaných (2× očkovaných) účastníků studie s infekcí a bez infekce a také od účastníků posílených (3× očkovaných) s infekcí a bez ní. Kromě toho jsme také zahrnuli vzorky od účastníků studie, kteří dostali bivalentní mRNA vakcínu (předků WA1/2020 plus Omicron BA.5) (obrázek 6A a doplňková tabulka 2). K průlomovým infekcím u účastníků, kteří dostali přeočkování, došlo v době, kdy linie Omicron vytlačily všechny ostatní linie SARS-CoV-2 v metropolitní oblasti New Yorku. Zjistili jsme, že dvojitě očkovaní jedinci měli nejnižší titry S728-1157 kompetitivních sérových protilátek mezi 5 skupinami testovaných vzorků (obrázek 6B). Je pozoruhodné, že tyto hladiny byly podobné hladinám pozorovaným u naší kohorty v rekonvalescenci-neočkovaných (všichni respondenti; obrázek 5B). Ve srovnání s tím jedinci s anamnézou přirozené infekce, včetně jedinců v rekonvalescenci se 2 ze 3 dávek vakcíny, a jedinců, kteří prodělali průlomovou infekci a dostali bivalentní booster, vykazovali významně vyšší úrovně elicitace S728-1157 ve srovnání s neinfikovanými ale očkovaných jedinců (obrázek 6B). Ačkoli neinfikovaná 3-dávková skupina vykazovala pouze nevýznamné zvýšení ve srovnání s 2-dávkovou skupinou, párové rozdělení podle typu vakcíny ukázalo, že homologní třetí dávky BNT162b2 a mRNA-1273 významně zvýšily S{{ 38}} jako titry neutralizačních protilátek 2,72 × a 2,85 ×, v daném pořadí (obrázek 6, C a D). Je třeba poznamenat, že mezi účastníky se 3 celkovými kontakty s prudkým nárůstem jakýmkoli způsobem byly titry protilátek podobných S728-1157-u 3× vyšší u rekonvalescentních dvojitých vakcín ve srovnání s trojnásobnými vakcínami dosud neinfekčními, což naznačuje, že SARS-CoV{{ 51}} infekce optimálněji indukuje tento klonotyp. Mezi skupinami s hybridní imunitou jsme zaznamenali, že většina posílených jedinců s průlomem, kteří dostali bivalentní posilovací dávku vakcíny, měla jen nepatrně vyšší titr protilátek S728-1157 ve srovnání se skupinami preomikronovými rekonvalescentně očkovanými, což naznačuje, že S{{53} }} titr se pravděpodobně blížil k plató po 3 expozicích. Zkoumali jsme také titry polyklonálních protilátek, které soutěžily s CC12.3 a CR3022 kromě S728-1157. Všichni jedinci vykazovali relativně vysoké titry CC12.3- a protilátek podobných CR3022-, nezávisle na počtu a typu expozic (doplňkový obrázek 5), na rozdíl od toho, co jsme pozorovali u S728-1157- jako protilátky. Celkově tato data naznačují, že infekce SARS-CoV-2 i očkování mRNA přispívají k indukci protilátek podobným S728-1157-, přičemž infekce hraje dominantnější roli u očkovaných jedinců.
cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém
Konečně, při srovnání odpovědí proti 2P- a 6P-stabilizované špičce v mRNA-očkovací kohortě jsme zjistili, že většina skupin vyvolala podobné hladiny protilátek proti oběma konstruktům. Výjimkou byla neinfikovaná trojnásobně očkovaná skupina, která vykazovala statisticky vyšší, i když jen mírně zvýšenou, reaktivitu na 2P ve srovnání s 6P-stabilizovaným hrotem (obrázek 6E). Tyto údaje naznačují, že na rozdíl od přirozené infekce (obrázek 5, J a K) samotná vakcinace vyvolává polyklonální odpověď, která je více omezena na epitopy v konstruktu Spike-2P, v souladu s konstruktem Spike{{12 }}P formulace současných vakcín. Tato zjištění nakonec podporují myšlenku, že 6P-stabilizace budoucích vakcín proti SARS-CoV-2 by mohla být velkým přínosem při indukci široce ochranných klonotypů protilátek, jako je S728-1157.
Obrázek 5. Konvalescentní sérová protilátková kompetice se široce neutralizujícími RBD-reaktivními mAb a srovnání sérové protilátkové odpovědi proti 6P- versus 2P-stabilizovaným špičkám
Obrázek 6. Kompetice sérových protilátek vakcinovaných mRNA s S728-1157 neutralizujícími RBD-reaktivní mAb a srovnání sérové protilátkové odpovědi proti 6P- versus 2P-stabilizovaným hrotům.
