Příjem soli, nikoli však bílkovin, je spojen se zrychlenou progresí onemocnění u autozomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin
Mar 03, 2022
Kontakt: emily.li@wecistanche.com
Bart J. Kramers1 , Iris W. Koorevaar1 , Joost PH Drenth2 , Johan W. de Fijter3 , Antonio Gomes Neto1, Dorien JM Peters4 , Priya Vart5 , Jack F. Wetzels5 , Robert Zietse6 , Ron T. Gansevoort1 a Esther Meijer
1 Nefrologická klinika, University Medical Center Groningen, University of Groningen, Groningen, Nizozemsko; 2 Oddělení gastroenterologie a hepatologie, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Nizozemsko; 3 Ústav nefrologie, Leiden University Medical Center, Leiden, Nizozemsko; 4 Ústav lidské genetiky, Leiden University Medical Center, Leiden, Nizozemsko; 5 Ústav nefrologie, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Nizozemsko; a 6 Ústav interního lékařství, Erasmus Medical Center Rotterdam, Rotterdam, Nizozemsko
KLÍČOVÁ SLOVA:ADPKD; sůl; vasopresin; močovina
Copyright ª 2020, International Society of Nephrology. Vydalo Elsevier Inc. Toto je článek s otevřeným přístupem pod licencí CC BY.
Korespondence: Esther Meijer, Odborné centrum pro polycystikuledvinyNemoci, Divize nefrologie, University Medical Center Groningen, PO 30 001,9700 RB Groningen, Nizozemsko. E-mail: B.J.Kramers@umcg.nl Přijato 14. února 2020; revidováno 10. dubna 2020; přijato 30. dubna 2020; publikováno online 10. června 2020 V autosomálně dominantní polycysticeledvinachoroba(ADPKD), existují jen vzácné údaje o vlivu příjmu soli a bílkovin na progresi onemocnění. Zde jsme studovali souvislost těchto dietních faktorů s rychlostí progrese onemocnění u ADPKD a jaké jsou zprostředkující faktory analýzou observační kohorty 589 pacientů s ADPKD. Příjem soli a bílkovin byl odhadnut z 24-hodinových vzorků moči a plazmatická koncentrace kopeptinu byla měřena jako náhrada za vasopresin. Asociace dietního příjmu s roční změnou odhadované glomerulární filtrace (eGFR) a růstem celkového objemu ledvin (htTKV) korigovaným na výšku byla analyzována pomocí smíšených modelů. V případě významných asociací byly provedeny mediační analýzy k objasnění potenciálních mechanismů. Tito pacienti (59 procent žen) měli průměrný výchozí věk 47 let, eGFR 64 ml/min/1,73 m2 a medián htTKV byl 880 ml. Průměrný odhadovaný příjem soli byl 9,1 g/den a příjem bílkovin 84 g/den. Během sledování s mediánem 4.0 let byl eGFR vyhodnocen jako medián šestkrát a 24-hodinová moč nasbírala medián pětkrát. Příjem soli byl významně spojen s roční změnou eGFR L{{20}}.11 (95procentní interval spolehlivosti 0.20 – L0). 02] ml/min/ 1,73 m2) na gram soli, zatímco příjem bílkovin nebyl (L0,00001 [L0,01 – 0,01] ml/min/1,73 m2) na gram soli
protein). Účinek příjmu soli na sklon eGFR byl významně zprostředkován plazmatickým kopeptinem (hrubá analýza: 77 procent zprostředkování a upravená analýza: 45 procent zprostředkování), ale ne systolickým krevním tlakem. Vyšší příjem soli, nikoli však vyšší příjem bílkovin, může být pro ADPKD škodlivý. Podstatné zprostředkování plazmatickým kopeptinem naznačuje, že tento účinek je primárně důsledkem soli indukovaného vzestupu vazopresinu.
U chronickýchledvinachoroba(CKD), restrikce soli se doporučuje ke zpomalení progrese onemocnění.1 restrikce soli snižuje krevní tlak a potencuje renoprotektivní účinky blokády renin-angiotenzin-aldosteronového systému (RAAS). kontroverzní, ačkoli několik metaanalýz naznačuje příznivý, i když malý účinek.3,4 U autozomálně dominantních polycystickýchledvina choroba(ADPKD) konkrétně existují pouze vzácné údaje o renálních účincích příjmu soli a bílkovin.
V Konsorciu pro radiologické zobrazovací studie u polycystickýchledviny Choroba(CRISP), observační studie u 241 pacientů s ADPKD s onemocněním v časném stadiu, vyšší exkrece sodíku močí (indikující vyšší příjem soli) byla spojena s rychlejším růstem objemu ledvin. V post hoc analýze HALT progrese polycystickýchledvinyChorobaStudie (HALT-PKD), randomizovaná kontrolovaná studie u 1044 pacientů s ADPKD v pozdějším stadiu, vylučování sodíku bylo spojeno se strmějším odhadovaným poklesem glomerulární filtrace (eGFR) u pacientů v pozdějším stadiu ADPKD, ale ne u pacientů v časném stadiu ADPKD.5,6 Bylo navrženo, že souvislost s poklesem eGFR může být způsobena restrikcí soli, která potencuje renální ochranné účinky blokády RAAS, podobně jako nonADPKD CKD.6 Alternativním vysvětlením by mohlo být, že příjem soli vede k urychlené progresi onemocnění ADPKD stimulací sekrece vazopresinu. Je známo, že vazopresin má kauzální souvislost s progresí onemocnění u ADPKD.7–9 Jedním z hlavních faktorů sekrece vazopresinu je koncentrace sodíku v plazmě,10 která se zvyšuje po požití soli.
Vzhledem k tomu, že vylučování močoviny močí nebylo ve studii HALT-PKD měřeno, není jasné, zda příjem bílkovin byl také spojen s poklesem eGFR.6 Vliv nízkého příjmu bílkovin na rychlost poklesu eGFR byl studován v post hoc analýze studie Modification of Diet in Renal Disease (MDRD), ve které byla nízkoproteinová dieta srovnávána s obvyklou dietou (studie A) a velmi nízkoproteinová dieta byla srovnávána s nízkoproteinovou dietou (studie B). V podskupině 200 pacientů s ADPKD nebyly v žádné podstudii žádné významné rozdíly; výsledky však byly vyšetřovateli považovány za neprůkazné, mimo jiné kvůli nedostatku síly.11,12
Vzhledem k těmto vzácným a neprůkazným údajům jsme se zaměřili na zkoumání vztahu mezi příjmem soli a bílkovin a poklesem renálních funkcí u ADPKD. K dosažení tohoto cíle jsme analyzovali data pacientů s ADPKD ve velké observační kohortě. Zaměřili jsme se také na studium, zda byla potenciální asociace zprostředkována vazopresinem nebo jinými potenciálními mechanismy.
