Rychlá indukce ochranné imunity proti pneumonickému moru polymerními F1 a LcrV antigeny Yersinia Pestis

Abstraktní:

V nedávné studii jsme prokázali, že vakcinace polymerním antigenem kapsle F1 patogenu moru Yersinia pestis vedla k rychlému vyvolání ochranné humorální imunitní odpovědi prostřednictvím klíčové aktivace vrozených buněk B1b. Naopak, monomerní verze F1 nedokázala rychle ochránit očkovaná zvířata v tomto modelu dýmějového moru. V této studii jsme zkoumali schopnost F1 udělit rychlý nástup ochranné imunity u náročnějšího myšího modelu plicního moru. Očkování jednou dávkou F1 adsorbovanou na hydroxid hlinitý vyvolalo účinnou ochranu proti následné letální intranazální expozici plně virulentnímu kmenu Y. pestis během týdne. Je zajímavé, že přidání antigenu LcrV zkrátilo dobu potřebnou k dosažení takto rychlé ochranné imunity na 4–5 dní po vakcinaci. Jak bylo zjištěno dříve, polymerní struktura F1 byla zásadní pro poskytnutí zrychlené ochranné reakce pozorované vakcinací LcrV. Konečně ve studii dlouhověkosti vyvolala jediná vakcinace polymerní F1 vyšší a jednotnější humorální odpověď než podobná vakcinace monomerní F1. V tomto prostředí však byl znovu zdůrazněn dominantní příspěvek LcrV k dlouhodobé imunitě proti letální plicní expozici.

Mezi ochrannými humorálními imunitními reakcemi a imunitou existuje úzký vztah. Ochranná humorální imunitní odpověď je obranná reakce organismu proti cizím patogenům, na které se podílejí především protilátky. Imunita označuje schopnost těla odolávat invazi cizích patogenů. Ochranná humorální imunitní odpověď může podpořit zabíjející účinek imunitních buněk, zvýšit odolnost organismu a tím zlepšit imunitu. Kromě toho může ochranná humorální imunitní odpověď také regulovat rovnováhu imunitního systému, kontrolovat aktivitu imunitního systému a vyhnout se nadměrné reakci a výskytu autoimunitních onemocnění. Proto je ochranná humorální imunitní odpověď nezbytná pro udržení tělesného zdraví a posílení imunity. Kromě toho je velmi důležitá i lidská imunita, která nás může bránit napadení viry. Cistanche může posílit imunitu. Cistanche je bohatá na různé antioxidační látky, jako je vitamín C, vitamín C, karotenoidy atd. Tyto složky dokážou vychytávat volné radikály, snižovat oxidační stres a zlepšovat odolnost imunitního systému.

Click cistanche tubulosa výhody

Klíčová slova:

očkování; plicní mor; rychlá ochrana; polymerní Fl; monomerní Fl; LcrV; model myši.

1. Úvod

Gramnegativní bakterie Yersinia pestis tvoří etiologické agens dýmějového a plicního moru. Stovky milionů podlehly kvůli smrtelné povaze infekcí způsobených tímto ničivým patogenem ve třech velkých pandemiích a v četných lokálních ohniscích zaznamenaných v posledních dvou tisíciletích [1,2]. Vzhledem ke své vysoké infekčnosti a letalitě je Y. pestis klasifikován jako potenciální bioteroristický agens (https://www.cdc.gov/plague/bioterrorism/index.html, přístupný dne 9. července 2021). Od objevu a rozsáhlého používání antibiotik se prevalence a mortalita způsobené morem prudce snížily [3,4].

