Sidt2 je klíčový protein v cestě autofagie-lysozomální degradace a je nezbytný pro udržení struktury ledvin a filtrační funkce Ⅱ
Nov 07, 2023
DISKUSE
Velké množství studií prokázalo, že LMP se podílejí na funkci ledvin nebo strukturální homeostáze [21–25]. Naše předchozí studie zjistila, že LMP Sidt2 ovlivňuje zánětlivou signální dráhu a způsobuje poškození myších glomerulárních mezangiálních buněk [28]. V této studii jsme poprvé zkoumali účinky LMP Sidt2 na strukturu a funkci myších ledvin. Bylo zjištěno, že delece Sidt2 vedla k fúzi procesů myší ledvinové nohy, ztluštění bazální membrány, edému renálních tubulárních epiteliálních buněk, poškození mikroklků a zvýšené proteinurii po 24 hodinách, což naznačuje, že ztráta Sidt2 vede k poškození filtrační funkce a struktura myší ledviny, ale jeho podrobný mechanismus není jasný.
Protože LMP jsou důležité funkční jednotky lysozomu [17] alysozomální dysfunkceje jedním z běžných patogenních faktorů mnoha chronických onemocnění ledvin (CDK) (odkaz [4, 29]), provedli jsme související výzkumy na lysozomech po deleci Sidt2 a zjistili jsme, že se snížil počet kyselých lysozomů a pH lysozomy se zvýšily in vitro. Nebyly však žádné zjevné změny v počtu primárních lysozomů vázaných na autofagozomy a celkových lysozomů analýzou elektronovou mikroskopií. Katepsiny představují největší skupinu proteolytických enzymů v lysozomech [30], mezi nimiž je CTSB jednou z nejhojnějších lysozomálních proteáz [31].
Vzhledem k tomu, že katepsiny je nutné pro zrání (aktivaci) okyselit, změna pH nakonec povede k významnému snížení degradace proteinů [32]. Hladiny in vivo a in vitro ukázaly sníženou aktivitu a obsah lysozomální kyselé hydrolázy, což dále potvrzuje, že Sidt2 inhibuje lysozomální funkci ovlivněním zrání proteáz v lysozomech.
KLIKNĚTE ZDE A ZÍSKEJTE BYLINNOU FORMULACI CISTANCHE PRO LEDVINY
Mezitím lysozom působí jako recyklační centrum pro degradaci buněčných metabolitů a odpadních produktů na konci autofagie [1]. Normální funkce lysozomální degradace je nezbytná pro autofagii, udržení buněčné homeostázy a umožnění přežití buněk ve fyziologických stavech [33–36]. Bylo prokázáno, že výskyt a rozvoj mnoha onemocnění ledvin souvisí s abnormální autofagií [37–39]. Nedávné studie zjistily, že Sidt2 je lysozomální DNA/RNA transportér. Nekonvenční typy autofagie prostřednictvím RNautofagie a DNautofagie (RDA) jsou důležité pro selektivní degradaci RNA/DNA [40]. Již dříve jsme zjistili, že delece Sidt2 poškozuje fúzi autofagozomů a lysozomů, což způsobuje, že poškozené mitochondrie nemohou být degradovány, což má za následek poškození struktury a funkce kosterního svalstva [41]. Proto jsme v této studii zkoumali autofagii, když bylo poškození ledvin způsobeno delecí Sidt2. Pozorovali jsme, že autofagolyzozomy byly akumulovány v ledvinách myší Sidt2−/− prostřednictvím elektronové mikroskopie. Autofagie je dynamický proces, zahrnující tvorbu autofagozomů a tvorbu a degradaci autofagolyzozomů. Tvorba časných autofagozomů je řízena genem Atg a tvorba LC3-II je známkou tvorby autofagozomů [42]. Zjistili jsme, že exprese proteinů Atg a LC3-II souvisejících s autofagií se obě zvýšily po deleci Sidt2, což naznačuje, že aktivita autofagie může být zvýšena. Akumulace LC3-II však může být způsobena také blokádou autofagolysozomové dráhy na konci autofagie