Obrázek 1 |Posílení vývojového diagramu vykazování pozorovacích studií v epidemiologii (STROBE). DIPAK, Vývoj intervencí k zastavení progrese autozomálně dominantní polycystikyledvinyChoroba; eGFR, odhadovaný glomerulární
rychlost filtrace; FU, navaz.
VÝSLEDEK
Průběh kohorty je podrobně uveden na obrázku 1. Základní charakteristiky jsou uvedeny v tabulce 1. Průměrný věk byl 47 plus - 11 let, 59 procent účastníků byly ženy, eGFR byla 64 plus -24 ml/min za 1,73 m2 a medián výškově upraveného celkového objemu ledvin (htTKV) byl 880 ml (interkvartilní rozmezí [IQR]: 549, 1352). U 205 pacientů, kteří byli vyloučeni kvůli nedostatečným údajům ze sledování, nebyly žádné významné rozdíly ve věku, pohlaví, eGFR a htTKV. Vylučování sodíku bylo na začátku 156 plus - 65 mmol/24 hodin, což odpovídalo odhadovanému příjmu soli 9,1 plus - 3,8 g. Vylučování močoviny bylo 390 plus - 132 mmol/24 hodin, což odpovídalo odhadovanému příjmu bílkovin 84 plus - 25 g. Vylučování sodíku a vylučování močoviny během všech návštěv v rámci Rozvojových intervencí k zastavení progrese autosomálně dominantních polycystickýchledvinyChoroba(DIPAK) 1 studie a pozorovací kohorta DIPAK jsou znázorněny na obrázku 2.
Během střední doby sledování 4.0 let (IQR: 2,6, 5.0) byl eGFR hodnocen 6krát (IQR: 5, 14) a 24-hodina moči byla shromážděna 5krát (IQR: 4, 7). Průměrná roční změna eGFR byla 3,50 ml/min na 1,73 m2 za rok (95procentní interval spolehlivosti [CI]: 3,70 až 3,29).
Vylučování sodíku a vylučování močoviny
Vylučování sodíku silně korelovalo s vylučováním močoviny (standardizované b ¼ {{0}},61, nestandardizované b ¼ 1,8 mmol močoviny na mmol sodíku; 95procentní CI: 1,6 až 2.0; P < 0.0{{5{{60}}}}1).="" ve="" smíšené="" modelové="" analýze="" bylo="" vylučování="" sodíku="" vždy="" spojeno="" se="" změnou="" egfr="" (-="" 0,16="" ml/min="" na="" 1,73="" m2="" za="" rok="" na="" 18="" mmol="" sodíku;="" 95procentní="" ci:="" -0,24="" až="" {{="" 20}},08;="" p="">< 0,001),="" stejně="" jako="" vylučování="" močoviny="" (-="" 0,03="" ml/min="" na="" 1,73="" m2="" za="" rok="" na="" 40="" mmol="" močoviny;="" 95procentní="" ci:="" -="" 0,05="" až="" {="" {33}},001;="" p="" ¼="" 0,04).="" v="" multivariabilní="" analýze,="" upravené="" podle="" věku,="" pohlaví,="" tělesného="" povrchu="" (bsa),="" výchozí="" hodnoty="" httkv="" a="" mutace="" dna,="" zůstala="" asociace="" vylučování="" sodíku="" se="" změnou="" egfr="" statisticky="" významná="" (tabulka="" 2).="" naproti="" tomu="" asociace="" mezi="" vylučováním="" močoviny="" a="" sklonem="" egfr="" ztratila="" význam="" po="" úpravě="" na="" potenciální="" zmatky="" (tabulka="" 2).="" obrázek="" 3="" znázorňuje="" vztah="" mezi="" vylučováním="" sodíku="" a="" vylučováním="" močoviny="" a="" sklonem="" egfr.="" na="" základě="" exkrecí="" sodíku="" a="" močoviny="" jsme="" odhadli="" příjem="" soli="" a="" bílkovin.="" v="" modelu="" s="" více="" proměnnými="" byla="" souvislost="" mezi="" příjmem="" soli="" a="" změnou="" egfr="" -="" 0,11="" ml/min="" na="" 1,73="" m2="" za="" rok="" na="" gram="" soli="" (95procentní="" ci:="" -="" 0,20="" až="" {{48="" }},02;="" p="" ¼="" 0,02),="" spojení="" příjmu="" bílkovin="" se="" změnou="" egfr="" nebylo="" významné="" (-="" 0,00001="" ml/min="" na="" 1,73="" m2="" za="" rok="" na="" gram="" bílkoviny;="" 95procentní="" ci:="" {{58}="" },01="" až="" 0,01;="" p="0,9)" (doplňková="" tabulka="" s1a).="" když="" jsme="" vyloučili="" pacienty,="" kteří="" užívali="" lanreotid="" během="" studie="" dipak-1,="" výsledky="" byly="" v="" podstatě="" stejné="" (doplňková="" tabulka="">
V jednorozměrné analýze bylo vylučování sodíku i vylučování močoviny spojeno s růstem htTKV ({{0}},63 procent za rok na 18 mmol sodíku; 95procentní CI: 0,4{{8} } až {{10}},87; P < 0.001="" a="" 0,18="" procenta="" ročně="" na="" 40="" mmol="" močoviny;="" 95="" procent="" ci:="" 0,09="" až="" 0,28;="" p="">< 0,001).="" asociace="" vylučování="" sodíku="" s="" růstem="" httkv="" zůstala="" významná="" po="" úpravě="" podle="" věku,="" pohlaví,="" bsa,="" výchozí="" hodnoty="" httkv="" a="" mutace="" dna,="" zatímco="" asociace="" vylučování="" močoviny="" ztratila="" na="" významu="" (tabulka="">
stůl 1| Základní charakteristiky
Obrázek 2| Průměrné vylučování sodíku a vylučování močoviny při ročních návštěvách s odhadovaným příjmem soli a bílkovin. Whiskery označují rozmezí 5 až 95 procent. BL, základní linie.
