Renální ochranný účinek čočky Beluga předléčení pro ischemicko-reperfuzní poranění

Syng-ook Lee,¹ Tak mladý Chun,²EunHye Lee,²Bomi Kim,²bohyun Yoon,² a kol

Pozadí a cíl. Ischemické/reperfuzní (I/R) poranění způsobené akutnímledvinapoškozenízpůsobuje histopatologické změny, apoptózu tubulárních buněk, zánět, oxidaci a ztrátu funkce ledvin. Hodnotili jsme ochranné účinky před I/R poraněním čočky beluga. Materiály a metody. Myši byly rozděleny do čtyř skupin: normální, neléčené, nízké (2 mg) a vysoké dávky (8 mg) čočky beluga léčené. Čočka Beluga byla podávána perorálně po dobu 2 týdnů, následovala bilaterální ischemie ledvin po dobu 20 minut a reperfuze po dobu 30 minut. Vzorky krve aledvinatkáně byly shromážděny a analyzovány pro zkoumání renální funkce, histopatologie, epiteliálních a endoteliálních buněkpoškození, apoptóza, oxidační stres a zánětlivé reakce. Výsledek. Předléčené skupiny si zachovaly funkci ledvin s výrazně nižšími hladinami močovinového dusíku v krvi (BUN) a kreatininu ve srovnání s ostatními skupinami. Histopatologická analýza ukázala snížené poškození proximálního tubulu a snížení molekuly související s poškozením (ledvinaporanění molekuly 1 (KIM-1) a sekrece lipokalinu asociovaného s neutrofilní gelatinázou (NGAL) u předem ošetřených skupin ve srovnání s ostatními skupinami. Buňky pozitivní na terminální deoxynukleotidyltransferázu dUTP (TUNEL-) a sekrece molekul souvisejících s apoptózou (Fas a kaspáza 3) byly významně sníženy u předem ošetřených skupin ve srovnání s ostatními skupinami. Předem ošetřené skupiny vykazovaly pozitivní expresi genu asociovaného s mikrocévami (shluk diferenciace (CD31)) a expresi negativní adhezní molekuly (intracelulární adhezní molekula 1 (ICAM-1)). Ve skupinách před léčbou byl pozorován antioxidační účinek se sníženou expresí malonaldehydu (MDA) a zvýšenou sekrecí antioxidačních enzymů (superoxiddismutáza (SOD), kataláza (CAT), glutathion (GSH) a glutathionperoxidáza (GPx)). V předem ošetřených skupinách byly inhibovány F4/80 plus makrofágy a infiltrace CD4 plus T buněk a hladiny prozánětlivých cytokinů (interleukin- (IL-) 1, IL-6 a tumor nekrotizující faktor- (TNF-)) se snížily; nicméně hladiny protizánětlivých cytokinů (transformující růstový faktor- (TGF-), IL-10 a IL-22) vzrostly. Závěry. Předběžné ošetření čočkou Beluga prokázalo ochranné účinky proti poškození ledvin vyvolanému I/R prostřednictvím antiapoptotických, protizánětlivých a antioxidačních aktivit.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche propiedadesdeserticola bráníledvinanemoc, klikněte sem a získejte vzorek

1. Úvod

Ischemické/reperfuzní (I/R) poškození během parciální nefrektomie nebo transplantace ledviny způsobuje akutníledvinovéporanění [1, 2] a může vést k nevratnému zhoršení renálních funkcí [3]. Ischémie spouští apoptózu v renálních tubulárních epiteliálních buňkách, což zesiluje zánětlivé reakce intersticiálních buněk. Reperfuze indukuje mikrovaskulární poškození, které podporuje migraci zánětlivých buněk, prostřednictvím exprese adhezního faktoru na povrchu endoteliálních buněk [4– 8]. I/R poškození také způsobuje oxidační stres, zvyšuje reaktivní formy kyslíku (ROS) a snižuje aktivitu antioxidačních enzymů [9], což má za následek zvýšenou produkci prozánětlivých faktorů [10], aktivaci kaspázové dráhy a zvýšenou apoptotickou buněčnou smrt, což případně způsobit ztrátu funkce ledvin [11]. K prevenci I/R-indukovaného poškození ledvin bylo navrženo použití antioxidačních činidel s protizánětlivými a antiapoptotickými funkcemi [10–14].

Kultivary čočky (zelená, červená, francouzská nebo beluga) obsahují různé bioaktivní sloučeniny, zejména antioxidanty [15]. Jejich celkový obsah polyfenolů a flavonoidů se pohybuje od 27,30–30,30 mg (ekvivalenty kyseliny tříslové)/g do 13,14–16,29 mg (ekvivalenty kvercetinu)/g [16]. Bylo prokázáno, že čočka Beluga má významně vysoký obsah polyfenolů a účinky vychytávání ROS [16]. Náš tým popsal antioxidační účinky čočky pomocí in vitro experimentu s jaterní buněčnou linií [16]. Čočka Beluga prokázala významné ochranné účinky proti cytotoxicitě vyvolané alkoholem u buněk AML-12 ve srovnání s jinými kultivary čočky. Protizánětlivé účinky čočky beluga byly také pozorovány u buněk RAW264.7 ošetřených lipopolysacharidem [17]. Léčba čočkou Beluga významně snížila produkci oxidu dusnatého (NO) a indukovatelnou expresi NO syntázy (iNOS) prostřednictvím upregulace hemu zprostředkovaného jaderným faktorem E2-faktorem 2- (Nrf{21}}) oxygenázová-1 (HO-1) dráha. Tyto in vitro experimenty naznačovaly antioxidační a protizánětlivé účinky čočky beluga.

