Abstraktní

Deprese představuje celosvětově vysoce převládající a invalidizující psychiatrickou poruchu. Rostoucí důkazy ukazují, že nadměrná neurozánětlivá aktivace v hipokampu podstatně přispívá k nástupu a progresi symptomů deprese. Cystanche fenylethanolové glykosidy (CPhG), hlavní bioaktivní složky extrahované z tradiční jedlé léčivé bylinyCistanche deserticolaaCistanche tubulosav předchozích studiích vykazovali četné neuroprotektivní farmakologické vlastnosti. Tento současný výzkum byl zaměřen na prozkoumání terapeutických dopadů a molekulárních mechanismů uplatňovaných CPhG na behaviorální fenotypy podobné depresi spouštěné chronickým nepředvídatelným mírným stresem (CUMS) u myší C57BL/6.

Šedesát myší C57BL/6 stupně SPF bylo náhodně rozděleno do šesti experimentálních kohort: kontrolní skupina, modelová skupina CUMS, skupina s vysokou dávkou CPhGs (700 mg/kg), skupina se střední dávkou CPhGs (350 mg/kg), skupina s nízkou dávkou CPhGs (175 mg/kg) a skupina s pozitivní kontrolou (5 mg/kg fluoxetinu). Po čtyřtýdenním drogovém žaludečním zásahu po modelování CUMS byla implementována komplexní neurobehaviorální hodnocení včetně testu preference sacharózy (SPT), testu na otevřeném poli (OFT), testu zavěšení ocasu (TST) a testu nuceného plavání (FST). Soupravy ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) kvantifikovaly sérové ​​koncentrace monoaminů neurotransmiterů spolu s hipokampálními prozánětlivými cytokiny a zánětlivými mediátory. Barvení hematoxylin-eosinem (HE) a barvení Nissl vizualizovalo neuronální patologická poranění v oblastech hippocampu dentate gyrus. Imunohistochemicky byla zjištěna intenzita exprese gliálního fibrilárního kyselého proteinu (GFAP), ionizované kalcium vázající adaptorové molekuly-1 (Iba-1), NLRP3 a proteinů kaspázy-1. Imunofluorescenční barvení dále hodnotilo stav aktivace upstream signalizační kaskády TLR4/NF‑κB.

Naše experimentální výsledky ukázaly, že perorální podávání CPhG pozoruhodně zmírnilo abnormality chování související s depresí. CPhG zvýšily procento preference sacharózy a zkrátily trvání imobility v paradigmatech chování založených na zoufalství. Léčba CPhG navíc obnovila vyčerpané hladiny serotoninu v séru a hipokampu (5‑HT) a také dopaminu (DA). Biochemická detekce odhalila významnou supresi hipokampálních prozánětlivých mediátorů a nadprodukce cytokinů. Histopatologická pozorování prokázala na dávce závislou úlevu od poškození hipokampálních neuronů vyvolaného CUMS. Imunohistochemické výsledky ukázaly, že CPhG zvýšily hustotu astrocytů označených GFAP, inhibovaly patologickou hyperaktivaci pouze-1-pozitivních mikroglií a snížily množství proteinů souvisejících s zánětem NLRP3. Imunofluorescenční testy potvrdily, že CPhG omezovaly nadměrnou TLR4 a fosforylovaly aktivaci NF‑κB p65 v hipokampální tkáni.

Souhrnně tato zjištění potvrzují, že CPhG vykazují významnou antidepresivní účinnost proti projevům deprese stimulovaným CUMS u myší. Jeho farmakologický mechanismus je částečně zprostředkován prostřednictvím duálních regulačních funkcí: obnovení homeostázy monoaminových neurotransmiterů a omezení neurozánětlivých reakcí zprostředkovaných signální osou TLR4/NF‑κB/NLRP3. Tato studie na zvířatech poskytuje předklinický experimentální základ podporující další využití CPhG jako slibných přírodních kandidátů nebo funkčních složek potravin pro adjuvantní intervenci deprese.