Tabulka 2| Asociace vylučování sodíku a močoviny se sklonem eGFR (n [553)
BSA, plocha povrchu těla; CI, interval spolehlivosti; eGFR, odhadovaná rychlost glomerulární filtrace; Est, odhad; htTKV, výškově upravený celkový objem ledvin; PKD, polycystickéledvinachoroba; ref, odkaz. a Pro interakce proměnných s časem jsou uvedeny odhady a hodnoty P. Interakce s časem znamená účinek uvedené proměnné na eGFR v průběhu času: to znamená účinek na sklon eGFR. Model 1 ukazuje asociaci vylučování sodíku se sklonem eGFR. Model 2 ukazuje asociaci vylučování močoviny se sklonem eGFR. Model 3 ukazuje asociace vylučování sodíku a močoviny se sklonem eGFR ve stejném modelu. Všechny modely byly upraveny podle času, věku, pohlaví, BSA a jejich interakcí s časem. Odhady pro proměnné, které neinteragovaly s časem (nezobrazeno) znamenají účinek uvedené proměnné na základní eGFR (intercept).
Analýzy citlivosti
As sensitivity analyses, we repeated the linear mixed model analyses with salt and protein intake per kilogram ideal body weight, and salt and protein per kilogram actual body weight (Supplementary Table S1C and D). As additional sensitivity analyses, we repeated the analyses using baseline 24-hour excretions instead of mean excretions, we subsequently used median excretions instead of mean excretions. We excluded 24-hour urine collections if the 24-hour creatinine excretion was >30 procent odlišné od průměrného vylučování kreatininu daného účastníka. Nakonec jsme provedli analýzu citlivosti, ve které jsme upravili albuminurii. Všechny tyto analýzy přinesly v podstatě stejné výsledky.
Podskupinové analýzy
Testovali jsme rozdíly v souvislosti mezi příjmem soli a roční změnou eGFR v několika podskupinách (obrázek 4). Vyšší příjem soli byl spojen s rychlejším poklesem eGFR nebo neutrálním eGFR ve všech podskupinách. Interakční člen mezi užitím blokády RAAS a příjmem soli byl významný (P ¼ 0.02), se silnější negativní asociací u pacientů, kteří blokádu RAAS neužívali. Byl zaznamenán trend k významné interakci s věkem (P ¼ 0.06) a výchozím eGFR (P ¼ 0,07). Ve srovnání s pacienty, kteří neužívali blokádu RAAS, měli uživatelé blokády RAAS podobný příjem soli, ale byli starší, častěji ženy, měli nižší eGFR a měli jiné výchozí rozdíly (doplňková tabulka S2). U mladších pacientů byl významně vyšší průměrný příjem soli než u starších pacientů (9.0 - 2,7 g vs. 8.3 - 2,5 g; P ¼ 0,002). Příjem soli byl podobný u pacientů s vyšší eGFR (8,8 ± 2,8 g) au pacientů s nižší eGFR (8,4 ± 2,5 g; P ¼ 0,07).
Zprostředkování krevním tlakem, RAAS nebo kopeptinem
Provedli jsme modely strukturních rovnic, abychom otestovali možné mediátory asociace vylučování a sklonu eGFR. Nejprve jsme testovali, zda je efekt zprostředkován vlivem na krevní tlak. V tomto modelu se celkový účinek odhaduje
příjem soli na sklonu eGFR byl odhadnut jako {{{{10}}}},13 ml/min na 1,73 m2 za rok na gram kuchyňské soli (95procentní CI: -0,23 až - 0,02; P ¼ 0,03). Přímý vliv krevního tlaku na sklon eGFR byl signifikantní (0,02 ml/min na 1,73 m 2 za rok za
mm Hg; 95 procent CI: - 0.03 až -0.01; P ¼ 0,02). Přímý vliv příjmu soli na systolický krevní tlak byl však nevýznamný (P ¼ 0,3). Nepřímý účinek prostřednictvím systolického krevního tlaku tedy nebyl významný (odhad: - 0,005; 95 procent CI:
{{0}}.01 až 0,003; P ¼ 0,3). Nebylo tedy zjištěno žádné významné zprostředkování systolickým krevním tlakem.
Tabulka 3| Asociace odhadovaného příjmu soli a příjmu bílkovin s ročním růstem htTKV (n [283)
Testovali jsme, zda byl účinek příjmu soli na eGFR zprostředkován plazmatickým reninem a plazmatickým aldosteronem u pacientů, kteří neužívali blokádu RAAS (n ¼ 58). U těchto pacientů byl medián plazmatického reninu 1{{10}},6 pg/ml (IQR: 6,5, 16,7) a medián plazmatického aldosteronu byl 265 pg/ml (IQR: 181, 363). Oba nepřímé účinky nebyly signifikantní (P ¼ 0,3 a 0,4), což naznačuje, že neexistuje statisticky významné zprostředkování plazmatickým reninem nebo plazmatickým aldosteronem.
Dále jsme zkoumali, zda asociace vylučování sodíku a sklon eGFR byla zprostředkována kopeptinem (průměr 2 hodnot). Mezi 2 měřeními kopeptinu v plazmě byla vysoká korelace (Spearmanův koeficient: 0,85; P < 0.001)="" (doplňkový="" obrázek="" s1).="" v="" hrubém="" modelu="" byl="" celkový="" účinek="" příjmu="" soli="" na="" sklon="" egfr="" odhadnut="" jako="" -="" 0,16="" (95procentní="" ci:="" -0,23="" až="" -="" 0,09)="" ml/min="" na="" 1,73="" m2="" za="" rok="" na="" gram="" kuchyňské="" soli="" (p="">< 0,001).="" nepřímý="" účinek,="" zprostředkovaný="" kopeptinem,="" byl="" odhadnut="" na="" -="" 0,12="" (95procentní="" ci:="" -0,18="" až="" -="" 0,08)="" ml/min="" na="" 1,73="" m2="" za="" rok="" na="" gram="" kuchyňské="" soli="" (p="">< 0,001).="" účinek="" příjmu="" soli="" na="" sklon="" egfr="" je="" tedy="" zprostředkován="" kopeptinem="" ze="" 77="" procent="" (95="" procent="" ci:="" 32="" procent="" až="" 100="">
Po této hrubé analýze byl mediační model s kopeptinem upraven pro potenciální zmatky. V multivariabilní analýze byly výchozí věk, pohlaví a eGFR významně spojeny s plazmatickým kopeptinem kromě odhadovaného příjmu soli. Pohlaví a mutace DNA byly významně spojeny se sklonem eGFR vedle příjmu soli nebo plazmatického kopeptinu. Po úpravě o tyto proměnné byl celkový účinek příjmu soli na sklon eGFR {{{{10}}}},14 (95procentní CI: -0,23 až -0 .04) ml/min na 1,73 m2 za rok na gram kuchyňské soli (P ¼ 0,004) a nepřímý účinek byl - 0,06 (95% CI: 0,10 až - 0 P=0,004) (obrázek 5). V upravené analýze je tedy účinek příjmu soli na sklon eGFR zprostředkován kopeptinem ze 45 procent (95 procent CI: 1 procento až 89 procent). Neexistoval žádný náznak dopadu neměřeného zkreslení na tyto výsledky (doplňková tabulka S3).