Nicméně antibiotická terapie proti moru má omezení; aby byla účinná, musí být léčba podána krátce po nástupu příznaků, které jsou zpočátku podobné příznakům běžné infekce horních cest dýchacích, a proto jsou často špatně diagnostikovány. Jakékoli zpoždění v podávání antibiotik specifických pro terapii moru může zhoršit jejich účinnost a vést k významné mortalitě mezi léčenými jedinci [5]. Nedávná izolace virulentních kmenů Y. pestis rezistentních vůči více antibiotikům, včetně těch, která jsou doporučena pro terapii, a obava, že takto změněné fenotypy mohou být zlomyslně zavedeny do virulentních kmenů pro biologickou válku nebo bioterorismus, vyžaduje vývoj dalších protiopatření [6–8]. . Nedávná aplikace antibiotik druhé linie, další terapeutické modality a kombinace antibiotické a fágové terapie skutečně ukazují slibné výsledky na myším modelu plicního moru [9,10].

Nedávno jsme na myším modelu dýmějového moru prokázali, že podání F1 kapsulárního antigenu Y. pestis vyvolává protektivní imunitu během několika dnů, a proto může sloužit jako terapeutická intervence k prevenci onemocnění [11,12]. Tento rychlý nástup ochrany zahrnoval rychlou aktivaci vrozených buněk B1b, které sídlí v peritoneální a pleurální dutině, což vede k produkci oběhových anti-F1 IgM a IgG protilátek [11,12]. Polymerní struktura F1 byla nezbytná pro rychlé navození imunity proti moru, jak bylo prokázáno pozorováním, že na rozdíl od polymerní F1 se uměle vytvořený monomerní kruhově permutovaný F1 protein (monoF1) nedokázal asociovat s peritoneálními B1b buňkami bezprostředně po imunizaci a v souladu s tím byla produkce protilátek anti-F1 opožděna [12]. V této studii jsme na myším modelu intranazální infekce Y. pestis zkoumali schopnost F1 antigenu poskytnout rychlou ochrannou imunitu proti plicnímu moru, který představuje nejzávažnější projev onemocnění.

Tato studie prokázala, že stejně jako v případě imunity proti bubonickému moru byla polymerní povaha F1 nezbytná pro rychlou a také dlouhotrvající imunitu po vakcinaci jedinou dávkou antigenu. Protože antigeny F1 a LcrV představovaly nejpravděpodobnější kandidátní podjednotkové vakcíny proti moru a bylo prokázáno, že vyvolávají rychlou ochrannou imunitu u myšího modelu plicního moru [13], rozšířili jsme tuto studii o možnost dalšího urychlení nasazování ochrany proti plicní mor kombinovanou F1 s formulací LcrV.

2. Materiály a metody

2.1. Etické prohlášení

Tato studie byla provedena v přísném souladu s doporučeními pro péči a používání laboratorních zvířat Státního zdravotního ústavu. Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny podle izraelských zákonů a byly schváleny Etickou komisí pro pokusy na zvířatech při Izraelském institutu pro biologický výzkum (Čísla povolení: IACUC-IIBR M-50-18, IACUC-IIBR M-36-19, IACUC -IIBR M-64-19, IACUC-IIBR M-73-20). Po intranazální expozici byly myši denně monitorovány. V našich studiích přežití byly použity humánní koncové body. Myši vykazující ztrátu vzpřimovacího reflexu byly usmrceny cervikální dislokací.

2.2. Zvířata

Šest až osm týdnů staré inbrední samice myší C67BL/6 byly zakoupeny od Envigo (Jeruzalém, Izrael). Mužská a ženská CD-1s podobného stáří byla zakoupena od Charles River (UK).

2.3. Imunizace zvířat purifikovanými antigeny

PolyF1: Polymerní F1 protein byl purifikován ze supernatantu kultury buněk E. coli exprimujících cafl operon kmene Y. pestis Kimberley53, jak bylo dříve popsáno v [14]. Molekulová hmotnost purifikovaného Fl byla stanovena jako vyšší než 1000 kDa vylučovací chromatografií s použitím kolony Superdex 200 (Cytiva, MA, USA).