Abychom rozšířili aplikace čočky beluga, aplikovali jsme ji na myší model poškození ledvin I/R a vyhodnotili jsme renální ochranné účinky. Pro tento experiment byla čočka beluga podávána po dobu 2 týdnů jako předléčení, po které následovala ischemie po dobu 20 minut a reperfuze po dobu 30 minut. Renální ochranné účinky předléčby beluga čočkou byly ověřeny analýzou renálních funkcí, histopatologie, poškození epiteliálních a endoteliálních buněk, apoptózy, oxidačního stresu a zánětlivých reakcí. Předpokládali jsme, že předběžné ošetření čočkou beluga zabrání poškození ledvin vyvolanému I/R prostřednictvím antioxidačních, protizánětlivých a antiapoptotických aktivit.

2. Materiály a metody

2.1. Skupiny zvířat a podmínky léčby.

Všechny postupy byly provedeny pomocí zvířecího protokolu, který byl schválen Institucionálním výborem pro péči o zvířata a použití na univerzitě Yeungnam (AEC2019-003). Myši (ICR, 8 týdnů staré, samci, 23–25 g, Orient, Seongnam, Korea) byly náhodně rozděleny do následujících 4 skupin (n =7 na skupinu): (1) Normální, normální kontrolní skupina; (2) Neošetřená skupina léčená fyziologickým roztokem; (3) Nízká, nízká dávka (2 mg/100 μl fyziologického roztoku/-BioMed Research International myš), 14-denní skupina perorálně podávaná čočka beluga před léčbou; a (4) vysoká, vysoká dávka (8 mg/100 μl fyziologického roztoku/myš), 14-denní perorálně podávaná čočka beluga, skupina před léčbou. Čočku Beluga poskytl prof. Syng-Ook Lee (Keimyung University, Daegu, Korea) a příprava extraktu a analýza bioaktivních sloučenin byly popsány v předchozí studii [16]. Po ošetření byla zvířata umístěna do polohy na břiše, v anestezii a byla provedena dorzální incize [1]. Renální tepna a žíly pro obě ledviny byly uzavřeny cévní svorkou na 20 minut, poté následovala reperfuze po dobu 30 minut podle dříve popsaného protokolu [18, 19]. Krev byla odebrána srdeční punkcí a byly extrahovány ledviny. Ledviny byly promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem; jedna ledvina byla použita pro extrakci RNA a proteinu, zatímco druhá ledvina byla použita pro histologickou analýzu.

2.2. Histopatologické a imunohistochemické (IHC) analýzy.

Histopatologická vyšetření byla prováděna pomocí barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) a poranění byla hodnocena na základě následujících faktorů: přítomnost buněk tubulů spadajících do lumen, ztráta jádra v exfoliovaných buňkách, luminální zbytky, zhroucený luminální prostor a infiltrace imunitních buněk . Bodování bylo dosaženo patologickým specialistou: skóre 0, žádné tubulární poranění; skóre 1,<10% of="" tubules="" injured;="" score="" 2,="" 10–25%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 3,="" 25–50%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 4,="" 50–74%="" of="" tubules="" injured;="" and="" score="" 5,="">75 procent tubulů zraněno. Pro IHC analýzu byla ledvina fixována 4% paraformaldehydem a vzorky zalité v parafnu byly nařezány na 5μm řezy. H&E a IHC barvení bylo provedeno podle rutinních procesů. Na řezy byly aplikovány primární protilátky proti markerům imunitních buněk (F4/80 a shluk diferenciace 8 (CD8), Abcam, Cambridge, UK) a endoteliálních buněk (CD31 a intracelulární adhezní molekula 1 (ICAM-1), Abcam). , po dobu 24 hodin při 4 stupních (ředění 1:200), poté sekundární protilátka (Alexa Fluor 594, Life Technology, Waltham, MA, USA), po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě, a 4′,6-diamidino{ {19}}fenylindol (DAPI) byl použit k barvení jader.