Diskuse
V této studii identifikujeme silnou bnAb izolovanou z paměťové B buňky jedince, který se zotavil z infekce SARS-CoV-2 během počáteční vlny pandemie COVID-19. Tento bnAb, S728- 1157, si zachoval podstatnou vazebnou reaktivitu a měl konzistentní neutralizační aktivitu vůči všem testovaným SARS-CoV-2 VOC, včetně Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 a XBB a byl schopen podstatně snížit infekční virové titry po infekci Delta a BA.1 u křečků.
Zjistili jsme, že rekonvalescentní sérum z naší kohorty obsahovalo nízké koncentrace protilátek, které soutěží s S728-1157 (protilátka třídy 1/ RBS-A) a epitopem mAb třídy 2. To naznačuje, že S728-1157 je poněkud unikátní od jiných protilátek, které cílí na epitopy třídy 1, a je zřídka indukován v RBD-specifickém paměťovém B lymfocytu. Místo toho se zdálo, že naše přirozená infekční kohorta indukuje protilátky zacílené na epitop CR3022 (třída 4); protilátky této specificity jsou často zkříženě reaktivní, ale méně účinně neutralizují než protilátky cílené na RBS (14, 17). Tato data doplňují naše předchozí zjištění, která prokazují, že množství protilátek třídy 3/S309 v rekonvalescentních sérech může přispívat k neutralizační aktivitě proti Alfa a Gamma variantám, zatímco nedostatek protilátek třídy 2 může odpovídat za sníženou neutralizační schopnost proti Delta (15). . Bez ohledu na to, že šíře aktivity většiny těchto RBS-cílových protilátek (RBS-A/třída 1, RBS-B, C/třída 2 a RBS-D, S309/třída 3) proti variantám Omicron je velmi omezená. (11, 40, 45).
Klíčovou výzvou vpřed bude určit, jak zlepšit elicitaci široce zkříženě reaktivních protilátek na konzervované epitopy RBS. V tomto ohledu jsme zde pozorovali, že jedinci s hybridní imunitou vykazovali významně vyšší titry S728-1157-podobných protilátek než očkovaní jedinci bez předchozí infekce. Důležité je, že tento jev byl zaznamenán, i když byl počet expozic kontrolován (tj. u rekonvalescentních dvojitě očkovaných oproti neinfikovaným trojnásobně očkovaným), což naznačuje, že nějaký prvek imunity související s infekcí (nebo formulace vakcíny, která může napodobovat tento typ imunity) je důležitý pro vyvolání tohoto klonotypu. To je v souladu s experimentálními důkazy dokumentujícími, že jedinci s hybridní imunitou mají širší profily protilátkové reaktivity ve srovnání s těmi, kteří mají pouze imunitní reakce vyvolané očkováním nebo primární infekcí (9).
Zde uvedené struktury ilustrují, že S728-1157 váže epitop RBS-A/třída 1 v RBD s up-konformací. Zdá se, že tento epitop je snadněji dostupný na 6P-stabilizovaných hrotech, o kterých bylo hlášeno, že představují 2 RBD v horní části státu, ve srovnání s 2P hroty, které představují pouze 1 (30, 33, 46, 47), a ke kterým naše protilátky specifické pro up-konformační hrot vykazují zlepšenou vazbu. S728-1157 byl izolován po přirozené infekci; v takových kontextech je pravděpodobnost indukce klonů podobných S728-1157 pravděpodobně vyšší, vzhledem k tomu, že RBD musí být schopno přijmout konformaci nahoru, a to i přechodně, aby se navázal na ACE2, a tím odkryl tento epitop. Na rozdíl od většiny protilátek IGHV3-53/3-66 RBS-A/třídy 1 se S728-1157 může přizpůsobit klíčovým mutacím ve špičkách VOC pomocí rozsáhlých interakcí mezi CDR-H3 a RBD (29, 48–50). S728-1157 také používá odlišný lehký řetězec (IGLV3-9) ve srovnání s jinými méně širokými protilátkami, jako je CC12.3 (IGKV3-20), což může ovlivnit celkové vazebné interakce; naše analýza však ukazuje, že mezi lehkým řetězcem S728-1157 a RBD je méně vodíkových vazeb ve srovnání s CC12.3 (doplňková tabulka 7). Ačkoli většina kontaktních zbytků CDR-H3 kritických pro zkříženou reaktivitu VOC v této interakci je kódována zárodečnou linií a není zavedena somatickými mutacemi, několik somaticky mutovaných zbytků v rámcových oblastech nebo CDR-H1, CDR-H2 a CDR-L1 je zapojený do interakce se SARS-CoV-2 RBD. Na jedné straně to naznačuje, že paměťové B buňky kódující protilátky třídy IGHV3-53/66 by mohly získat podobný stupeň zkřížené reaktivity dalším afinitním zráním. Na druhou stranu to také naznačuje možnost navrhnout imunogeny cílené na zárodečnou linii, které cílí na S728-1157-jako naivní B buňky. I když může být náročné navrhnout vakcíny, které mohou specificky vyvolat S728-1157-podobné protilátky s vybranými CDR-H3 schopnými překonat mutace VOC, je povzbudivé, že restrikce genu IGHV je pozorována u jiných silných SARS-CoV{ {58}} studie neutralizující mAb (13, 15, 20–27). Alternativně to může být také proveditelné prostřednictvím iterativní imunizace s optimalizovanými imunogeny RBD, jak bylo dříve popsáno pro jiné patogeny (51–55).