Klíčová slova: Cistanche fenylethanolové glykosidy (CPhGs); deprese; chronický nepředvídatelný mírný stres; neurozánět; astrocyty; mikroglie; Zánětlivá dráha TLR4/NF‑κB/NLRP3

1. Úvod

Deprese je mnohostranné afektivní psychiatrické onemocnění charakterizované základními klinickými projevy zahrnujícími přetrvávající nízkou náladu, anhedonii, psychomotorickou retardaci, poruchy spánku a bdění a somatickou dysfunkci. Těžké depresivní epizody potenciálně vedou k sebepoškozování a sebevražedným myšlenkám, což představuje celosvětovou obrovskou zátěž pro veřejné zdraví. Údaje z epidemiologického průzkumu z Číny uvádějí, že národní prevalence deprese dosáhla 2,1 % a Světová zdravotnická organizace zařadila depresivní poruchu mezi špičkově hodnocená onemocnění přispívající ke globální ztrátě let života v důsledku zdravotního postižení.

Nicméně kompletní molekulární etiologie, která je základem patogeneze deprese, zůstává neúplně objasněna, což brání dokonalým klinickým terapeutickým řešením. Současné patofyziologické hypotézy se zaměřily na mechanismy neuroimunitního přeslechu. Hromadící se preklinický a klinický výzkum zdůrazňuje přetrvávající neurozánět jako zásadní patogenní hnací sílu depresivních poruch. Při chronickém psychickém nebo fyziologickém stresu podléhají populace hipokampálních gliových buněk abnormální aktivaci. Nadměrně aktivované mikroglie a dysfunkční astrocyty spouštějí robustní uvolňování mnoha prozánětlivých mediátorů a vytvářejí tak amplifikační účinky kaskády prozánětlivých cytokinů. Takové neurozánětlivé inzulty dále vyvolávají neuronální morfologické zhoršení, metabolickou poruchu neurotransmiterů a poškození synaptické plasticity, což nakonec usnadňuje patologickou progresi podobnou depresi.

Současné hlavní klinické antidepresivní intervence spoléhají převážně na syntetická chemická antidepresiva reprezentovaná fluoxetinem, selektivním inhibitorem zpětného vychytávání serotoninu (SSRI). I přes částečnou úlevu od symptomů u některých pacientů mají syntetická antidepresiva dobře známé nevýhody: neuspokojivé poměry kompletní remise, časté reziduální depresivní symptomy, vysoká pravděpodobnost relapsu po vysazení medikace plus nežádoucí gastrointestinální, jaterní a metabolické vedlejší účinky při dlouhodobém podávání. Naproti tomu tradiční rostlinná léčiva se vyznačují vícecílovými modulačními charakteristikami a relativně mírnými bezpečnostními profily, a proto přitahují rostoucí zájem výzkumu o adjuvantní terapii poruch nálady.

Cistanche deserticolaaCistanche tubulosa, běžně nazývaný "pouštní ženšen", patří do čeledi Orobanchaceae. Jejich masité stonky slouží jako klasické homologní léčivo-potravinářské suroviny v tradiční asijské bylinářské praxi. Moderní farmakologické výzkumy dokumentují četné neuroprotektivní biologické aktivityCistancheextrakty, včetně antineurodegeneračních účinků proti Alzheimerově chorobě a Parkinsonově chorobě. Fenylethanolové glykosidy tvoří hlavní bioaktivní frakce uvnitřCistancheextrakty, obsahující hlavně echinakosid a verbascosid. Cystanche fenylethanolové glykosidy (CPhG) vykazují protinádorové, antioxidační, imunomodulační a neuroprotektivní biologické aktivity na různých experimentálních platformách.

Předchozí předběžné laboratorní práce prokázaly, že CPhG by mohly zvýšit koncentraci dopaminu ve striate a zmírnit depresivní fenotypy související s menopauzou na zvířecích modelech hlodavců. Zda však CPhG produkují ochranné vlivy na depresi spouštěnou chronickým stresem, a podrobné kaskády přenosu signálu zprostředkovávající takové biologické aktivity stále postrádají systematické zkoumání. Zvířecí paradigma chronického nepředvídatelného mírného stresu (CUMS) představuje jeden dobře zavedený model preklinické deprese. Vystavením laboratorních hlodavců různým náhodným mírným stresorům v průběhu následujících týdnů CUMS spolehlivě rekapituluje základní depresivní znaky, jako je anhedonie, behaviorální zoufalství a neuropatologické poškození hipokampu.