2.3. Proteinový test.

Pro analýzu renálních funkcí bylo sérum separováno bez antikoagulantu a koncentrace sérového kreatininu a dusíku močoviny v krvi (BUN) byly detekovány pomocí kreatininové kolorimetrické soupravy a soupravy Quanti-Chrom Urea Assay Kit (BioAssay Systems LLC, Hayward, CA, USA ), resp. Pro hodnocení poškození renálních tubulů/cév, oxidačního stresu, antioxidačních enzymů a apoptózy byla ledvinová tkáň homogenizována s každým příslušným pufrem. K analýze poškození epiteliálních buněk renálních tubulů byly hodnoceny koncentrace molekuly poškození ledvin-1 (KIM-1) a neutrofilní gelatináza-asociovaný lipokalin (NGAL) pomocí enzymatického imunosorbentního testu (ELISA) (USCN Life Science Inc ., Wuhan, Čína). Pro analýzu apoptózy byly měřeny koncentrace Fas a kaspázy 3 pomocí příslušných souprav ELISA (Abcam). Pro vyhodnocení oxidačního stresu byly měřeny hladiny malonaldehydu (MDA) pomocí testovací soupravy MDA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute, Nanjing, Čína). Antioxidační enzymy, včetně superoxiddismutázy (SOD), katalázy (CAT), glutathionu (GSH) a glutathionperoxidázy (GPx), byly měřeny pomocí soupravy pro stanovení celkové SOD (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), testovací soupravy CAT ( Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), soupravu pro fluorometrické stanovení GSH a soupravu pro stanovení GPx (BioVision Inc.). Všechny soupravy byly použity podle pokynů výrobce.

2.4. Analýza genové exprese.

Celková RNA byla extrahována pomocí TRIzol Reagent a cDNA byla syntetizována z 20 ug celkové RNA pomocí soupravy pro syntézu cDNA (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Podmínky PCR v reálném čase byly následující: 95 stupňů po dobu 10 minut, následovaných 40 cykly 95 stupňů po dobu 10 sekund, 60 stupňů po dobu 50 sekund a 72 stupňů po 20 sekund. Amplifikace genu byla detekována pomocí SYBR green a k analýze exprese byla použita metoda 2−ΔACt. Experimenty byly provedeny v triplikátech s použitím následujících sekvencí primerů: interleukin- (IL-) 1, 5'-gcccatcctctgagactcat-3′ a 5'-aggccacagg- tattttgtcg-3′; IL-6, 5′-agttgccttcttgggactga-3′ a 5′ -tccacgatttcccagagaac-3′; tumor nekrotizující faktor- (TNF-), 5'-agcccccagtctgtatcctt-3′ a 5′-ctccctttgcagaactcagg-3′; transformující růstový faktor- (TGF-), 5'-tggttgtagaggg- caaggac-3′ a 5′-ttgcttcagctccacagaga-3′; IL-10, 5′ -acctggtagaagtgatgccc-3′ a 5′-agggtcttcagcttctcacc-3′; IL- 22, 5′-tccaacttccagcagccata-3′ a 5′-tagcactgactcctcggaac{59}}′; a glyceraldehyd 3'-fosfátdehydrogenáza (GAPDH), 5'-tgtgtccgtcgtggatctga-3′ a 5′-cctgcttcacc- caccttcttga-3′.

2.5. TUNEL test.

Pro hodnocení apoptózy byl proveden test dUTP zprostředkovaného značení dUTP (TUNEL) pomocí TdT za použití soupravy pro detekci apoptózy (Chemicon, Bedford, MA, USA) podle pokynů výrobce. Stručně, deparafinizovaná a rehydratovaná sklíčka byla štěpena 2 0 ug/ml proteinázy K při 37 stupních po dobu 15 hodin, aby se odstranily proteiny, a ošetřena 3,0 procenty peroxidu vodíku, aby se uhasila endogenní peroxidáza. Sklíčka byla ponořena do 1x TdT ekvilibračního pufru a byla přidána pracovní síla enzymu TdT na 1 hodinu při 37 stupních. Anti-digoxigeninový konjugát byl aplikován na 3'-OH DNA konec po dobu 30 minut a barva byla vyvolána pomocí peroxidázového substrátu po dobu 3 minut. Po ošetření DAPI byla sklíčka namontována. TUNEL-pozitivní jádra byla počítána ve všech zorných polích v každém vzorku tkáně při 200násobném zvětšení.

2.6. Statistická analýza.

Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka. Významné rozdíly u skupiny s I/R poškozením ledvin a skupiny s předléčenou čočkou beluga I/R byly vyhodnoceny pomocí analýzy rozptylu, po které následoval Tukeyho post hoc test v SPSS (Statistical Package for the Social Sciences v. 9). 2}}; Chicago, IL, USA). hodnoty p < 0,05="" byly="" považovány="" za="">

výhody cistanche salsy

3. Výsledky

3.1. Účinky předběžného ošetření čočky Beluga na funkci ledvin.