Ačkoli bylo v RBS-A/ antigenním místě třídy 1 pozorováno mnoho mutací (18), pokud jde o epitop S728-1157, 13 z 15 celkových kontaktních zbytků RBD a 2 ze 3 CDR-H{{9} } vázané kontaktní zbytky RBD jsou konzervovány v rámci Omicron a všech ostatních VOC. To naznačuje, že oblast RBD, kde se nachází epitop S{10}}, může obsahovat zbytky kritické pro její dynamickou funkci a virovou zdatnost, a proto by byla méně tolerantní k mutacím a antigennímu driftu než okolní zbytky místa RBS-A/ třídy 1. Pokud je tomu tak, tendence ke ztrátě tohoto konkrétního epitopu, jak se vyvíjejí virové varianty, by měla být snížena, takže charakterizace S728-1157 a podobných protilátek a epitopů je důležitá pro vakcíny rezistentní na varianty nebo terapeutický vývoj mAb. Stručně řečeno, naše studie identifikuje bnAb, které mohou poskytnout informace o návrhu imunogenu pro vakcíny proti koronaviru nové generace odolné vůči variantám nebo sloužit jako mAb terapeutika, která jsou odolná vůči vývoji SARS CoV-2. Zejména z hlediska kombinované účinnosti a šíře se zdá, že S728-1157 je dosud nejlepší izolovanou protilátkou ve své třídě. Vzhledem k tomu, že tato protilátka se snadněji váže se stabilizací 6P, předpokládá se, že bude přednostně indukována rekombinantními spike proteiny nebo celým virem stabilizovaným 6P, což naznačuje, že modifikace hexaprolinem by mohla být přínosem pro budoucí konstrukty vakcín, aby byla optimálně chráněna proti budoucímu SARS-CoV. -2 variant a dalších arbovirů.
cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém
Metody
Izolace monoklonálních protilátek. PBMC byly izolovány z leukoredukčních filtrů a zmraženy, jak bylo popsáno dříve (24). B buňky byly obohaceny z PBMC pomocí FACS. Buňky byly obarveny CD19, CD3 a antigenovými sondami konjugovanými s oligofluoroforem; zájmové buňky byly identifikovány jako CD3– CD19+ Antigen+. Všechny mAb byly vytvořeny z buněk s oligo-značenými antigenovými návnadami, které byly identifikovány pomocí jednobuněčné RNA-Seq, jak bylo popsáno dříve (15, 24). Data jednotlivých B buněk generovaná v této studii byla uložena do Gene Expression Omnibus: GSE171703 a GSM5231088–GSM5231123.
Antigen-specifické B buňky byly vybrány tak, aby generovaly mAb na základě intenzity antigen-sondy analyzované pomocí JMP Pro 15. Geny těžkého a lehkého řetězce protilátky byly syntetizovány společností Integrated DNA Technologies (IDT) a klonovány do lidského IgG1 a lidského lehkého řetězce κ nebo λ expresní vektory sestavením Gibson, jak bylo popsáno dříve (56). Těžké a lehké řetězce odpovídající mAb byly přechodně kotransfekovány do buněk HEK293T (ATCC). Po transfekci po dobu 18 hodin byly transfekované buňky doplněny supernatantem hybridomového média bez proteinů (PFHM-II, Gibco). Supernatant obsahující secernovanou mAb byl sklizen v den 4 a purifikován pomocí protein A-agarózových kuliček (Thermo Fisher Scientific), jak bylo podrobně popsáno dříve (56). Sekvence těžkých a lehkých řetězců dobře charakterizovaných protilátek byly odvozeny z Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR30}22 (PDB ID: 6W7Y) a REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) a byly syntetizovány tak, jak je popsáno výše. CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) poskytla Meng Yuan ve Scripps Research Institute (San Diego, Kalifornie, USA). Exprese rekombinantního spike proteinu. Rekombinantní D614G SARS-CoV-2 celovečerní (FL) hrot, BA.