Zopakovali jsme mediační analýzu se sklonem htTKV jako závisle proměnnou. Celkový vliv příjmu soli na sklon htTKV byl {{0}},59 procenta růstu htTKV za rok na gram kuchyňské soli (95 procent CI: 0,33 až 0). {6}}; P < 0.001).="" nebylo="" zjištěno="" žádné="" významné="" zprostředkování="" systolickým="" krevním="" tlakem="" (p="" ¼="" 0,5).="" nepřímý="" účinek,="" zprostředkovaný="" plazmatickým="" kopeptinem,="" byl="" statisticky="" významný="" (0,15="" procenta="" růstu="" httkv="" za="" rok="" na="" gram="" kuchyňské="" soli;="" 95procentní="" ci:="" 0,04="" až="" 0,25;="" p="" ¼="" 0,006).="" účinek="" příjmu="" soli="" na="" sklon="" httkv="" je="" tedy="" zprostředkován="" plazmatickým="" kopeptinem="" z="" 25="" procent="" (95="" procent="" ci:="" 4="" procenta="" až="" 45="">
Provedli jsme průzkumnou analýzu zprostředkování, abychom vyhodnotili, zda účinek kopeptinu na sklon eGFR byl naopak zprostředkován růstem htTKV. Rychlost změny htTKV byla významně spojena s rychlostí změny eGFR {{0}},38 procent na ml/min na 1,73 m 2 (P < 0.0{{19}="" }1).="" v="" hrubé="" analýze="" byl="" celkový="" účinek="" přirozeného="" logaritmicky="" transformovaného="" plazmatického="" kopeptinu="" na="" sklon="" egfr="" 1,51="" (95procentní="" ci:="" 1,88="" až="" 1,14;="" p="">< 0.001),="" nepřímý="" vliv="" prostřednictvím="" růstu="" httkv="" byl="" 0,20="" (95procentní="" ci:="" 0,34="" až="" 0,05;="" p="" ¼="" 0,008),="" tedy="" 13="" procent="" (95procentní="" ci:="" 3="" procenta="" až="" 23="" procent)="" zprostředkování.="" po="" úpravě="" o="" zmatky="" však="" toto="" zprostředkování="" ztratilo="" statistickou="" významnost="" s="" nepřímým="" účinkem="" zprostředkování="" 0,12="" (95%="" ci:="" 0,26="" až="" 0,02;="" p="" ¼="" 0,09)="" a="" 8%="" (95%="" ci:="" 2="" až="" 8="">
Cistanche může zlepšit funkci ledvin
DISKUSE
V této studii jsme zjistili, že s poklesem funkce ledvin u ADPKD souvisí sůl, nikoli příjem bílkovin. Účinek je významně zprostředkován hladinou kopeptinu v plazmě, což naznačuje, že příjem soli může mít škodlivé účinky zvýšením vazopresinu.
Spojení příjmu soli s poklesem eGFR je v souladu se vzácnými dřívějšími zjištěními. Souvislost mezi vylučováním sodíku a progresí onemocnění ADPKD byla poprvé prokázána v kohortě CRISP, kde byla nalezena významná souvislost s růstem objemu ledvin.5 V multivariabilní analýze nebyla nalezena významná souvislost s poklesem eGFR. Jednalo se však o kohortu pacientů s časnou fází ADPKD, kde GFR ještě nezačala klesat. Hledání souvislostí s mírou poklesu eGFR v takové kohortě je obtížné. Vylučování sodíku v kohortě CRISP bylo vyšší než v našem souboru (193 86 vs. 156 65 mmol/24 hodin). Podobně v post hoc analýze studie HALT-PKD A, která zahrnovala pacienty s ranou fází ADPKD, nebyla souvislost mezi příjmem soli a poklesem eGFR významná (P ¼ 0,09). Naopak ve studii B HALT-PKD (která zahrnovala pacienty s ADPKD v pozdějším stadiu, průměrné vylučování sodíku bylo 178 80), souvislost příjmu soli s poklesem eGFR poukazovala na příznivé účinky restrikce soli.6 Podařilo se nám to potvrdit nález v souboru pacientů s ADPKD se širokým spektrem renálních funkcí. V rámci tohoto souboru byl významně vyšší průměrný příjem soli (a rozptyl) u mladších pacientů než u starších pacientů. To mohlo přispět k nalezení trendu k výrazně silnější asociaci mezi příjmem soli a poklesem eGFR v této podskupině.
Teoreticky by příjem bílkovin mohl být škodlivý prostřednictvím vazodilatačních účinků, které způsobují intraglomerulární hyperfiltraci, nebo zvýšením vazopresinu.13–15 Pokud je nám známo, pouze 2 studie hodnotily souvislost mezi příjmem bílkovin a poklesem eGFR u ADPKD. Podobně jako u vylučování sodíku nebylo možné v kohortě CRISP prokázat žádnou významnou souvislost mezi vylučováním močoviny a poklesem funkce ledvin.5 Post hoc analýza studie MDRD také neprokázala statisticky významný vliv nízkoproteinové diety na sklon eGFR u ADPKD .12 Výzkumníci však naznačují, že to může být způsobeno akutním hemodynamickým účinkem nižšího příjmu bílkovin, který způsobil akutní snížení GFR. Tento účinek mohl negovat následný příznivý účinek pomalejšího poklesu GFR, protože sledování nebylo dostatečně dlouhé.11 Kromě toho výzkumníci naznačují, že jim možná chyběla síla prokázat účinek.11 Jednou z výhod pozorovací povahy našeho studie je nedostatek akutního účinku dietního zásahu. Proto akutní hemodynamický efekt nemůže být vysvětlením, proč jsme nenašli souvislost ssnížení funkce ledvin. Ačkoli nemůžeme striktně vyloučit nedostatek síly jako vysvětlení, proč nenalezneme souvislost mezi příjmem bílkovin a poklesem eGFR, nezdá se, že by existoval trend k pozitivní asociaci po úpravě na potenciální zmatky, což snižuje pravděpodobnost.