Obě předem ošetřené skupiny vykazovaly významné ochranné účinky proti I/R poranění (obrázek 1). Průměrné koncentrace BUN a sérového kreatininu v neléčené skupině byly 89 :92 ± 7:29 mg/dl a 0:48 ± 0:16 mg/dl, v daném pořadí. Předléčené skupiny vykazovaly významně snížený BUN (nízký: 22 : 6±3:67 mg/dl; vysoký: 21:6 ± 3:17 mg/dl) a sérový kreatinin (nízký: 0:25 ± {{19} }:04 mg/dl; vysoké: 0:23 ± 0:04 mg/dl) koncentrace ve srovnání s koncentracemi v neléčené skupině (p<0:01), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" two="" pretreatment="" groups.="" these="" results="" indicated="" that="" pretreatment="" with="" beluga="" lentils="" can="" protect="" against="" acute="" renal="" functional="">

3.2. Účinky předběžného ošetření čočky Beluga na poškození tubulárních epiteliálních buněk a apoptózu.

Tubulární poškození, zejména atrofie epiteliálních buněk, bylo často pozorováno ve vnější dřeni ledviny a v ledvinách byly občas identifikovány nukleární ztráty exfoliovaných buněk, luminální zbytky na renálním tubulu, zhroucený luminální prostor a intersticiální infiltráty neutrofilů. neléčená skupina (obrázek 2(a)). Naproti tomu ledviny z předem ošetřených skupin vykazovaly téměř normální buněčné morfologie a tubulární poškození bylo méně často pozorováno ve skupině s vysokou dávkou než ve skupině s nízkou dávkou. Když bylo zranění vyjádřeno jako procento na jednotku plochy, skóre zranění bylo u předem ošetřených skupin sníženo (nízké: 2:0±0:93; vysoké: 1:5± {{ 11}}:53) ve srovnání s neléčenou skupinou (2:87 ± 1:25) (obrázek 2(b)). Při zkoumání sekrece KIM-1 a NGAL (obrázek 2(c)) výsledky ELISA prokázaly, že obsah KIM{20}} se snížil v předem ošetřených skupinách (nízký: 1, 922:83 ± 199:42 pg/ mg, vysoká: 1 827:83 ± 278:26 pg/mg) ve srovnání s neléčenou skupinou (1 977:83 ± 184:49 pg/mg). Exprese NGAL byla významně snížena ve skupině s vysokou dávkou (489:34 ± 19 : 95 pg/mg) ve srovnání se skupinou s nízkou dávkou (527:36 ± 15: 19 pg/ml) a bez léčby (537:05 ± 15: 70 pg/mg) skupiny (str<>

Poté bylo analyzováno, zda poškození tubulárních epiteliálních buněk způsobilo apoptózu. Buněčná apoptóza byla hodnocena detekcí fragmentované chromozomální DNA pomocí testu TUNEL (obrázek 2(d)). TUNEL-pozitivní buňky byly zřídka pozorovány u předem ošetřených skupin (nízká: 5:00 ± 1:22; vysoká: 2:25 ± 1:09). Naproti tomu neléčená skupina vykazovala relativně zvýšený počet TUNEL-pozitivních buněk ve vnější oblasti dřeně (47:50 ± 16:77) (p<0:01), showing="" apoptotic="" bodies="" that="" extruded="" into="" the="" tubular="" lumen="" (figure="" 2(e)).="" when="" the="" secretion="" of="" apoptosis-related="" molecules="" (fas="" and="" caspase="" 3)="" was="" analyzed="" by="" elisa="" (figure="" 2(f)),="" fas="" expression="" was="" high:="" 3:96="" ±="" 0:55ng/mg)="" compared="" with="" that="" in="" the="" untreated="" group="" (7:10="" ±="" 0:87ng/mg),="" and="" caspase="" 3="" expression="" showed="" similar="" results="" (low:="" 8:44="" ±="" 2:05ng/mg;="" high:="" 8:25="" ±="" 1:28ng/="" mg;="" and="" untreated:="" 11:99="" ±="" 0:63ng/mg)="" (p=""><0:05). these="" results="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="">

apoptóza tubulárních epiteliálních buněk indukovaná I/R.

3.3. Účinky předběžného ošetření čočky Beluga na poškození endoteliálních buněk.

Účinky předběžného ošetření čočkou beluga na endoteliální buňky byly ověřeny pomocí IHC s použitím protilátky CD31 (obrázek 3(a)). V normální skupině byly identifikovány CD31-pozitivní krevní cévy, ale CD31-pozitivní buňky nebyly identifikovány v neléčené skupině, což ukazuje na I/R-indukovanou vaskulární disrupci. Skupina s předléčenou vysokou dávkou vykazovala CD31-pozitivní buňky v peritubulárních kapilárách, což ukazuje na cévní ochranný účinek předléčení vysokou dávkou čočky beluga. Endoteliální buňky byly vyšetřeny detekcí ICAM- 1, adhezní molekuly, a pozitivní buňky byly častěji identifikovány v tubulární oblasti neošetřené skupiny (46:4±41:7 buněk/sklíčko) ve srovnání s předem ošetřenými skupinami ( nízká: 5:77 ± 1:01 buněk/sklíčko; vysoká: 3:72 ± 1:05 buněk/sklíčko) (obrázek 3(b)). Tyto výsledky ukázaly, že předběžné ošetření čočkou beluga zachovalo kapiláry a inhibovalo aktivaci adhezních molekul na povrchu endoteliálních buněk.