{30}}P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, jednotlivé mutanty RBD (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q4933N, Q493N, Y505A a Y505F), kombinační mutant RBD (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD a MERS-CoV RBD byly vytvořeny interně. Stručně, rekombinantní antigeny byly exprimovány pomocí buněk Expi293F (Thermo Fisher Scientific). Požadovaný gen byl klonován do savčího expresního vektoru (interně modifikovaný AbVec) a transfekován pomocí soupravy ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) podle protokolu výrobce. Supernatant byl sklizen 4. den po transfekci a inkubován s Ni-nitrilotrioctovou kyselinou (Ni-NTA) agarózou (Qiagen). Čištění bylo prováděno za použití gravitační kolony a eluováno pufrem obsahujícím imidazol, jak bylo popsáno dříve (57, 58). Eluát byl pufrován a vyměněn za PBS za použití odstředivé jednotky Amicon (Millipore). Rekombinantní FL hroty stabilizované 2P mutacemi variant B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 a BA.4 Omicron a byly vyrobeno v Satherově laboratoři v Seattle Children's Research Institute. K417V, N439K a E484K RBD a rekombinantní FL hrot WT-2P a 6P byly vyrobeny v Krammerově laboratoři na Icahn School of Medicine na Mount Sinai. SARS-CoV-2-6P-Mut7 a hrot BA.{91}}P byly navrženy a vyrobeny tak, jak je popsáno v předchozí studii (59). Proteinové sekvence a zdroje pro každý antigen jsou uvedeny v doplňkové tabulce 4. ELISA. Rekombinantní SARS-CoV-2 spike/RBD proteiny byly naneseny na mikrotitrační destičky s vysokou vazbou proteinů (Costar) v koncentraci 2 ug/ml v PBS v množství 50 μl/jamku a ponechány přes noc při 4 stupních. Destičky byly promyty PBS obsahujícím 0,05 % Tween 20 (PBS-T) a blokovány 150 ul PBS obsahujícího 20 % FBS po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Monoklonální protilátky byly sériově naředěny 3-násobně počínaje 10 ug/ml v PBS a inkubovány v jamkách po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Destičky byly poté promyty a inkubovány s HRP-konjugovanou kozí anti-lidskou IgG protilátkou (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1,000) po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Po promytí bylo přidáno 100 ul substrátu Super AquaBlue ELISA (eBioscience) na jamku. Absorbance byla měřena při 405 nm na spektrofotometru pro mikrodestičky (Bio-Rad). Testy byly standardizovány pomocí kontrolní protilátky S144-509 (15), se známými vazebnými charakteristikami na každé destičce, a destičky byly vyvíjeny, dokud absorbance kontroly nedosáhla OD 3,0. Všechny mAb byly testovány v duplikátech a každý experiment byl proveden dvakrát.
Sérová ELISA. Mikrotitrační destičky s vysokou vazbou na proteiny byly potaženy rekombinantními spike antigeny SARS-CoV-2 v koncentraci 2 ug/ml v PBS přes noc při 4 stupních. Destičky byly promyty PBS 0.05% Tween a blokovány 200 μl PBS 0,1% Tween + 3% sušené odstředěné mléko po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě (RT). Vzorky plazmy byly před provedením sérologického experimentu tepelně inaktivovány po dobu 1 hodiny při 56 stupních. Plazma byla sériově naředěna 2-krát v PBS 0,1% Tween + 1% sušeného odstředěného mléka. Destičky byly inkubovány s ředěním séra po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. K detekci vazby protilátek byla použita kozí anti-lidská Ig sekundární protilátka konjugovaná s HRP naředěná v poměru 1:3000 s PBS 0,1% Tween + 1% sušeného odstředěného mléka. Po 1 hodině inkubace byly destičky vyvolány 100 ul roztoku SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) po dobu 10 minut. Poté bylo použito 50 ul 3M HCl k zastavení vývojové reakce. Absorbance byla měřena při 490 nm na spektrofotometru pro mikrodestičky (Bio-Rad). Koncové titry byly extrapolovány ze sigmoidální 4PL (kde x je log koncentrace) standardní křivky pro každý vzorek. Limit detekce (LOD) je definován jako střední + 3 SD signálu OD zaznamenaného pomocí plazmy od jedinců před SARS-CoV-2. Všechny výpočty byly provedeny v softwaru GraphPad Prism (verze 9.0).