V souladu s tím tento výzkum zkonstruoval model depresivních myší vyvolaných CUMS pro systematické hodnocení in vivo účinnosti podobné antidepresivu u tří gradientových dávek CPhG. Zaměřili jsme se zejména na obnovu monoaminových neurotransmiterů, fenotypovou transformaci hipokampálních gliálních buněk a NLRP3 inflammasomovou neurozánětlivou dráhu řízenou TLR4/NF‑κB. Tato studie má za cíl poskytnout objektivní experimentální důkazy na podporu budoucího farmaceutického vývoje a aplikace CPhG na funkční potraviny zaměřené na zlepšení symptomů deprese.

2. Materiály a metody

2.1 Experimentální materiály, činidla a přístroje

Standardizovaný surový extrakt CPhGs byl získán od Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd (šarže č. . 20231221, Xinjiang, Čína). Celkový obsah fenylethanolových glykosidů větší nebo roven 85 %, obsahující echinakosid větší nebo roven 40 % a verbascosid větší nebo roven 16 %. Kapsle s hydrochloridem fluoxetinu byly získány od společnosti Patheon France. Komerční testovací soupravy ELISA pro 5‑HT, DA, iNOS, COX‑2, PGE2, TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑ byly získány od kvalifikovaných dodavatelů biologických činidel. Primární protilátky použité pro imunohistochemii a imunofluorescenci zahrnovaly protilátky anti‑GFAP, anti‑Iba‑1, anti‑NLRP3, anti‑Caspase‑1, anti‑TLR4 a anti‑fosfo‑NF‑κB p65. Histologické barvicí soupravy pro barvení HE a Nissl byly připraveny pro zpracování parafínových řezů mozku.

Klíčové laboratorní analytické přístroje zahrnovaly vysoce přesné elektronické analytické váhy, pracovní stanici pro čištění ultračisté vody Milli-Q, multimódovou čtečku mikrodestiček SpectraMax, vzpřímený fluorescenční mikroskop Leica a kompletní hardware pro analýzu chování hlodavců a softwarový systém pro sledování pohybu SMART 3.0.

Šedesát samců myší C57BL/6 třídy SPF, sedmitýdenních s počátečním rozsahem tělesné hmotnosti 18–22 g, bylo zakoupeno od společnosti Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Všechny experimentální manipulace na myších získaly formální etické schválení od Animal Ethics Committee of Shaanxi University of Chinese Medicine (ID etické schválení: SUCMDL120). Myši byly umístěny v zařízeních pro zvířata bez specifických patogenů. Parametry prostředí byly udržovány při teplotě okolí (21 ± 2) stupňů, relativní vlhkosti 60 % ± 10 %, za použití standardních 12hodinových cyklů osvětlení světlo-tma. Krmivo pro hlodavce a pitná voda byly přístupné ad libitum. Před zahájením formálních experimentálních pracovních postupů bylo provedeno jednotýdenní období adaptivní aklimatizace.

2.2 Seskupování zvířat, modelování CUMS a administrace léčiv

Po týdenním adaptivním zvedání vyloučil předběžný screening preference sacharózy jednotlivé myši s inherentní nízkou preferencí v pití cukru. Kvalifikované experimentální myši byly náhodně rozděleny do šesti studijních skupin (n = 10 zvířat v každé skupině):

Kontrolní skupina (Con): žádný stres CUMS, intragastrická aplikace izovolumetrické deionizované vody;

Modelová skupina CUMS (Mod): příjem plné stimulace CUMS, sonda se stejným objemem deionizované vody;

Skupina CPhG s vysokými dávkami (CPhGs‑H): expozice CUMS, CPhG 700 mg/kg tělesné hmotnosti denně sondou;

Skupina CPhG se střední dávkou (CPhGs‑M): expozice CUMS, CPhG 350 mg/kg denně sondou;

Skupina CPhG s nízkou dávkou (CPhGs‑L): expozice CUMS, CPhG 175 mg/kg denně sondou;

Fluoxetin pozitivní kontrolní skupina (FLX): expozice CUMS, fluoxetin 15 mg/kg žaludeční sondou jednou denně.