3.4. Účinky předúpravy čočky Beluga na oxidační stres.

To evaluate the antioxidant effects of beluga lentil pretreat- ment, MDA, SOD, CAT, GSH, and GPx levels were detected by ELISA (Figure 4). MDA levels decreased in the pretreated groups (low: 0:85 ± 0:23nmol/mg; high: 0:81 ± 0:22nmol/ mg) compared with that in the untreated group (0:96 ± 0:11nmol/mg) (p >0:05) (Figure 4(a)). However, the antioxidant enzyme activities increased in the pretreated groups (Figure 4(b)) compared with those in the untreated group (p >{{{{20}}}}:05), pro SOD (nízká: 360:21 ± 56:42U/mL; vysoká: 362:7{{ 36}} ± 70 :32 U/ml a neošetřené: 333:52 ± 41:58 U/ml), CAT (nízká: 3:64 ± 1:09 nmol/g; vysoká: 3:21 ± 0:76 nmol/g; a neošetřená: 3:18 ± 0:40 nmol/g), GSH (nízká: 4:13 ± 0:53 nmol/mg; vysoká: 4:56 ± 0:69 nmol/mg; a neošetřená: 3:59 ± 0 :53 nmol/mg) a GPx (nízká: 198:89 ± 48:43 U/ug; vysoká: 219:61 ± 138:08 U/ug; a neošetřená: 165:14 ± 34:73 U/ug). Ačkoli tyto rozdíly nebyly statisticky významné, tyto výsledky naznačovaly, že předléčení čočkou beluga předcházelo I/R-indukovanému renálnímu oxidačnímu stresu zvýšením antioxidační účinnosti v ledvinách.

3.5. Účinky předběžného ošetření čočky Beluga na infiltraci imunitních buněk, cytokiny a zánět. Infiltrace makrofágů (F4/80 plus) a T buněk (CD4 plus) a uvolňování prozánětlivých cytokinů (IL-1, IL{7}} a TNF-) byly analyzovány za účelem vyhodnocení zánětu vyvolaného apoptózou. V předem ošetřených skupinách bylo pozorováno méně F4/80 plus a CD4 plus infiltrujících imunitních buněk než v neošetřené skupině, jak bylo hodnoceno analýzou IHC (obrázek 5(a)). Analýza PCR v reálném čase ukázala, že hladiny renálních mRNA prozánětlivých cytokinů (IL-1, TNF- a IL 6) se snížily v předléčené skupině ve srovnání s hladinami v neléčené skupině (obrázek 5(b) )). Hladiny mRNA protizánětlivých cytokinů (TGF- a IL-22) se však zvýšily u předem léčených skupin ve srovnání s neošetřenou skupinou, s výjimkou IL-10 (obrázek 5(c)). Tyto výsledky ukázaly, že I/R-indukovanému zánětlivému poškození ledvin lze předejít předléčením beluga čočkou v důsledku protizánětlivých účinků, ačkoli IL-10 nebyl ovlivněn.

doplněk antokyanů

4. Diskuze

Renální poškození vyvolané I/R je tradičně charakterizováno rychle klesající funkcí ledvin [20]. Renální funkci lze odhadnout pomocí hodnot BUN a sérového kreatininu, což jsou dusíkaté metabolické koncové produkty, které indikují funkci glomerulárního filtru [21]. Neléčená skupina vykazovala významně zvýšené hodnoty BUN (89:92 ± 7:29 mg/dl) a kreatininu (0:48 ± {{20}}:16 mg/dl), což ukazuje na funkční selhání ledvin indukované I/R. Avšak skupiny, které byly předem ošetřeny čočkou beluga, vykazovaly významně snížený BUN (nízký: 22:6±3:67 mg/dl; vysoký: 21:6±3:17 mg/dl) a sérový kreatinin (nízký: 0: 25 ± 0:04 mg/dl; vysoké: 0:23 ± 0:04 mg/dl) hodnoty (p<0:01) compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" group.="" these="" values="" are="" similar="" to="" those="" observed="" in="" normal="" mice="" (male,="" 6wks;="" bun:="" 22:68="" ±="" 3:05mg/dl;="" creatinine:="" 0:25="" ±="" 0:06mg/dl)="" [22].="" the="" significantly="" decreased="" bun="" and="" serum="" creatinine="" values="" observed="" in="" the="" pretreated="" groups="" relative="" to="" the="" untreated="" group="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="" exerted="" protective="" effects="" on="" renal="" function="" against="" i/r-induced="" renal="">