Soutěžní ELISA. Pro stanovení klasifikace cílového epitopu RBD-reaktivních mAb byly provedeny kompetiční ELISA s použitím jiných mAb se známými vazebnými charakteristikami pro epitop jako kompetitivní mAb. Kompetitivní mAb byly biotinylovány pomocí EZ-Link sulfo-NHS-biotinu (Thermo Fisher Scientific) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Přebytek biotinu biotinylovaných mAb byl odstraněn pomocí 7k molekulární hmotnosti (MWCO) Zeba spin odsolovacích kolon (Thermo Fisher Scientific). Destičky byly potaženy 2 ug/ml RBD antigenu přes noc při 4 stupních. Destičky byly blokovány PBS–20% FBS po dobu 2 hodin při teplotě místnosti a bylo přidáno 2-násobné ředění mAb neurčené třídy nebo séra, počínaje 20 ug/ml mAb a ředění séra 1:10. Po inkubaci protilátky po dobu 2 hodin při teplotě místnosti byla přidána biotinylovaná kompetitivní mAb v koncentraci dvojnásobku její disociační konstanty (KD) a inkubována další 2 hodiny při teplotě místnosti společně s mAb nebo sérem, které bylo přidáno dříve. Destičky byly promyty a inkubovány se 100 ul HRP-konjugovaného streptavidinu (Southern Biotech) v ředění 1:1,000 po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Destičky byly vyvinuty se substrátem Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Pro normalizaci testů byla do jamky přidána kompetitivní biotinylovaná mAb bez jakýchkoli kompetitivních mAb nebo séra jako kontroly. Data byla zaznamenána, když absorbance kontrolní jamky dosáhla OD 1,0–1,5. Procento kompetice mezi mAb bylo poté vypočteno vydělením pozorované OD vzorku OD dosaženou pozitivní kontrolou, odečtením této hodnoty od 1 a vynásobením 100. Pro sérum byly OD transformovány log10 a analyzovány nelineární regresí, aby se určilo 50 % inhibiční koncentrace (IC50) pomocí softwaru GraphPad Prism (verze 9.0). Data byla transformována do Log1P a vynesena do grafu reprezentujícího reciproční ředění séra IC50 ředění séra, které může dosáhnout 50% kompetice se zájmovou kompetitivní mAb. Všechny mAb byly testovány duplicitně, každý experiment byl proveden 2krát nezávisle a hodnoty ze 2 nezávislých experimentů byly zprůměrovány.
Plakové testy. Plakové testy byly provedeny s SARS-CoV-2 variantními viry na Vero E6/TMPRSS2 buňkách (Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB)) (doplňková tabulka 5). Buňky byly kultivovány tak, aby bylo dosaženo 90% konfluence, než byly trypsinizovány a naočkovány v hustotě 3 × 104 buňky/jamku na 96-jamkové destičky. Následující den bylo 102 PFU varianty SARS-CoV{11}} inkubováno s 2-násobně naředěnými mAb po dobu 1 hodiny. Směs protilátka-virus byla inkubována s buňkami Vero E6/TMPRSS2 po dobu 3 dnů při 37 stupních. Destičky byly fixovány 20% methanolem a poté obarveny roztokem krystalové violeti. Úplné inhibiční koncentrace (IC99) byly vypočteny pomocí log (inhibitor) versus normalizovaná odezva (variabilní sklon), provedené v GraphPad Prism (verze 9.0). Všechny mAb byly testovány v duplikátech a každý experiment byl proveden dvakrát. Neutralizační test redukce zaostření. Neutralizační testy redukce fokusu (FRNT) byly použity ke stanovení neutralizačních aktivit jako další platforma kromě plakového testu. Sériová ředění séra počínaje konečnou koncentrací 1:20 byla smíchána se 103 fokusotvornými jednotkami viru na jamku a inkubována po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Shromážděný prepandemický vzorek séra sloužil jako kontrola. Směs protilátka-virus byla naočkována na buňky Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) v 96-jamkových destičkách a inkubována po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Do každé jamky byl přidán stejný objem roztoku methylcelulózy. Buňky byly inkubovány po dobu 16 hodin při 37 stupních a poté fixovány formalínem. Po odstranění formalínu byly buňky imunobarveny myší mAb proti SARS-CoV-1/2 nukleoproteinu [klon 1C7C7 (Sigma-Aldrich)] a následně kozím anti-myším imunoglobulinem značeným HRP (Sigma- Aldrich; A8924). Infikované buňky byly obarveny TrueBlue Substrate (SeraCare Life Sciences) a poté promyty destilovanou vodou. Po vysušení byla čísla ohnisek kvantifikována pomocí analyzátoru ImmunoSpot S6, softwaru ImmunoCapture a softwaru BioSpot (Cellular Technology). IC50 byla vypočtena z interpolované hodnoty z log (inhibitor) versus normalizovaná odezva s použitím nelineární regrese s proměnlivou strmostí (4 parametry) provedené v GraphPad Prism (verze 9.0).
Reference
1. Hou YJ, a kol. Varianta SARS-CoV-2 D614G vykazuje účinnou replikaci ex vivo a přenos in vivo. Věda. 2020;370(6523):1464–1468.