Pro další prozkoumání účinku Sidt2 na stav autofagie ledvin byla měřena exprese a tvorba cargo proteinu P62 a také byly zkoumány účinky léků, které se zaměřují na autofagii (CQ a RAPA). P62 je třeba kombinovat s LC3B a poté degradovat v lysozomu. Zvýšení hladiny proteinu P62 často představuje zablokování toku autofagie [43]. Abychom odstranili příčinu zvýšení produkce P62, měřili jsme hladinu mRNA P62 a zjistili jsme, že produkce P62 byla snížena, takže akumulace LC3-II byla pravděpodobně způsobena bráněnou degradací. Abychom dále prozkoumali proces autofagie, provedli jsme experiment s převrácením chlorochinu. Chlorochin může neutralizovat kyselé prostředí lysozomu a následně zničit funkci lysozomu a inhibovat autofagii [44]. Nárůst proteinu LC3-II před a po ošetření CQ odráží počet autofagozomů degradovaných lysozomy, což může odrážet aktivitu autofagie. Stejný CQ flip test lze také použít ke stanovení množství degradace P62 prostřednictvím autofagolysozomové dráhy. V souladu s našimi výsledky vedla delece Sidt2 ke snížení toku autofagie v důsledku zablokovaného konce autofagie. Současně se v experimentu RAPA hladiny proteinů LC3-II a P62 významně zvýšily ve skupině Sidt2−/−, což může dále podporovat, že nedostatek Sidt2 narušuje koncovou fázi autofagie.
Koncová fáze autofagie zahrnuje tvorbu a degradaci autofagolysozomů. K detekci fúze autofagozomů a lysozomů jsme použili LAMP1 a LC3B imunofluorescenční ko-lokalizační experimenty [45, 46] a výsledky ukázaly, že fúze autofagozomů a lysozomů byla zablokována po deleci Sidt2. Experiment s dvojitým značením Ad-mCherry-GFP-LC3B detekuje tvorbu a degradaci autofagolyzozomů [27]. Dále potvrdil, že blokáda tvorby a degradace autofagolyzozomů je hlavním důvodem poškození struktury a funkce ledvin po deleci Sidt2.
Z výše uvedených výsledků můžeme usoudit, že nepřítomnost Sidt2 způsobuje pokles počtu kyselých lysozomů a že acidifikační dysfunkce lysozomů ovlivňuje zrání hydrolyzovaných enzymů. To může být vedle poruch autofagosomu a lysozomové fúze nejdůležitější příčinou poškození autofagie-lysozomové degradační dráhy. Mezitím může narušený proces autofagie úzce souviset s poškozenou renální strukturou a funkcí filtru po deleci Sidt2 (obr. 8). Naše studie se zabývá pouze částí účinků Sidt2 na strukturu a funkci ledvin, ale zajímavé je, že akumulace klíčových autofagických proteinů a poškození struktury a funkce ledvin způsobené delecí Sidt2 jsou podobné změnám v klíčových autofagických proteinech a signifikantně zvýšená proteinurie pozorovaná u diabetické nefropatie [37, 47]. Oprava funkce lysozomů může být potenciální novou strategií léčby diabetické nefropatie [37]. Očekáváme, že Sidt2 v budoucnu poskytne způsob, jak prozkoumat patogenezi a léčbu onemocnění ledvin.
Testování proteinů v moči u myší Náhodně vybrané 12-týdenní myši WT a samci myší Sidt2−/− byli umístěni do metabolických klecí a nalačno, ale dostávali vodu. 24hodinové vzorky moči byly shromážděny a poté testovány na bílkovinu moči (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, CHN, C035-2-1) (podrobné metody najdete v Doplňkových materiálech). Buňky Myší glomerulární podocyty MPC5 byly zakoupeny od BeNa Culture Collection a kultivovány s 10% FBS (Excell Bio, Jižní Amerika, FSP500) a nízkoglukózovým DMEM (Sigma-Aldrich, 6046). Myší glomerulární mezangiální buňky SV40 MES 13 byly zakoupeny od typické buněčné banky výboru pro zachování kultury Čínské akademie věd a kultivovány s 10% FBS (Excell Bio, Jižní Amerika, FSP500) a DMEM s vysokým obsahem glukózy (Sigma-Aldrich, 6429) . Koncentrace CO2 v boxu pro buněčnou kulturu byla udržována na 5 % a teplota byla udržována na 37 stupních. Chlorochin (CQ) a rapamycin (RAPA) byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (C6628, V900930). 10 mM CQ a 25 mg/ml rapamycinu byly obě rozpuštěny v ultračisté vodě. CQ byl přidán do Petriho misky tak, aby konečná koncentrace byla 50 uM, a inkubován po dobu 16 hodin jako inhibitor autofagie. Rapamycin byl přidán do Petriho misky v konečné koncentraci 15 uM a inkubován po dobu 2 hodin jako aktivátor autofagie. Lentivirový vektorový systém pro úpravu genu CRISPR/Cas9 byl použit k odstranění genu Sidt2. Plasmidy Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang) byly zakoupeny a k tomu byl použit online návrhový nástroj sgRNA (http://crispr.mit.edu/). navrhněte sgRNA cílenou na Sidt2.