Pro konstrukci modelu CUMS bylo přijato deset různých druhů mírných stresorů: fyzické omezení (60 min), horizontální třesení (60 min), zavěšení ocasu (60 min), klec nakloněná pod úhlem 45 stupňů (24 h), vlhké prostředí podestýlky (24 h), izolace prázdné klece (24 h), plavání přes noc (12 stupňů studená voda – 4 h), plavání v horké vodě – 4 min., 4 min. po dobu 5 minut a stimulace ocasní svorkou trvající 2 minuty. Každý den byly náhodně aplikovány dva odlišné stresory; identický stresor by se neobjevil po sobě ve dvou sousedních dnech. Postup modelování CUMS trval čtyři týdny.

Po dokončení čtyřtýdenního modelování stresu byly odpovídající testované látky nebo rozpouštědlové vehikulum podávány intragastricky jednou denně po další čtyři týdny. V osmém experimentálním týdnu byly postupně implementovány všechny projekty neurobehaviorální detekce.

2.3 Neuro-behaviorální test baterie

2.3.1 Test preference sacharózy (SPT)

Test preference sacharózy hodnotí depresivní fenotyp jádra podobný anhedonii u hlodavců. Před formálním měřením byla každá myš umístěna samostatně. Byla provedena třídenní adaptační fáze sacharóza-nápoj. První den: dvě lahvičky 1% roztoku sacharózy umístěné do každé klece na 24 hodin. Druhý den: jedna lahvička s roztokem sacharózy spárovaná s jednou lahvičkou s čištěnou vodou. Den třetí: vyměňte polohu nádob s cukrovou vodou a nádob s čistou vodou, abyste eliminovali vliv zkreslení polohy. Po adaptačním cyklu myši hladověly po dobu 24 hodin od jídla a vody. Následně byla poskytnuta předem zvážená láhev na vodu s 1 % sacharózou a láhev na čištěnou vodu. Pozice lahví byly vyměněny po 12 hodinách. Po celkové době trvání 24 hodin testování byla přesně zaznamenána zbývající hmotnost kapaliny obou lahví. Míra preference sacharózy (%)=(spotřeba roztoku sacharózy)/(spotřeba roztoku sacharózy + spotřeba vyčištěné vody) × 100 %.

2.3.2 Test v otevřeném poli (OFT)

Zařízení na otevřeném poli tvořilo otevřenou krychlovou krabici o rozměrech 50 cm × 50 cm × 50 cm. Centrální čtvercová oblast byla definována jako centrální zóna o rozměrech 25 cm × 25 cm se středem uvnitř arény. Každá myš byla jemně umístěna na centrální povrch otevřeného pole. Byla povolena 5minutová volná adaptační doba. Behaviorální záznam a analýza dat se soustředily na následné pětiminutové pozorování. Primární indikátory odečtu obsahovaly celkovou vzdálenost pohybu, čas strávený uvnitř centrální zóny a frekvenci vstupů do centrální zóny. Tyto parametry odrážejí spontánní pohybovou aktivitu a ochotu objevovat v neznámých podmínkách prostředí.

2.3.3 Test zavěšení ocasu (TST)

Část myšího ocasu byla bezpečně upevněna, což umožnilo zvířeti viset hlavou dolů nad povrchem země. Celková doba záznamu byla šest minut. Bylo dokumentováno trvání nehybného času během pozdějšího čtyřminutového úseku. Prodloužená doba imobility představuje zvýšený behaviorálně-depresivní stav.

2.3.4 Test nuceného plavání (FST)

Průhledný válcový plavecký sud (průměr 15 cm, výška 50 cm) byl naplněn vodou udržovanou na (25 ± 2) stupních; hloubka vody dosáhla 20 cm. Každá myš byla jemně umístěna do plavecké nádoby na celkový šestiminutový interval záznamu. Doba plovoucí nehybnosti posledních čtyř minut byla statisticky kvantifikována. Delší období nehybnosti ukazuje na zesílené chování související se zoufalstvím.