2. Garcia-Beltran WF, et al. Více variant SARS CoV-2 uniklo neutralizaci humorální imunitou vyvolanou vakcínou. Buňka. 2021;184(9):2523.
3. Wall EC, et al. Neutralizující protilátková aktivita proti SARS-CoV-2 VOCs B.1.617.2 a B.1.351 očkováním BNT162b2. Lanceta. 2021;397(10292):2331–2333.
4. Edara VV, et al. Infekce a reakce neutralizačních protilátek vyvolané vakcínou na varianty SARS-CoV-2 B.1.617. N Engl J Med. 2021;385(7):664–666.
5. Zhou D, a kol. Důkaz o úniku SARS-CoV-2 varianty B.1.351 z přirozeného a vakcínou indukovaného séra. Buňka. 2021;184(9):2348–2361.
6. Weisblum Y, a kol. Unikněte před neutralizačními protilátkami variantami spike proteinu SARS-CoV-2. Elife. 2020;9:e61312.
7. Graham F. Denní briefing: Varianta koronaviru Omicron uvádí vědce do pohotovosti. Příroda. 2021;
8. Karim SSA, Karim QA. Varianta Omicron SARS-CoV-2: nová kapitola pandemie COVID-19. Lanceta. 2021;398(10317):2126–2128.
9. Carreño JM, et al. Aktivita rekonvalescentního a očkovacího séra proti SARS-CoV-2 Omicron. Příroda. 2021;602(7898):682–688.
10. Wang Q, a kol. Alarmující vlastnosti úniků protilátek u rostoucích subvariant SARS-CoV-2 BQ a XBB. Buňka. 2022;186(2):279–286.
11. VanBlargan LA, et al. Infekční SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron virus uniká neutralizaci terapeutickými monoklonálními protilátkami. Nat Med. 2022;28(3):490–495.
12. Takashita E, a kol. Účinnost protilátek a antivirových léků proti Covid-19 Omicron Variant. N Engl J Med. 2022;386(10):995–998.
13. Yuan M, a kol. Rozpoznání vazebné domény receptoru SARS-CoV-2 pomocí neutralizačních protilátek. Biochem Biophys Res Commun. 2021;538:192–203.
14. Barnes CO, a kol. Struktury neutralizačních protilátek SARS-CoV-2 jsou základem terapeutických strategií. Příroda. 2020;588(7839):682–687.
15. Changrob S, a kol. Křížová neutralizace vznikajících variant SARS-CoV-2, které vyvolávají obavy, pomocí protilátek zacílených na odlišné epitopy na hrotu. Mbio. 2021;12(6):e0297521.
16. Guthmiller JJ, et al. Závažnost infekce SARS-CoV-2 je spojena s vynikající humorální imunitou proti hrotu. Mbio. 2021;12(1):e02940–20.
17. Greaney AJ, a kol. Mapování mutací SARS-CoV-2 RBD, které unikají vazbě různými třídami protilátek. Nat Commun. 2021;12(1):4196.
18. Liu H, Wilson IA. Ochranné neutralizační epitopy u SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022;310(1):76–92.
19. Jette CA a kol. Široká zkřížená reaktivita napříč arboviry projevovaná podskupinou neutralizačních protilátek od dárců COVID-19. Cell Rep. 2021;36(13):109760.
20. Brouwer PJM, et al. Silné neutralizační protilátky od pacientů s COVID-19 definují několik cílů zranitelnosti. Věda. 2020;369(6504):643–650.
21. Pinto D, a kol. Křížová neutralizace SARS CoV-2 lidskou monoklonální protilátkou SARS-CoV. Příroda. 2020;583(7815):290–295.
22. Robbiani DF a kol. Konvergentní protilátkové odpovědi na SARS-CoV-2 u pacientů v rekonvalescenci. Příroda. 2020;584(7821):437–442.
23. Yuan M, a kol. Strukturální základ sdílené protilátkové odpovědi na SARS-CoV-2. Věda. 2020;369(6507):1119–1123.
24. Dugan HL, a kol. Profilování imunodominance B buněk po infekci SARS-CoV-2 odhaluje vývoj protilátek proti neneutralizujícím virovým cílům. Imunita. 2021;54(6):1290–1303.
25. Rogers TF a kol. Izolace silných neutralizačních protilátek SARS CoV-2 a ochrana před onemocněním na modelu malého zvířete. Věda. 2020;369(6506):956–963.
26. Schmitz AJ, et al. Vakcínou indukovaná veřejná protilátka chrání před SARS-CoV-2 a novými variantami. Imunita. 2021;54(9):2159–2166.e6.
27. Shi R, a kol. Lidská neutralizační protilátka se zaměřuje na vazebné místo receptoru SARS-CoV-2. Příroda. 2020;584(7819):120–124.