Možným zprostředkujícím mechanismem účinku příjmu soli na progresi onemocnění by mohl být krevní tlak. Hypertenze citlivá na sůl je u CKD běžná. Kromě toho studie HALT-PKD prokázala příznivé účinky přísné kontroly krevního tlaku na růst TKV u ADPKD a také na pokles eGFR v podskupině pacientů s nejzávažnějším onemocněním.16,17 V naší studii skutečně došlo k negativní souvislost mezi krevním tlakem a poklesem eGFR. Nebyli jsme však schopni prokázat významnou souvislost mezi příjmem soli a krevním tlakem. V souladu s těmito výsledky analýza mediace neprokázala signifikantní zprostředkování systolickým krevním tlakem.
Dalším mechanismem, o kterém se předpokládá, že je základem příznivého účinku omezeného příjmu soli na progresi onemocnění ADPKD, je potenciace blokády RAAS.6 Post hoc analýza studie Irbesartan Diabetic Nephropathy Trial (IDNT) a redukce koncových bodů u NIDDM pomocí angiotensinu II Studie antagonisty losartanu (RENTAL) ukázaly, že nižší příjem sodíku v potravě zesiluje příznivé účinky blokády RAAS u 1137 pacientů s diabetickou nefropatií.18 Názor, že restrikce soli zesiluje renální protektivní účinky těchto léků, je dnes široce přijímán. Pokud by však mechanismem účinku u ADPKD byla potenciace blokády RAAS, očekávali bychom silnější příznivý účinek restrikce soli u uživatelů blokády RAAS než u pacientů, kteří blokádu RAAS neužívali. Jak ukazuje obrázek 4, nebylo tomu tak; souvislost s příjmem soli byla nejvýraznější u pacientů, kteří neužívali blokádu RAAS. Potenciace blokády RAAS se proto nezdá být primárním mechanismem za možným příznivým účinkem restrikce soli u ADPKD. Nebyli jsme schopni prokázat signifikantní mediační účinek reninu ani aldosteronu u pacientů, kteří neužívali blokádu RAAS; k vyvození definitivních závěrů nám však chyběla dostatečná síla.
Našli jsme signifikantní zprostředkování účinku příjmu soli kopeptinem, zástupným markerem vazopresinu. Je známo, že zvýšení příjmu soli způsobí zvýšení osmolality plazmy a spustí sekreci vazopresinu.10 Naopak ve své krátkodobé pilotní studii 34 pacientů s ADPKD Amro a kol.19 ukázali, že kombinovaná sůl a omezení bílkovin v kombinaci s upraveným příjmem vody vedlo ke snížení sekrece vazopresinu. U CKD obecně může vazopresin způsobit relativní glomerulární hyperfiltraci, která je potenciálně škodlivá.20 Konkrétně u ADPKD vazopresin způsobuje cystogenezi a je spojen s poklesem GFR.19 Léčba antagonisty vazopresinového receptoru V2 zlepšuje růst objemu ledvin a pokles eGFR.8, Nenalezení významného zprostředkování účinku plazmatického kopeptinu na pokles eGFR růstem htTKV v této studii naznačuje, že škodlivý účinek kopeptinu nemusí být primárně důsledkem růstu cyst. Zprostředkování účinku soli na pokles eGFR vazopresinem by také mohlo vysvětlit, že nebyl nalezen nezávislý účinek příjmu bílkovin. Experimenty ukázaly, že močovina je neúčinný osmol v plazmě: to znamená, že infuze sodíku způsobí mnohem větší zvýšení sekrece vazopresinu, než by tomu bylo při infuzi stejných osmolů močoviny.10 Pokud močovina nemá vliv na vazopresin, škodlivé účinky dietních faktorů u ADPKD jsou především prostřednictvím vazopresinu, nelze očekávat škodlivý účinek na příjem bílkovin.
Cistanche může tonizovat ledviny
Tato studie má svá omezení, která je třeba řešit. Kvůli nedostatku standardizované stravy se pravděpodobně během studie vyskytly rozdíly v příjmu soli a bílkovin mezi subjekty, což může zastírat souvislosti s rychlostí progrese onemocnění. Z tohoto důvodu jsme použili průměrné hodnoty všech 24-hodinových močů, které byly shromážděny v průběhu studie. Průměrné exkrece jsou pravděpodobně rozumným měřítkem průměrného příjmu. Navíc vzhledem k observační povaze této studie nelze vyvodit žádné definitivní závěry, pokud jde o kauzalitu.
Mezi hlavní silné stránky této studie patří časté následné návštěvy, které umožňují přesné odhady sklonu eGFR a odhad příjmu bílkovin a soli pomocí zlatých standardů: tj. odběrem několika 24-hodinových vzorků moči během celou dobu studia. Předchozí studie ukázaly, že k získání přesných asociací je nezbytných několik 24-hodinových odběrů, a my jsme získali medián 5 (IQR: 4, 7) vzorků na pacienta.21 Konečně, toto je první studie, která ukazuje asociaci mezi příjmem soli a sklonem eGFR v kohortě, kde jsou dobře zastoupeni jak pacienti v raném stádiu, tak pacienti s ADPKD v pozdějším stádiu.