Sekvence primerů byly následující: F: 5'-ACCACACCGTGACCC CAC-3′, R: 5′-GTTGCGGGTCACTGGTGT-3′, syntetizované biotechnologickou společností (Sangon Biotech, Shanghai, CHN). S použitím lentivirového systému CRISPR/Cas9 byl plazmid Lenticrispr-v2 linearizován a spojen s nasedlým duplexem sgRNA za účelem konstrukce rekombinantního plazmidu Lenticrispr-v{{1{{18{181}}}}}} Sidt2. Transfekční činidlo Vigofect (Vigorous Biotechnology, Beijing, CHN) bylo použito k transfekci plazmidu Lenticrispr-v2 a rekombinantního plazmidu Lenticrispr-v2-Sidt2 za účelem konstrukce lentiviru. Získaný lentivirus byl transfekován do buněk MPC5 a buněk SV40 MES 13. Po 48 hodinách byly buňky inkubovány s purinomycinem po dobu 72 hodin do selekce. Přežívající buňky byly skupina Sidt2+/+ a skupina Sidt2−/−, které byly úspěšně transfekovány. Izolace RNA a test PCR v reálném čase Trizol (Invitrogen) byl použit k extrakci RNA z myších ledvinových buněk a specifická metoda RT-PCR byla popsána dříve [21]. Sekvence primerů RT-PCR byly následující: Aktin (smysl: F: 5′- GGACTCC TATGTGGGTGACG-3′, R:5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′), P62 (smysl: F:5 ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3′), Sidt2 (smysl: F:5′-TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC-3′CAGTC{R:55TGTGTG, GAGTCTG {48}}′). Western blotting Specifická metoda je jak již bylo zmíněno dříve [28]. V této studii primární protilátky zahrnovaly králičí anti-LC3B (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), králičí anti-P62 (1:1000; Abcam ab205719), myší anti- -aktin (1:1000; Sigma Aldrich A5316), králičí anti-Sidt2 (1:1000; Invitrogen PA5-69064), králičí anti-Atg5 (1:1000; Cell Signaling Technology 9980S), králičí anti-Atg7 (1:1000; Cell Signaling Technology 8558S) králičí anti-Atg12 (1:1000; Cell Signaling Technology 2011S), myší anti-LAMP1 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology H4A3), králičí anti-kathepsin B (1:1000; Cell Signaling Technology 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Buňky byly naočkovány na Petriho misky Nunc se skleněným dnem. Po růstu na vhodnou hustotu byl přidán Ad-mCherry-GFP-LC3B (Beyo time, Shanghai, CHN, C3011-10 ml), což vedlo ke konečné koncentraci 10 -11 vp/ml. Po stimulaci po dobu 48 hodin byly počty fluorescenčních bodů mCherry a GFP přímo pozorovány pod laserovým konfokálním mikroskopem (Leica SP8, Německo). Imunofluorescence Buňky byly naočkovány na Petriho misky se skleněným dnem a fixovány paraformaldehydem. Po zablokování byly buňky přes noc inkubovány s primární protilátkou a poté inkubovány se sekundární protilátkou po dobu 90 minut ve tmě. Buňky byly fotografovány pomocí laserového skenovacího konfokálního mikroskopu (Leica SP8, Německo) po obarvení jader pomocí DAPI (1 ug/ml). Primární protilátky zahrnovaly P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Santa Cruz Biotechnology H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); sekundární protilátky zahrnovaly anti-myší sekundární anti Cy3-konjugovaný Affinipure kozí anti-myší IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00009-1), CoraLite{134}}konjugovaný Affinipure kozí anti-myší IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite{139}} konjugovaný Affinipure kozí anti-králičí IgG (H+L) (1:200; Proteintech SA{144 }}). Pro LysoTracker (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046) jsme také naočkovali buňky na Petriho misky se