28. Cao Y, a kol. Silné neutralizační protilátky proti SARS-CoV-2 identifikované vysoce výkonným jednobuněčným sekvenováním B buněk rekonvalescentních pacientů. Buňka. 2020;182(1):73–84.
29. Barnes CO, a kol. Struktury lidských protilátek navázaných na špičku SARS-CoV-2 odhalují běžné epitopy a opakující se rysy protilátek. Buňka. 2020;182(4):828–842.
30. Corbett KS, a kol. Návrh mRNA vakcíny SARS-CoV-2 umožněný prototypovou připraveností na patogeny. Příroda. 2020;586(7830):567–571.
31. Amanat F, a kol. Zavedení dvou prolinů a odstranění polybazického štěpného místa vedlo k vyšší účinnosti rekombinantní vakcíny proti SARS-CoV-2 založené na hrotech na myším modelu. mBio. 2021;12(2):e02648–20.
32. Sun W, a kol. Virus newcastleské choroby exprimující stabilizovaný spike protein SARS-CoV-2 indukuje ochranné imunitní reakce. Nat Commun. 2021;12(1):6197.
33. Hsieh CL, a kol. Strukturální návrh hrotů SARS-CoV-2 stabilizovaných před fůzí. Věda. 2020;369(6510):1501–1505.
34. Gobeil SM a kol. Strukturální rozmanitost SARS-CoV-2 Omikronové špičky. Mol Cell. 2022;82(11):2050–2068.
35. Yuan M, a kol. Vysoce konzervovaný kryptický epitop v receptorových vazebných doménách SARS-CoV-2 a SARS-CoV. Věda. 2020;368(6491):630–633.
36. Starr TN, a kol. Kompletní mapa SARS-CoV-2 RBD mutací, které unikají monoklonální protilátce LY-CoV555 a jejímu koktejlu s LY-CoV016. Cell Rep Med. 2021;2(4):100255.
37. Baum A, a kol. Protilátky REGN-COV2 předcházejí a léčí infekci SARS-CoV-2 u makaků rhesus a křečků. Věda. 2020;370(6520):1110–1115.
38. Wu NC a kol. Alternativní způsob vazby protilátek IGHV3-53 k vazebné doméně receptoru SARS-CoV-2. Cell Rep. 2020;33(3):108274.
39. Wu Y, a kol. Nesoutěžící pár lidských neutralizačních protilátek blokuje vazbu viru COVID{2}} na jeho receptor ACE2. Věda. 2020;368(6496):1274–1278.
40. Yuan M, a kol. Strukturální a funkční důsledky antigenního driftu v nedávných variantách SARS-CoV-2. Věda. 2021;373(6556):818–823.
41. Yan Q, a kol. Neutralizační protilátky zacílené na RBD 3-53-zárodečné linie IGHV jsou běžně přítomny v repertoáru protilátek pacientů s COVID-19. Objevující se mikroby infikují. 2021;10(1):1097–1111.
42. Zhang Q, a kol. Silné a ochranné IGHV3- 53/3-66 veřejné protilátky a jejich sdílený únikový mutant na vrcholu SARS-CoV-2. Nat Commun. 2021;12(1):4210.
43. Wang Z a kol. mRNA vakcínou vyvolané protilátky proti SARS-CoV-2 a cirkulující varianty. Příroda. 2021;592(7855):616–622.
44. Simon V, a kol. PAŘÍŽ a SPARTA: hledání Achillovy paty SARS-CoV-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.
45. Starr TN, a kol. Protilátky RBD proti SARS-CoV-2, které maximalizují šířku a odolnost proti úniku. Příroda. 2021;597(7874):97–102.
46. Walls AC, et al. Struktura, funkce a antigenicita vrcholového glykoproteinu SARS-CoV-2. Buňka. 2020;181(2):281–292.
47. Henderson R, a kol. Kontrola konformace vrcholového glykoproteinu SARS-CoV-2. Nat Struct Mol Biol. 2020;27(10):925–933.
48. Shrestha LB a kol. Široce neutralizující protilátky proti vznikajícím variantám SARS-CoV-2. Front Immunol. 2021;12:752003.
49. Greaney AJ, et al. Protilátky vyvolané vakcinací mRNA-1273 se vážou šířeji na doménu vázající receptor než protilátky z infekce SARS-CoV-2. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.
50. Reincke SM a kol. SARS-CoV-2 Beta variantní infekce vyvolává silné linie specifické a zkříženě reaktivní protilátky. Věda. 2022;375(6582):782–787.
51. Wrammert J, et al. Široce zkříženě reaktivní protilátky dominují lidské odpovědi B buněk proti pandemické infekci virem chřipky H1N1 v roce 2009. J Exp Med. 2011;208(1):181–193.