Naše zjištění, že příjem 1 g soli je spojen s 0,11 ml/min na 1,73 m2 roční změny eGFR, naznačuje, že dodržování současných pokynů pro omezení sodíku by mohlo významně oddálit konečné stadium onemocnění ledvin. Pokud by 30-letý mužský pacient s eGFR 110 ml/min na 1,73 m2 dodržel aktuálně doporučené maximum 5 g kuchyňské soli denně místo 9,1 g (průměr v této kohortě), by hypoteticky zlepšilo jeho roční změnu eGFR z 3,50 ml/min na 1,73 m2 za rok (průměr v této kohortě) na 3,05 ml/min na 1,73 m2 za rok. Tento hypotetický pacient by odložilkonečné stadium onemocnění ledvino 4 roky, od 57 do 61 let. Tato hypotéza potřebuje potvrzení v intervenční studii. Protože tato kohorta zahrnovala několik pacientů s velmi nízkým odhadovaným příjmem soli, nemůžeme zkoumat potenciální účinek nižšího příjmu sodíku, a proto nemůžeme doporučit nižší omezení sodíku, než jsou současné pokyny. Na základě našich údajů nic nenasvědčuje tomu, že by omezení bílkovin bylo prospěšné. Dalšími přínosy restrikce solí by mohlo být snížení polyurie jak v pozdním stádiu ADPKD, tak u pacientů užívajících antagonistu receptoru vazopresinu V2 tolvaptan. V obou případech je osmolární vylučování hlavním určujícím faktorem objemu moči v důsledku poruch koncentrace moči.22 Zda příjem bílkovin a příjem soli mají stejné účinky na snížení polyurie, zůstává předmětem budoucích studií.
Závěrem lze říci, že tato studie ukazuje, že 24-hodinové vylučování sodíku močí je spojeno s rychlostí poklesu eGFR u ADPKD, a naznačuje, že omezení soli by mělo být důležitým cílem lékařů při léčbě ADPKD.
METODY
Pro tuto studii jsme použili data observační kohortové studie DIPAK, která byla navržena ke zkoumání přirozeného průběhu PKD. Tato kohortová studie byla zahájena s cílem pokračovat ve sledování pacientů s ADPKD, kteří se účastnili randomizované kontrolované studie DIPAK 1, ve které byl hodnocen renoprotektivní účinek somatostatinového analogu lanreotidu (n ¼ 305). Zařazení do observační kohorty bylo rozšířeno o pacienty s ADPKD z ambulance (n ¼ 489) a stále probíhá. Data byla shromážděna v univerzitních lékařských centrech v Groningenu, Leidenu, Nijmegenu a Rotterdamu. Design, metody a hlavní výsledky studie DIPAK 1 byly publikovány jinde.23,24 Stručně řečeno, pacienti byli zahrnuti v letech 2012 až 2015, pokud byli ve věku 18 až 60 let, měli ADPKD (modifikované Ravine kritérium25) a eGFR mezi 30 a 60 ml/min na 1,73 m2. Po základní návštěvě byli pacienti pozorováni ve 4., 8., 12., 48., 96., 120. a 132. týdnu a krev byla odebírána každých 12 týdnů. Po skončení studie souhlasilo 175 pacientů s pokračováním sledování. Kritéria pro zařazení do observační kohortové studie byly věk 18 let a eGFR 15 ml/min na 1,73 m2. Do 31. prosince 2017 byli všichni způsobilí pacienti, kteří byli viděni na ambulancích některého ze 4 center, požádáni o účast v observační studii. Kontraindikacemi účasti ve studii a observační kohortě byla souběžná onemocnění nebo užívání léků, které mohou ovlivnit přirozený průběh ADPKD (např. diabetes mellitus nebo chronické užívání nesteroidních protizánětlivých léků). Pro současné analýzy jsme zahrnuli pacienty s ADPKD s minimálním počtem hodnocení eGFR 3 během alespoň 2 let sledování, takže k analýze jsme ponechali 589 pacientů (Posílení hlášení o pozorovacích studiích v epidemiologii [STROBE] vývojový diagram, obrázek 1). Observační studie DIPAK byla schválena Institutional Review Board University Medical Center Groningen a provedena v souladu s pokyny Mezinárodní konference o harmonizaci – správné klinické praxi. Od všech pacientů byl získán písemný informovaný souhlas.
Měření
Kreatinin byl měřen pomocí izotopové diluční hmotnostní spektrometrie – sledovatelné enzymatické metody ve vzorcích skladovaných při {{0}}}C. eGFR byla odhadnuta pomocí vzorce CKD-EPI (Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration) založeného na kreatininu.26 Plazmatické koncentrace kopeptinu nalačno byly měřeny pomocí sendvičového imunotestu (B‧R‧A‧H‧M‧S, Thermo Fisher Scientific, Berlín, Německo), ve výchozím stavu u všech pacientů a také ve 12. týdnu u pacientů ve studii DIPAK 1. Renin (Renin III generace RIA; Cisbio Bioassays, Codelet, Francie) a aldosteron (Demeditec Diagnostics GmbH, Kiel, Německo) byly měřeny na začátku radioimunoanalýzou. Osmolalita byla měřena metodou snížení bodu tuhnutí, koncentrace sodíku a draslíku iontově specifickými elektrodami a močovina enzymovým kinetickým testem. Magnetická rezonance byla provedena pomocí standardizovaného protokolu magnetické rezonance bez použití intravenózního kontrastu. TKV byla hodnocena manuálním sledováním T2-vážených snímků koronální magnetické rezonance pomocí softwaru Analyze direct 9.0 (Ana lyzeDirect, Inc., Overland Park, KS).
24-hodina moči
Na začátku byly odebírány 24hodinové vzorky moči; v týdnech 12, 48, 96, 120 a 132; a v případě předčasného ukončení léčby během studie DIPAK 1 a poté každý rok. Pro všechny analýzy byly použity průměrné hodnoty všech dostupných 24-hodinových vzorků moči. Sodík byl měřen iontově specifickými elektrodami a močovina enzymovým kinetickým testem. Příjem soli byl odhadnut vynásobením exkrece sodíku součtem molární hmotnosti sodíku a chloridu: příjem soli ¼ exkrece sodíku (mol) (22,99 þ 35,45). Celkový příjem bílkovin byl odhadnut z vylučování močoviny metodou podle Maroni et al.27: příjem bílkovin ¼ [vylučování močoviny (mmol) 0,028 þ 0,031 tělesné hmotnosti (kg)] 6,25.