2.4 Odběr vzorku a příprava tkáně

V 8. týdnu experimentu podstoupily myši intraperitoneální injekci 3% pentobarbitalu sodného (10 ml/kg) pro hlubokou anestezii. Vzorky krve byly odebrány technikou krvácení pro odstranění oční bulvy. Poté byla provedena cervikální dislokační eutanazie. Studená normální fyziologická srdeční perfuze vyčistila cirkulující krev uvnitř mozkových tkání. Kompletní vzorky celého mozku byly rychle vypreparovány. Polovina mozkových tkání byla ponořena do 4% roztoku paraformaldehydu na 72 hodin fixace tkáně pro následnou histologii. Oblasti mozku hippocampu byly rychle izolovány ze zbývajících vzorků mozku na předchlazené ledové platformě a uchovány v prostředí skladování kapalného dusíku. Pro biochemické měření bylo 10 mg vzorku hipokampální tkáně smícháno s předem vychlazeným normálním fyziologickým roztokem v poměru hmotnost/objem 1:9, přičemž byla podrobena mechanické homogenizaci v ledové lázni. Tkáňový homogenát byl centrifugován při 4000 ot./min po dobu 15 minut a frakce supernatantu byly shromážděny pro kvantifikaci biomarkerů ELISA.

2.5 Měření biochemického indexu

Podle provozních příruček výrobce komerčních souprav ELISA byly měřeny vzorky supernatantu séra a hipokampálního homogenátu, aby se získaly hodnoty koncentrace monoaminových neurotransmiterů včetně 5‑HT a DA. Supernatant hippokampálního homogenátu byl dále testován na zánětlivé mediátorové indikátory iNOS, COX-2, PGE2 spolu s prozánětlivými cytokiny TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6 a IFN‑. Odečty absorbance optické hustoty byly zachyceny pomocí spektrofotometru pro mikrodestičky. Koncentrace proteinu ve vzorku byla před detekcí cytokinů kalibrována pomocí soupravy pro kvantifikaci proteinu BCA.

2.6 Histopatologické barvení hipokampu

Fixované vzorky mozkové tkáně byly zality do parafínového vosku a nakrájeny na histologické řezy o tloušťce 4 μm. Pro HE barvení: parafinové řezy prošly xylenovým odparafínováním, gradientovou ethanolovou hydratací, hematoxylinovým nukleárním barvením, eosinovým cytoplazmatickým kontrastním barvením, chlorovo-alkoholovou diferenciací, gradientovou ethanolovou dehydratací, ošetřením xylenovou transparentností a neutrální gumou. Mikroskopické pozorování zaměřené na buněčnou morfologii, jaderný stav a cytoplazmatickou strukturální integritu v oblasti hippocampu dentatus gyrus.

Barvení Nissl vizualizuje neuronální Nissl tělíska odrážející neuronální biosyntetickou aktivitu a vitalitu buněk. Odvoskované parafínové plátky byly inkubovány v barvicím pracovním roztoku Nissl. Po krocích promývání destilovanou vodou byly sekce dehydratovány, zprůhledněny a uzavřeny. Histomorfologické variace hipokampálních neuronů byly pozorovány pod optickým mikroskopem.

2.7 Imunohistochemický test

Řezy hipokampální tkáně zalité v parafínu byly zbaveny vosku a hydratovány. Postupně byly implementovány kroky vyhledávání antigenu, blokování endogenní peroxidázy a blokování nespecifických vazeb na proteiny. Tkáňové řezy byly inkubovány přes noc při teplotě 4 stupňů se zředěnými primárními protilátkami: anti-GFAP (1:400), anti-Iba-1 (1:400), anti-NLRP3 (1:300), anti-Caspase-1 (1:400). Po inkubaci sekundární protilátky byla provedena DAB chromogenní reakce. Byly dokončeny postupy kontrastního barvení jádra, dehydratace a montáže. Digitální snímky zorného pole pořízené světelným mikroskopem. Software pro zpracování obrazu Image‑J vypočítal průměrné hodnoty optické hustoty, aby semikvantitativně vyhodnotil intenzitu exprese cílového proteinu.

2.8 Imunofluorescenční barvení

Připravené parafínové řezy hipokampu prošly odstraněním vosku, získáním antigenu a blokováním. Primární protilátky anti-TLR4 (1:400) a anti-fosfo-NF-κB p65 (1:200) byly aplikovány a inkubovány přes noc při podmínkách 4 °C. Fluorescenčně značené sekundární protilátky byly přidány pro hodinovou inkubaci ve stavu stínění před světlem. DAPI jaderné kontrastní barvivo bylo součástí montážního média. Laserový fluorescenční mikroskop fotografoval fluorescenční signály. Software Image‑J vypočítal průměrnou intenzitu fluorescence představující velikost aktivace proteinu TLR4 a p‑NF‑κB p65.