skleněným dnem. Po růstu na vhodnou hustotu byla k buňkám přidána tekutina z buněčné kultury obsahující LysoTracker finální koncentraci 75 nM, které byly fotografovány po 45 m stimulace. Pomocí ImageJ spočítejte počet fluorescenčních bodů a Pearsonův korelační koeficient. Pozorování pomocí transmisního elektronového mikroskopu Z každé skupiny byli náhodně vybráni 3−5 12-týdenní samci myší Sidt2−/− a WT k přípravě vzorků ledvinové tkáně pro elektronovou mikroskopii a konkrétní metoda je popsána dříve [48] , náhodně pořiďte snímky řezů pomocí elektronového mikroskopu, pro každou myš existuje více než 10 snímků z řezů ledvin, náhodně vyberte 3–5 snímků s 8000× zvětšením ze snímků elektronového mikroskopu každé myši, vypočítejte počet autofagolyzozomů na obrázku a porovnejte skupinu Sidt2−/− se skupinou WT. Pokud jde o přípravu vzorků pro buněčný elektronový mikroskop, seškrábněte nejméně 105 buněk buněčnou škrabkou a shromážděte je do EP zkumavky, poté centrifugujte při 800 ot./min. po dobu 5 m, odstraňte supernatant a naplňte jej fixativem elektronového mikroskopu. Po uskladnění ve 4stupňové chladničce po dobu delší než 1 h může být předložen ke kontrole. Snímek z elektronového mikroskopu byl pořízen společností KingMed Diagnostics (Guangzhou, Čína). LysoSensor Buňky byly naočkovány na 96-jamkovou destičku. Po růstu na vhodnou hustotu bylo přidáno předehřáté (37 stupňů) médium obsahující 1 uM LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545). Buňky byly inkubovány po dobu 5 minut při 37 stupních a poté bylo médium odstraněno a nahrazeno po promytí buněk třikrát PBS. Režim WellScan byl použit ke čtení destičky v BioTek Citation 5 (BioTek, Winooski, VT, USA). Fluorescence byla měřena pomocí vlnových délek excitace/emise Ex360nm/Em450nm a Ex380nm/Em540nm a pH lysozomu bylo stanoveno z poměru Em540 k Em450. Statistická analýza Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± SEM. Statistické srovnání mezi dvěma skupinami bylo provedeno pomocí nepárových t-testů. Když byl pro statistickou analýzu použit software Graphics 8.0, P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné. Každá skupina experimentů v této studii byla opakována alespoň třikrát nezávisle. DOSTUPNOST DAT Soubory dat vytvořené a/nebo analyzované během aktuální studie jsou na přiměřenou žádost k dispozici od odpovídajícího autora.
REFERENCE
1. Settembre C, Fraldi A, Medina DL, Ballabio A. Signály z lysozomu: řídicí centrum pro buněčnou clearance a energetický metabolismus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013;14:283–96.
2. Lamming DW, Bar-Peled L. Lysosome: Metabolický signální uzel. Provoz. 2019;20:27–38.
3. Ballabio A. Úžasný lysozom. EMBO Mol Med. 2016;8:73–76.
4. Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi A, Kimura T, Namba T, Matsuda J, et al. Lysozomální dysfunkce vyvolaná dietou s vysokým obsahem tuků a narušený autofagický tok přispívají k lipotoxicitě v ledvinách. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1534–51.
5. Nonclercq D, Wrona S, Toubeau G, Zanen J, Heuson-Stiennon JA, Schaudies RP, et al. Tubulární poškození a regenerace v ledvinách potkana po akutní expozici gentamicinu: studie časového průběhu. Ren Fail. 1992;14:507–21.
Supporting Service Of Wecistanche-Největší vývozce cistanche v Číně:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Nakupujte pro další specifikace Podrobnosti:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