Statistické analýzy
Pro statistické analýzy jsme použili SPSS verze 23 (IBM Corp., Armonk, NY) nebo Stata SE 14 (StataCorp, College Station, TX) v případě lineárních smíšených modelových analýz. Pro všechny analýzy bylo 2-stranné P < 0.05="" považováno="" za="" statisticky="">
Smíšené modelové analýzy opakovaných měření byly použity k vyhodnocení asociací dietního příjmu se sklonem sklonu eGFR a pro analýzu sklonu byla zahrnuta všechna dostupná hodnocení eGFR. Pro exkrece sodíku a močoviny byly použity průměrné hodnoty všech dostupných 24-hodinových sběrů moči. Intercept a sklon se mohly náhodně měnit s nestrukturovanou kovarianční maticí. Fixními účinky v modelech byly čas, vylučování sodíku (nebo odhadovaný příjem soli), BSA, věk, pohlaví, htTKV a mutace DNA, stejně jako interakce těchto proměnných s časem. Významná doba interakce vylučování sodíku znamená souvislost s ročním poklesem eGFR. Podobné analýzy byly provedeny pro vylučování močoviny (nebo odhadovaný příjem bílkovin). Pacienti byli zahrnuti do analýzy všech dostupných dat v seznamu (kompletní případová analýza). Následné zobrazování magnetickou rezonancí bylo provedeno během studie DIPAK 1. Změna htTKV byla hodnocena pomocí log10-transformovaného htTKV
Antilog odhadovaného účinku byl odvozen z analýzy smíšeného modelu, aby byla poskytnuta roční procentuální změna htTKV. Validace modelu byla provedena vizuální kontrolou zbytkových ploch. Vynesli jsme histogramy zbytků úrovně 1 a histogramy zbytků náhodných sklonů a průsečíků. Standardizovaná rezidua byla vynesena proti předpokládaným hodnotám a času.
We performed a number of sensitivity analyses. Salt and protein intake were corrected for actual body weight and ideal body weight. Ideal body weight was derived using a body mass index of 22 kg/m2 as reference. Furthermore, the analyses were repeated excluding the 142 patients who received lanreotide treatment during the DIPAK 1 trial. We also performed sensitivity analyses to investigate the effect of urine collection errors. We repeated the analyses with median urinary excretion values instead of the mean, and we excluded follow-up urine collections if creatinine excretion was >30 procent odlišné od průměru. Nakonec jsme provedli analýzu citlivosti, ve které jsme místo toho použili výchozí 24-hodinové sběry moči
a provedli jsme analýzu citlivosti, ve které jsme upravili albuminurii.
Cistanche může zabránit infekci ledvin
Modely strukturních rovnic byly použity k provedení mediační analýzy se sklonem eGFR jako výslednou proměnnou; odhadovaný příjem soli jako expozice; a systolický krevní tlak, plazmatický kopeptin, plazmatický renin a plazmatický aldosteron jako potenciální mediátory. Pro copeptin byl pro analýzu mediace použit průměr ze 2 měření. Kopeptin byl přirozeně log-transformován. Mediační analýzy s plazmatickým reninem a aldosteronem byly provedeny pouze u pacientů, kteří neužívali blokádu RAAS. Směrnice a intercept eGFR byly přidány jako latentní proměnné. Na rozdíl od longitudinálních modelů se smíšenými efekty modely strukturních rovnic latentního růstu vyžadují časově strukturovaná data (tj. data shromážděná ve stejnou dobu od výchozího stavu pro každý subjekt). Data z pozorovací studie DIPAK proto nemohla být kombinována s daty ze studie DIPAK 1 a do této analýzy byla zahrnuta pouze data shromážděná během studie DIPAK 1. Stejná analýza byla opakována s růstem htTKV jako výslednou proměnnou.
V případě významného mediačního efektu na sklon eGFR jsme zkoumali roli potenciálního měřeného a neměřeného zmatení. Jako potenciální zmatky jsme hodnotili věk, pohlaví, BSA, výchozí eGFR, výchozí TKV (transformovaný log{0}}), mutaci DNA (PKD1 nebo PKD2), použití blokády RAAS a použití diuretik. Hodnotili jsme zmatek expozice-mediátor, zmatek mediátor-výsledek a zmatek expozice-mediátor. S použitím modelů strukturních rovnic jsme odhadli univariabilní asociace potenciálních matoucích faktorů s mediátorem a výsledkem. Následně jsme přidali všechny potenciální zmatky, které byly jednotně spojeny s multivariabilním modelem. Proměnné, které byly spojeny s expozicí nebo výsledkem v multiproměnné analýze (P < 0,05)="" po="" zpětné="" eliminaci,="" byly="" zahrnuty="" do="" modelu="" zprostředkování="" strukturální="" rovnice.="" vliv="" neměřeného="" zmatení="" byl="" hodnocen="" řadou="" analýz="" citlivosti="" podle="" metody="" imai="" et="">
Byly provedeny analýzy podskupin pro souvislost mezi příjmem soli a sklonem eGFR zahrnutím interakčního termínu mezi podskupinou a příjmem soli (podskupina příjmu soli) v multivariabilním smíšeném modelu, upraveném pro věk, pohlaví a BSA. Pokud byl výraz interakce významný, byla podskupina považována za významného moderátora asociace.
ZVEŘEJNĚNÍ
Autoři obdrželi neomezený grant od společnosti Ipsen (výrobce analogu somatostatinu) jako spolufinancování randomizované, kontrolované studie řízené výzkumnými pracovníky (studie DIPAK 1).
PODĚKOVÁNÍ
DIPAK Consortium je meziuniverzitní spolupráce v Nizozemsku, která byla založena za účelem studia ADPKD a rozvoje racionálních léčebných strategií pro toto onemocnění. DIPAK Consortium je sponzorováno Health Holland, Dutch Kidney Foundation (granty CP10.12 a CP15.01) a nizozemskou vládou (grant LSHM15018). Současnou studii sponzorovala Dutch Kidney Foundation (grant 18OKG04).
DOPLŇKOVÝ
MATERIÁL Doplňkový soubor (Word)
Obrázek S1. Rozptylový graf měření kopeptinu na začátku a v týdnu 12.
Tabulka S1. Analýzy citlivosti: asociace se sklonem odhadované GFR.
TabulkaS2. Základní charakteristiky pacientů, kteří používají blokádu RAAS, a pacientů, kteří blokádu RAAS nepoužívají.
Tabulka S3. Zprostředkování analýzy citlivosti.
REFERENCE
1. Onemocnění ledvin: Pracovní skupina pro CKD pro zlepšení globálních výsledků (KDIGO). Směrnice klinické praxe KDIGO 2012 pro hodnocení a léčbu chronického onemocnění ledvin. Kidney Int Suppl. 2013;3:1–150.