2.9 Statistická analýza

Původní experimentální data byla zpracována pomocí statistického softwaru SPSS 26.0 a grafického programu GraphPad Prism 9.0. Všechna kvantitativní výsledná data byla vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Meziskupinová statistická srovnání byla provedena pomocí vhodných statistických testů. P-hodnota menší než 0,05 byla posouzena jako statisticky významný rozdíl; P< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Experimentální výsledky

3.1 CPhGs Zlepšení symptomu anhedonie a obnovené hladiny neurotransmiterů monoaminů

Před zahájením modelování CUMS nevykazovala výchozí míra preference sacharózy žádný zjevný statistický rozptyl napříč všemi experimentálními kohortami zvířat. Po čtyřtýdenním stresu CUMS plus čtyřtýdenních intervenčních cyklech skupina modelu CUMS vykazovala zřetelně snížený poměr preference sacharózy ve srovnání s nestresovanými kontrolními zvířaty (P< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

Ve srovnání s kohortou modelu Mod vygenerovaly skupiny léčené CPhG s vysokou, střední a nízkou dávkou a také skupina pozitivní na fluoxetin výrazné zvýšení procenta preferenční sacharózy, sérového 5-HT, sérového DA, hipokampálního 5-HT a hipokampálního obsahu DA (P< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 Rozšířená průzkumná aktivita CPhG v testu v otevřeném poli

Při hodnocení chování v otevřeném poli vykazovaly myši modelu CUMS pozoruhodné snížení celkové vzdálenosti pohybu, doby setrvání v centrální zóně a frekvence vstupu do centrální oblasti oproti kontrolním myším (P< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 CPhG zkrácená doba nehybnosti v paradigmatech chování založených na zoufalství

Test zavěšení ocasu a test nuceného plavání detekují zoufalství v chování, což představuje odečet chování podobné depresi. Skupina Mod vykazovala drasticky prodlouženou dobu nehybnosti v TST i FST (P< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3.4 CPhG snížené nadměrně exprimované hipokampální prozánětlivé cytokiny

Koncentrace hippokampálních prozánětlivých cytokinů (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) u zvířat na modelu CUMS byly drasticky zvýšené ve srovnání s kontrolními protějšky (P< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3,5 CPhGs down-regulované biomarkery zánětlivého mediátoru hipokampu

Hippokampální zánětlivé mediátory iNOS, COX‑2 a PGE2 u myší modelu CUMS významně vzrostly (P< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3.6 CPhG zeslabené CUMS spouštěné hippokampální neuronální patologické poškození

Výsledky barvení HE: neurony hippocampu denta-gyrus ze skupiny Mod vykazovaly závažné patologické léze: neuspořádané buněčné uspořádání, pyknóza jádra, cytoplazmatická vakuolární degenerace, projevující se výrazné poškození neuronů. Skupina CPhGs‑L vykazovala pouze triviální efekt zlepšení. Střední a vysoké dávky CPhG zjevně zvrátily takové patologické změny; skupina s vysokou dávkou CPhGs‑H vykazovala lepší účinek ochrany neuronů ve srovnání se skupinou s fluoxetinem v částečném zorném poli.

Výsledky barvení podle Nissl: hipokampální neurony skupiny Mod vykazovaly neorganizované uspořádání, nápadné snížení množství Nissl corpuscle, což odráželo zhoršenou neuronální syntetickou funkci a nízkou buněčnou vitalitu. Podávání CPhG v závislosti na dávce obnovilo hojnost těla Nissl. Morfologie neuronů a hustota Nisslových tělísek ve skupině CPhGs-H se blížily normální úrovni kontrolní skupiny. Histopatologické nálezy potvrdily, že CPhG chrání integritu neuronů hipokampu před chronickým stresem zprostředkovanou destrukcí.