52. Guthmiller JJ, et al. První expozice široce neutralizujícím protilátkám vyvolaným pandemickým virem H1N1 zaměřeným na epitopy hemaglutininových hlav. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.
53. Bajic G, a kol. Chřipkové antigenní inženýrství se zaměřuje na imunitní reakce na subdominantní, ale široce ochranný virový epitop. Buněčný hostitelský mikrob. 2019;25(6):827–835.
54. Nachbagauer R, a kol. Přístup univerzální vakcíny proti viru chřipky na bázi chimérického hemaglutininu indukuje širokou a dlouhotrvající imunitu v randomizované, placebem kontrolované studii fáze I. Nat Med. 2021;27(1):106–114.
55. Angeletti D, a kol. Ohraničující imunodominanci s cílem zacílit subdominantní široce neutralizující epitopy. Proč Natl Acad Sci USA A. 2019;116(27):13474–13479.
56. Guthmiller JJ, et al. Účinný způsob generování monoklonálních protilátek z lidských B buněk. Metody Mol Biol. 2019;1904:109–145.
57. Amanat F, a kol. Sérologický test k detekci sérokonverze SARS-CoV-2 u lidí. Nat Med. 2020;26(7):1033–1036.
58. Stadlbauer D, a kol. Sérokonverze SARS-CoV-2 u lidí: podrobný protokol pro sérologický test, produkci antigenu a nastavení testu. Curr Protoc Microbiol. 2020; 57(1):e100.
59. Torres JL a kol. Strukturální pohledy na vysoce účinnou pan-neutralizační lidskou monoklonální protilátku SARS-CoV-2. Proč Natl Acad Sci USA. 2022;119(20):e2120976119.
60. Suloway C, a kol. Automatizovaná molekulární mikroskopie: nový systém Leginon. J Struct Biol. 2005;151(1):41–60.
61. Lander GC, a kol. Appion: integrované, databází řízené potrubí pro usnadnění EM zpracování obrazu. J Struct Biol. 2009;166(1):95–102.
62. Voss NR a kol. DoG Picker a TiltPicker: softwarové nástroje pro usnadnění výběru částic v jednočásticové elektronové mikroskopii. J Struct Biol. 2009;166(2):205–213.
63. Pettersen EF, a kol. UCSF Chimera--vizualizační systém pro průzkumný výzkum a analýzu. J Comput Chem. 2004;25(13):1605–1612.
64. Punjani A, et al. Nejednotné upřesnění: adaptivní regularizace zlepšuje kryo-EM rekonstrukci s jednou částicí. Metody Nat. 2020;17(12):1214–1221.
65. Zhang K. Gctf: Stanovení a korekce CTF v reálném čase. J Struct Biol. 2016;193(1):1–12.
66. Zivanov J, et al. Nové nástroje pro automatizované určování kryo-EM struktury s vysokým rozlišením v RELION-3. Elife. 2018;7:e42166.
67. Casanal A, et al. Aktuální vývoj v oblasti lysky pro vytváření makromolekulárních modelů elektronové kryomikroskopie a krystalografických dat. Protein Sci. 2020;29(4):1069–1078.
68. Frenz B a kol. Automatická oprava chyb v glykoproteinových strukturách pomocí rosetty. Struktura. 2019;27(1):134–139.
69. Klaholz BP. Odvozování a zpřesňování atomových modelů v krystalografii a kryo-EM: nejnovější nástroje Phenix pro usnadnění strukturní analýzy. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019;75(pt 10):878–881.
70. Pettersen EF, a kol. UCSF ChimeraX: Vizualizace struktury pro výzkumníky, pedagogy a vývojáře. Protein Sci. 2021;30(1):70–82.
71. Otwinowski Z, Minor W. Zpracování dat rentgenové difrakce shromážděných v oscilačním režimu. Metody Enzymol. 1997;276:307–326.
72. McCoy AJ, a kol. Phaser krystalografický software. J Appl Crystallogr. 2007;40(pt 4):658–674.
73. Qiang M, et al. Neutralizační protilátky proti SARS CoV-2 byly vybrány z knihovny lidských protilátek vytvořené před desítkami let. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.
74. Emsley P, Cowtan K. Coot: nástroje pro tvorbu modelů pro molekulární grafiku. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004;60(pt 12 pt 1):2126–2132.
75. Adams PD, a kol. PHENIX: komplexní systém založený na Pythonu pro řešení makromolekulárních struktur. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(pt 2):213–221.
76. Montiel-Garcia D, a kol. Epitope-Analyzer: Webový nástroj založený na struktuře pro analýzu široce neutralizujících epitopů. J Struct Biol. 2022;214(1):107839.