Snížená funkce ledvin ukazuje na problémy s glomerulární filtrací způsobené zpětným prosakováním glomerulárního filtrátu přes tubulární epitel, což je oblast, která je I/R nejzávažněji poškozena [23]. I/R měla za následek ztrátu jádra exfoliovaných buněk, luminální zbytky na renálním tubulu a kolaps luminálních prostorů v tubulárních epiteliálních buňkách. Předléčené skupiny vykazovaly snížené histopatologické tubulární poškození způsobem závislým na dávce. Pozorované histopatologické poškození tubulů bylo potvrzeno hodnocením molekulárních markerů, KIM-1 a NGAL [24]. KIM-1 je fosfatidylserinový receptor, který působí jako molekula rozpoznávající apoptotické buňky, přenáší poškozenou buňku do lysozomu za účelem apoptotické/nekrotické buněčné fagocytózy, odstraňování apoptotických trosek a omezení prozánětlivé odpovědi [25]. NGAL je malý sideroforový protein, který se váže na želatinázy odvozené z lidských neutrofilů. NGAL je zřídka exprimován v normálních ledvinách, ale akutní, ischemická nebo toxická poškození ledvin vedou k sekreci NGAL epiteliálními buňkami v proximálních/distálních tubulech, což zvyšuje koncentrace NGAL v moči a krvi; NGAL tedy může být použit jako nový časný biomarker pro I/R-indukované akutní selhání ledvin [26]. Předléčené skupiny vykazovaly sníženou sekreci KIM-1 a NGAL a skupina předléčenou vysokou dávkou vykázala signifikantní snížení sekrece NGAL ve srovnání s neléčenou skupinou. Pozorované snížení tubulárního poškození a sekrece proteinů KIM{10}} a NGAL naznačovalo, že předběžné ošetření čočkou beluga vykazovalo ochranné účinky proti poškození tubulárních epiteliálních buněk indukovaném I/R.

Když je I/R poranění těžké, poškozené buňky jsou vyčištěny apoptotickou cestou, což je patofyziologický mechanismus buněčné smrti [27]. Poškození DNA specifické pro apoptózu lze detekovat pomocí testu TUNEL.

Buňky pozitivní na TUNEL byly často pozorovány v neošetřené skupině, zatímco skupiny s čočkou beluga předem ošetřené vykazovaly významně snížený počet buněk pozitivních na TUNEL v závislosti na dávce. Tento histologický důkaz apoptózy byl potvrzen zkoumáním exprese Fas a kaspázy 3. Fas je ligand, který se váže na receptor buněčné smrti a je zpočátku pozorován během programované buněčné smrti [28]. Kaspáza 3 je intracelulární prováděcí enzym dráhy apoptotické buněčné smrti, jehož výsledkem je tvorba apoptotického těla [29]. Syntézy proteinů Fas a kaspázy 3 byly významně sníženy v předléčené skupině ve srovnání s neléčenou skupinou, což potvrzuje, že předléčení čočkou beluga může inhibovat apoptotickou signální transdukci po poranění I/R.

I/R poranění také indukuje ztrátu renálních mikrocév [30], což má za následek patohistologické změny v endoteliálních buňkách [20]. Poškození renálních mikrocév bylo detekováno pomocí protilátky proti CD31, markeru endoteliálních buněk [30]. Exprese CD31 nebyla v neléčené skupině detekována, což ukazuje na ztrátu renálních mikrocév. Avšak skupina předléčená vysokou dávkou vykazovala pozitivní expresi CD31 s podobnou vaskulární hustotou, jaká byla pozorována u normální skupiny, což naznačuje, že předléčení čočkou beluga ve vysokých dávkách mělo ochranný účinek na zachování endoteliálních buněk. Poškozené endoteliální buňky exprimují adhezní molekuly endotelu a leukocytů, jako je ICAM-1 [31]. Zvýšené adhezní molekuly mohou vést k aktivaci leukocytů, obstrukci kapilár, produkci cytokinů a prozánětlivým odpovědím [32]. Neošetřená skupina vykazovala pozitivní expresi ICAM-1, což ukazuje na zvýšenou expresi adhezních molekul indukovanou poškozením endoteliálních buněk. Skupina předléčená vysokou dávkou však vykazovala negativní expresi ICAM-1, což ukazuje na ochranné účinky předléčení beluga čočkou na udržení endoteliálních buněk, jak funkčně, tak fyziologicky. Udržované vaskulární struktury mohou poskytovat konzistentní průtok krve, dodávat kyslík a živiny tkáním a buňkám poškozeným I/R a napomáhat tak funkční a histologické obnově ledvin.

Reperfuze obnovuje dodávku kyslíku do poškozených buněk, což může vyvolat expresi enzymů souvisejících s oxidačním stresem, které přeměňují kyslík na ROS [33]. ROS jsou nestabilní a vysoce reaktivní produkty, které generují volné radikály, které způsobují poškození DNA, apoptózu a nekrózu prostřednictvím změny buněčných proteinů, lipidů a nukleových kyselin. Volné radikály poškozují nenasycené mastné kyseliny v buněčné membráně, což má za následek peroxidaci lipidů [34]. Peroxid lipidů je pak degradován na MDA, což snižuje aktivity antioxidačních enzymů, jako jsou SOD, GPx, GSH a CAT [35]. SOD katalyzuje dismutaci superoxidu na kyslík a peroxid vodíku, který je dále degradován CAT. GPx je klíčový antioxidační enzym, který eliminuje peroxid pomocí GSH. GSH může detoxikovat různé oxidační produkty v kombinaci s GPx. Hladiny MDA a antioxidačních enzymů prokázaly v analýze ELISA inverzní vztah. V předem ošetřených skupinách byla exprese MDA relativně nízká, ale antioxidační enzymy byly vysoce exprimovány ve srovnání s jejich příslušnými hladinami v neošetřené skupině.