3.7 Stav aktivace hippocampu gliálních buněk regulovaný CPhG

GFAP je specifický biomarker pro populaci astrocytů. Ve srovnání se skupinou Con se intenzita pozitivního signálu hippocampu GFAP ve skupině Mod významně snížila (P< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

Iba‑1 proteinový marker představuje mikroglii. Modelová skupina CUMS vykazovala dramaticky zvýšený signál pozitivní exprese Iba‑1 (P< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3.8 CPhGs inhibovaná hipokampální exprese proteinů souvisejících se zánětem NLRP3

Imunohistochemická detekce ukázala, že exprese proteinu NLRP3 a kaspázy-1 v hippocampu skupiny Mod byly výrazně upregulovány (P< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3.9 CPhG potlačená nadměrná aktivace signální dráhy TLR4/NF‑κB

Imunofluorescenční detekce prokázala, že myši modelu CUMS vykazovaly významně zvýšenou intenzitu fluorescence TLR4 receptoru a fosforylované podjednotky NF‑κB p65 (P< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Diskuse

Velká depresivní porucha představuje závažné neuropsychiatrické onemocnění. V posledních letech přitáhla neurozánětlivá teorie deprese širokou výzkumnou pozornost. Chronický opakovaný psychický stres může vyvolat aktivaci vrozeného imunitního systému uvnitř centrálního nervového systému. Hippokampus, jedna oblast mozku vysoce zranitelná vůči stresovým urážkám, úzce souvisí s modulací nálady, zpracováním odměn a funkcí paměti. Při trvalé stresové stimulaci se homeostáza hipokampálních gliových buněk zhroutí. Hyperaktivované mikroglie a poškozené astrocyty vylučují velké množství prozánětlivých cytokinů, což vede k neuronálnímu strukturálnímu poškození, metabolické poruše monoaminů a neurotransmiterů a případně podporuje vznik chování podobné depresi.

Tradiční aktivní přírodní produkty odvozené z bylinných léků mají víceúčelové farmakologické výhody a stávají se slibnými kandidátskými zdroji pro objevování antidepresiv. CPhG jsou typické bioaktivní složky izolované zCistancheléčivá bylina. Tento výzkum vytvořil myší model chronické stresové deprese vyvolané CUMS, který komplexně ověřuje in vivo účinnost CPhG s gradientním dávkováním antidepresiv. Behaviorální experimentální výsledky ukázaly, že léčba CPhG významně zlepšila symptom anhedonie, zlepšila explorační aktivitu a snížila dobu nehybnosti související se zoufalstvím u myší s depresí, což ukazuje jasnou korelaci mezi dávkou a účinkem.

Hypotéza monoaminových neurotransmiterů je klasická teorie patogeneze deprese. Serotonin a dopamin přebírají kritické regulační role pokrývající emoční stabilizaci, vnímání zpětné vazby odměny a modulaci chování související s motivací. Stres CUMS vedl u našich modelových zvířat ke zřejmému poklesu koncentrací 5‑HT a DA v séru a tkáni hipokampu. Intervence CPhG účinně obnovila tyto dvě hladiny monoaminových neurotransmiterů. Tento výsledek je v souladu s dříve publikovanými výzkumnými zprávami týkajícími seCistancheextrakty modulující mozkové monoaminové neurotransmitery.

Další biochemické testování biomarkerů odhalilo, že CUMS indukoval robustní zvýšení četných prozánětlivých cytokinů (TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑) plus zánětlivých mediátorů (iNOS, COX‑2, PGE2) v hipokampální tkáni. Intervence CPhG významně zvrátila stav nadměrné exprese zánětu. Histopatologické barvení HE a Nissl intuitivně prokázalo, že CPhG zmírnily poškození hipokampálních neuronů způsobené stresem a chránily morfologickou integritu neuronů.

Populace gliových buněk slouží jako centrální účastníci zprostředkovávající neurozánětlivé reakce. Astrocyty udržují recyklaci neurotransmiterů, strukturální stabilitu hematoencefalické bariéry a zásobování neuronovou výživou. Mikroglie fungují jako rezidentní vrozené imunitní efektorové buňky uvnitř mozkového parenchymu. Chronický stres vyvolává ztrátu astrocytů nebo funkční inkompetenci spolu s patologickou hyperaktivací mikroglií. Naše imunohistochemická data ukázala, že léčba CPhG zvýšila hustotu astrocytů pozitivních na GFAP, mezitím snížila množství přeaktivovaných mikroglií v hipokampu označené Iba‑1. Tato regulační vlastnost fenotypu gliových buněk může být částečně základem neuroprotektivní a antidepresivní farmakologické účinnosti CPhG.