2. Humalda JK, Navis G. Dietní omezení sodíku: opomíjená terapeutická příležitost u chronického onemocnění ledvin. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2014;23:533–540.
3. Kasiske BL, Lakatua JD, Ma JZ, Louis TA. Metaanalýza účinků restrikce bílkovin ve stravě na rychlost poklesu funkce ledvin. Am J Kidney Dis. 1998;31:954–961.
4. Yan B, Su X, Xu B a kol. Vliv omezení dietních bílkovin na progresi chronického onemocnění ledvin: systematický přehled a metaanalýza. PLoS One. 2018;13:e0206134.
5. Torres VE, Grantham JJ, Chapman AB, et al. Potenciálně modifikovatelné faktory ovlivňující progresi autozomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin. Clin J Am Soc Nephrol. 2011;6:640–647.
6. Torres VE, Abebe KZ, Schrier RW, et al. Omezení soli v dietě je prospěšné při léčbě autozomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin. Kidney Int. 2017;91:493–500.
7. Boertien WE, Meijer E, Li J, et al. Vztah kopeptinu, náhradního markeru pro arginin vasopresin, se změnou celkového objemu ledvin a poklesem GFR u autozomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin: výsledky ze skupiny CRISP. Am J Kidney Dis. 2013;61:420–429.
8. Torres VE, Chapman AB, Devuyst O, a kol. Tolvaptan u pacientů s autozomálně dominantním polycystickým onemocněním ledvin. N Engl J Med. 2012;367: 2407–2418.
9. Torres VE, Chapman AB, Devuyst O, a kol. Tolvaptan u autozomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin v pozdějším stadiu. N Engl J Med. 2017;377: 1930–1942.
10. Zerbe RL, Robertson GL. Osmoregulace žízně a sekrece vasopresinu u lidských subjektů: Vliv různých rozpuštěných látek. Am J Physiol. 1983;244:E607–E614.
11. Levey AS, Greene T, Beck GJ a kol. Omezení bílkovin ve stravě a progrese chronického onemocnění ledvin: co všechny výsledky studie MDRD ukázaly? Úprava stravy ve studijní skupině onemocnění ledvin. J Am Soc Nephrol. 1999;10:2426–2439.
12. Klahr S, Breyer JA, Beck GJ a kol. Dietní omezení bílkovin, kontrola krevního tlaku a progrese polycystického onemocnění ledvin. Úprava stravy ve studijní skupině onemocnění ledvin. J Am Soc Nephrol. 1995;5:2037–2047.
13. Brenner BM, Meyer TW, Hostetter TH. Příjem bílkovin ve stravě a progresivní povaha onemocnění ledvin: role hemodynamicky zprostředkovaného glomerulárního poškození v patogenezi progresivní glomerulární sklerózy při stárnutí, renální ablaci a vnitřním renálním onemocnění. N Engl J Med. 1982;307:652–659.
14. Brenner BM. Hemodynamicky zprostředkované glomerulární poškození a progresivní povaha onemocnění ledvin. Kidney Int. 1983;23: 647–655.
15. Banker L, Roussel R, Bouby N. Proteinem a diabetem indukovaná glomerulární hyperfifiltrace: role glukagonu, vasopresinu a močoviny. Am J Physiol Renální Physiol. 2015;309:F2–F23.
16. Irazabal MV, Abebe KZ, Bae KT, et al. Návrh prognostického obohacení v klinických studiích pro autozomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin: klinická studie HALT-PKD. Transplantace nefrolového číselníku. 2017;32:1857–1865.
17. Schrier RW, Abebe KZ, Perrone RD, et al. Krevní tlak u časného autosomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin. N Engl J Med. 2014;371: 2255–2266.
18. Lambers Heerspink HJ, Holtkamp FA, Parving HH, et al. Snížení příjmu sodíku v potravě zesiluje renální a kardiovaskulární ochranné účinky blokátorů receptorů angiotenzinu. Kidney Int. 2012;82:330–337.
19. Amro OW, Paulus JK, Noubary F, Perrone RD. Nízkoosmolární dieta a upravený příjem vody pro snížení vazopresinu u autosomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin: pilotní randomizovaná kontrolovaná studie. Am J Kidney Dis. 2016;68:882–891.
20. Bankéř L, Bichet DG. Co nám může kopeptin říci u pacientů s autozomálně dominantní polycystickou chorobou? Kidney Int. 2019;96:19–22.
21. Olde Engberink RHG, van den Hoek TC, van Noordenne ND a kol. Použití jedné výchozí hodnoty versus víceletý 24-hodinový sběr moči pro odhad dlouhodobého příjmu sodíku a souvisejícího kardiovaskulárního a renálního rizika. Oběh. 2017;136:917–926.
22. Kramers BJ, van Gastel MDA, Boertien WE a kol. Determinanty objemu moči u pacientů s ADPKD s použitím antagonisty receptoru vazopresinu V2 tolvaptanu. Am J Kidney Dis. 2019;73:354–362.
23. Meijer E, Drenth JP, D'Angelo H, a kol. Odůvodnění a design studie DIPAK 1: randomizovaná kontrolovaná klinická studie hodnotící účinnost lanreotidu na zastavení progrese onemocnění u autozomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin. Am J Kidney Dis. 2014;63:446–455.
24. Meijer E, Visser FW, van Aerts RMM a kol. Vliv lanreotidu na funkci ledvin u pacientů s autozomálně dominantním polycystickým onemocněním ledvin: randomizovaná klinická studie DIPAK 1. JAMA. 2018;320:2010–2019.
25. Pei Y, Obaji J, Dupuis A, et al. Jednotná kritéria pro ultrasonografickou diagnostiku ADPKD. J Am Soc Nephrol. 2009;20:205–212.
26. Sands JM, Bichet DG, American College of Physicians. Americká fyziologická společnost. Nefrogenní diabetes insipidus. Ann Intern Med. 2006;144:186–194.
27. Maroni BJ, Steinman TI, Mitch WE. Metoda pro odhad příjmu dusíku u pacientů s chronickým selháním ledvin. Kidney Int. 1985;27:58–65.
28. Imai K, Keele L, Yamamoto T. Identifikace, inference a analýza citlivosti pro účinky kauzálního zprostředkování. Statist Sci. 2010;25:51–71.