Tyto výsledky ukázaly, že předběžné ošetření čočkou beluga může snížit I/R-indukované poškození ledvin blokováním dráhy oxidačního stresu prostřednictvím inhibice peroxidace membránových lipidů a aktivace antioxidačních enzymů.

Reperfuze také spouští aktivaci vaskulárních endoteliálních buněk, což vede k expresi ICAM-1 na buněčném povrchu. Exprimovaný ICAM-1 se spojuje s neutrofily prostřednictvím antigenu spojeného s funkcí lymfocytů-1 (LFA{4}}), což má za následek připojení neutrofilů k endoteliálním buňkám, infiltraci neutrofilů a sekreci zánětlivých cytokiny neutrofily [36]. Poté, co se neutrofily objeví v poškozené oblasti, dojde k infiltraci F4/80 plus makrofágů. Makrofágy se v závislosti na čase a okolním prostředí rozlišují na prozánětlivé fenotypy M1 a protizánětlivé M2. Makrofágy M1 vylučují prozánětlivé cytokiny (IL-1, TNF- a IL- 6), které jsou spojeny s poškozením ledvin indukovaným I/R, zatímco makrofágy M2 vylučují protizánětlivé cytokiny (TGF-, IL{ {19}} a IL-22) [37, 38]. Makrofágy také stimulují aktivaci CD4 plus T buněk. Aktivované T buňky syntetizují interferon- (IFN-), který zesiluje imunitní odpověď prostřednictvím aktivace makrofágů M1 [39]. V této studii skupiny předléčené čočkou beluga vykazovaly inhibiční účinky proti infiltraci F4/80 plus makrofágů a CD4 plus T buněk do oblasti kůry ledvin, což mělo za následek sníženou expresi IL-1, IL-6, a TNF- mRNA a zvýšenou expresi TGF-, IL-10 a IL-22 mRNA. Tyto výsledky ukázaly, že předběžné ošetření čočkou beluga může snížit zánětlivou odpověď inhibicí infiltrace imunitních buněk a snížením exprese zánětlivých cytokinů.

5. Závěry

Stručně řečeno, skupiny předléčených čočkou beluga vykazovaly snížené poškození proximálního tubulu, sníženou sekreci molekul souvisejících s poškozením, snížené TUNEL-pozitivní buňky, sníženou sekreci molekul související s apoptózou, pozitivní expresi mikrocév, expresi negativních adhezních markerů, antioxidační účinek a inhibované zánětlivé procesy. odpovědi. Předběžné ošetření čočkou beluga proto vykazovalo ochranné účinky proti poškození ledvin vyvolanému I/R prostřednictvím antiapoptotických, protizánětlivých a antioxidačních aktivit. Na základě výsledků této studie může být funkce ledvin zachována použitím léčby čočkou beluga v klinických situacích spojených s poraněním I/R, jako je parciální nefrektomie.

doplňky flavonoidů v ledvinách

Dostupnost dat

Data jsou k dispozici na vyžádání.

Zveřejnění

Abstrakt rukopisu byl oznámen na 72. výročním zasedání Korejské urologické asociace.

Střet zájmů

Nejsou zde žádné střety zájmů.

Příspěvky autorů

Syng-ook Lee a So Young Chun přispěli k této práci stejnou měrou.

Poděkování

Tato práce byla podpořena grantem Biomedical Research Institute od Kyungpook National University Hospital (2019).

1Department of Food Science and Technology, Keimyung University, Daegu 42601, Korejská republika

2BioMedical Research Institute, Kyungpook National University Hospital, Daegu 41940, Korejská republika

3Podpůrný tým pro výzkum laboratorních zvířat, Univerzitní nemocnice Yeungnam, Daegu 42415, Korejská republika

4Department of Internal Medicine, Yeungnam University College of Medicine, Daegu 42415, Korejská republika

5Urologická katedra, Lékařská fakulta, Národní univerzita Kyungpook, Daegu 41566, Korejská republika

6Department of Patology, School of Medicine, Kyungpook National University, Daegu 41566, Korejská republika

7Urologická klinika, Yeungnam University College of Medicine, Daegu 42415, Korejská republika

Reference

[1] SY Chun, DH Kim, JS Kim, et al., "Nová metoda dorzální štěrbiny přiblížená neischemické parciální nefrektomii pro regeneraci tkáně ledvin na myším modelu," Tkáňové inženýrství a regenerativní medicína, sv. 15, č. 4, s. 453–466,2018.