Inflammasom NLRP3 představuje životně důležitou molekulární platformu zprostředkující neurozánětlivou kaskádu. Jeho aktivace řídí zrání a sekreci downstream prozánětlivých cytokinů IL-1 a IL-18. Signální osa TLR4/NF‑κB působí jako základní primární primární signál pro aktivaci zánětu NLRP3. Stimulace receptoru TLR4 podporuje fosforylaci NF‑κB podjednotky a jadernou translokaci, dále transaktivuje NLRP3, transkripci genu pro-IL‑1. V naší současné studii stres CUMS spustil souběžné zvýšení exprese proteinu TLR4, fosforylovaného NF‑κB p65, NLRP3 a kaspázy‑1. Zásah CPhG zřetelně inhiboval aktivaci celé této signální kaskády. Dospěli jsme proto k závěru, že CPhG částečně zmírňují neurozánětlivé poškození tím, že omezují aktivaci zánětu NLRP3 zprostředkovanou TLR4/NF‑κB.

Celkově vzato, naše experimentální důkazy na zvířecím modelu podporují mechanický model: CPhG generují účinky podobné antidepresivům u depresivních myší vyvolaných CUMS prostřednictvím dvou primárních dimenzí: (1) obnovení homeostázy monoaminových neurotransmiterů souvisejících s náladou (5-HT, DA); (2) moduluje homeostázu hipokampálních gliálních buněk a potlačuje TLR4/NF‑κB řízenou NLRP3 inflammasom dependentní neurozánětlivou patologickou kaskádu.

Několik omezení tohoto zkoumání si zaslouží pozornost. Tato práce pouze implementovala experimenty in vivo na úrovni zvířat. Neprovedli jsme mechanické ověření na buněčné úrovni ani klinické studie na lidech. Proto by translační inference k léčbě deprese u člověka měla zůstat obezřetná. Kromě toho tento výzkum nerozebíral příspěvky jednotlivých monomerních sloučenin (echinakosid, verbascosid) ve směsném extraktu CPhGs. Budoucí výzkum se může soustředit na verifikaci mechanismu buněčné kultury, porovnávání aktivity jednotlivých složek a také na předběžné pilotní pozorování lidského subjektu.

5. Závěr

Cystanche fenylethanolové glykosidy (CPhG) produkují významné farmakologické účinky podobné antidepresivu proti chronickým nepředvídatelným, mírným stresem vyvolaným depresivním fenotypům chování u myší C57BL/6. Jeho terapeutické mechanismy jsou spojeny s obnovením sérových a hipokampálních hladin serotoninu a dopaminových neurotransmiterů, zachováním integrity neuronální struktury hipokampu, modulací funkční rovnováhy astrocyt-mikroglie, jakož i supresí TLR4/NF‑κB/NLRP3 zánětlivé patologické kaskády zprostředkované neurozánětlivými neurony. Tato preklinická studie na zvířatech poskytuje experimentální referenci pro další vývoj CPhG jako přírodní terapeutické adjuvantní látky nebo funkční složky potravy zaměřené na zlepšení symptomů deprese.

Reference

Ren L, Shao YT, Qin SH. Studie o identifikaci cíle a účinku saponinu A na depresivní poruchu. Nat Prod Res Dev, 2024, 36:44-51.

Fan L, Peng Y, Wang JW a kol. Celkové glykosidy ze stonků Cistanche tubulosa zmírňují chování podobné depresi: obousměrná interakce fytochemikálií a střevní mikroflóry. Fytomedicína, 2021, 83:153471.

Fan L, Peng Y, Chen XN a kol. Integrovaná analýza fytochemického složení, farmakokinetiky a síťové farmakologie pro zjištění rozdílů mezi stonky Cistanche deserticola a C. tubulosa na základě antidepresivní aktivity. Jídlo a funkce, 2022, 13:8542-8557.

Yirmiya R, Rimmerman N, Reshef R. Deprese jako mikrogliální onemocnění. Trends in Neurosciences, 2015, 38:637-658.

Jia XN, Gao ZH, Hu HL. Mikroglie v depresi: současné perspektivy. Science China-Life Sciences, 2021, 64:911-925.

Wu B, Gan AN, Wang RX a kol. Alpinia oxyphylla Miq. těkavý olej zlepšuje depresivní chování a inhibuje neurozánět u myší vystavených CUMS inhibicí signální dráhy MyD88/NF‑κB zprostředkované TLR4. Journal of Chemical Neuroanatomy, 2023,130:102270.