[2] M. Agrawal a R. Swartz, "Akutní selhání ledvin," American Family Physician, sv. 61, č.p. 7, s. 2077–2088, 2000.

[3] KR Tuttle, "Ischemic nephropathy," Current Opinion in Nephrology and Hypertension, sv. 10, č. 2, s. 167–173,2001.

[4] K. Singbartl a K. Ley, "Ochrana před závažným akutním renálním selháním vyvolaným ischemií-reperfuzí blokováním E-selektinu," Critical Care Medicine, sv. 28, č. 7, s. 2507–2514, 2000.

[5] M. Takada, KC Nadeau, GD Shaw, KA Marquette a NL Tilney, "Kaskáda adhezivních molekul cytokinů při ischemickém/reperfuzním poškození ledviny potkana. Inhibice rozpustným ligandem P-selektinu," The Journal of klinické vyšetření, sv. 99, č. 11, s. 2682–2890, 1997.

[6] J. Niu, J. Wu, X. Li a F. Zhang, "Asociace mezi endotelinem-1/endotelinovým receptorem A a zánětem myších ledvin po akutní ischemii/reperfuzi," Molecular Medicine Reports, sv. . 11, č. 5, s. 3981–3987, 2015.

[7] L. Wang, X. Liu, H. Chen a kol., "Účinek peroxidu II na apoptózu indukovanou renálním ischemickým/reperfuzním poškozením u krys," Experimental and Therapeutic Medicine, sv. 9, č. 3, s. 817–822, 2015.

[8] B. Dong, H. Zhou, C. Han a kol., "Ischemií/reperfuzí indukovaná exprese chop podporuje apoptózu a zhoršuje obnovu renálních funkcí: role acidózy a Gpr4," PLoS One, sv. 9, č. 10, článek e110944, 2014.

[9] DL Cruthirds, L. Novak, KM Akhi, PW Sanders, JA Thompson a LA MacMillan-Crow, "Mitochondriální cíle oxidačního stresu během renální ischemie/reperfuze," Archives of biochemistry and biophysics, sv. 412, č.p. 1, s. 27–33, 2003.

[10] B. Yang, S. Jain, IZ Pawluczyk a kol., "Zánět a aktivace kaspázy při dlouhodobém renálním ischemickém/reperfuzním poškození a imunosupresi u krys," Kidney International, sv. 68, č.p. 5, s. 2050–2067, 2005.

[11] HH Wu, TY Hsiao, CT Chien a MK Lai, „Ischemické kondicionování krátkými obdobími reperfuze zmírňuje renální ischemii/reperfuzí indukovanou apoptózu a autofagii u krys,“ Journal of biomedical science, sv. 16, č. 1, 2009.

[12] EM El Morsy, MA Ahmed a AA Ahmed, "Atenuace renálního ischemického/reperfuzního poškození předkondicionováním extraktu açai v ​​krysím modelu," Life sciences, sv. 123, s. 35–42, 2015.

[13] H. Ilhan, M. Eroglu, V. Inal a kol., "Hyperbarická oxygenoterapie zmírňuje oxidační stres a poškození tkáně při renálním ischemickém/reperfuzním poškození u potkanů," Renal Failure, sv. 34, č. 10, s. 1305–1308, 2012.

[14] H. Chen, B. Xing, X. Liu a kol., "Ozonová oxidační preconditioning inhibuje zánět a apoptózu u potkaního modelu renálního ischemického/reperfuzního poškození," European Journal of pharmacology, sv. 581, č.p. 3, s. 306–314, 2008.

[15] BJ Xu, SH Yuan a SK Chang, "Srovnávací analýzy fenolického složení, antioxidační kapacity a barvy luštěnin chladných sezón a dalších vybraných potravinářských luštěnin," Journal of Food Science, sv. 72, č.p. 2, s. S167–S177, 2007.

[16] SO Lee a SH Lee, "Obsah polyfenolů a antioxidační aktivity extraktů čočky z různých kultivarů," Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, sv. 45, č. 7, s. 973–979, 2016.

[17] SO Lee a SH Lee, „Nrf2-zprostředkovaný protizánětlivý účinek metanolového extraktu z čočky beluga v buňkách RAW264.7 ošetřených LPS“, v roce 2018 KFN International Symposium and Annual Meeting, str. {{ 7}}, Pusan, Korea, 2018.

[18] EE Hesketh, A. Czopek, M. Clay a kol., "Ischemicko-reperfuzní poškození ledvin: myší model poranění a regenerace," JoVE (Journal of Visualized Experiments), no. 88, str. 8, 2014.

[19] Q. Wei a Z. Dong, "Myší model ischemického akutního poškození ledvin: technické poznámky a triky," American Journal of Physiology-Renal Physiology, sv. 303, č.p. 11, s. F1487– F1494, 2012.

[20] JV Bonventre a L. Yang, "Buněčná patofyziologie ischemického akutního poškození ledvin," The Journal of Clinical Investigation, sv. 121, č.p. 11, s. 4210–4221, 2011.