MonoF1: ​​Plazmid pAH34L kódující monomerní F1 (cpCaf1) byl laskavě získán od Dr. Daniel Peters a Prof. Jeremy H. Lakey, Newcastle University, UK [15]. pAH34L byl zaveden do Lemo21 (DE3) E. coli zakoupené od New England Biolabs (Ipswich, MA, USA). Náhodně vybrané transformanty byly pěstovány při 37 °C a 220 otáčkách za minutu v bujónu Terrific doplněném ampicilinem (200 ug/ml). Exprese byla indukována ve střední logaritmě přidáním isopropyl-thiogalaktopyranosidu (IPTG; 1 mM) a kultury byly následně inkubovány při 18 °C a 220 otáčkách za minutu dalších 19 hodin. Bakteriální pelety byly zváženy (vlhká hmotnost) a solubilizovány lyzačním činidlem pro B buňky CelLytic™ podle pokynů výrobce (Merck-Sigma, Rehovot, Izrael).

Rekombinantní fúzní protein Tol3–cpCaf1 byl purifikován pomocí zjednodušené tlakové kapalinové chromatografie (PFLC) na koloně HisTrap™ HP podle pokynů výrobce (Cytiva, MA, USA). Část Tol3 byla oddělena od cpCaf1 štěpením trombinem (Merck-Sigma, Rehovot, Izrael) a reabsorpcí první části na regenerované koloně HisTrap™ HP. Část cpCaf1 (monoF1) byla odebrána z průtokové frakce a extenzivně dialyzována proti 1 x PBS. Endotoxiny byly odstraněny metodou separace fází Triton X-114, jak bylo popsáno dříve v [16]. Množství proteinu bylo měřeno pomocí metody bicinchoninové kyseliny (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo). Čistota monomerního F1 byla ověřena pomocí SDS-PAGE následovaného barvením Coomassie modří a analýzou Western blot s použitím králičích anti-F1 protilátek, jak bylo dříve popsáno v [11].

LcrV: LcrV kódující sekvence plné délky z virulentního kmene Y. pestis Kimberley53 byla klonována do expresního vektoru pGEX (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) a zavedena do buněk E. coli. Bylo zjištěno, že kódující sekvence LcrV je identická s LcrV kmene Y. pestis CO92. Rekombinantní LcrV byl produkován a purifikován, jak je popsáno v Leary et al. [17]. Endotoxiny byly odstraněny z purifikovaného LcrV, jak je popsáno výše.

Celkem 20 až 160 ug polyF1 a LcrV nebo 80 ug monoF1 bylo adsorbováno na 2% gel hydroxidu hlinitého (AlOH) (Brennentag Biosector, Dánsko) na konečnou koncentraci 0,36 procenta. Jednotlivé myši byly imunizovány subkutánně za použití konstantního objemu 200 ul podávaného do dolní části zad.

2.4. Charakterizace sérologické odpovědi

Myším byla odebrána krev z ocasu a jednotlivé IgG titry generované proti F1 a LcrV v séru byly stanoveny pomocí ELISA, jak bylo dříve uvedeno v [11]. IgG1 a IgG3 titry byly měřeny s použitím izotypově specifických kozích anti-myších protilátek konjugovaných s alkalickou fosfatázou (Jackson Laboratories, Farmington, CT, USA).

Bronchoalveolární laváž (BAL): Myši byly anestetizovány roztokem ketaminu/xylazinu a byla obnažena průdušnice, přičemž byla věnována zvláštní pozornost, aby nezpůsobila žádné krvácení. Byla provedena malá incize a byla vložena {{0}}}kanula s průměrem (BD Neoflon™) a zajištěna chirurgickým stehem. Plíce byly promyty 1 x PBS pomocí 1 ml injekční stříkačky luer-lock, která byla připojena k zajištěné kanyle. Výplachová tekutina, která byla kontaminována jakýmikoli známkami krve, byla zlikvidována. Výplachová tekutina byla vyčištěna centrifugací (40}0x g, 4 °C) a supernatant byl před testem ELISA sterilně zfiltrován. Koncentrace protilátek anti-F1 a anti-LcrV v tekutině BAL (BALF) očkovaných zvířat byly stanoveny pomocí zředěných Mab 57 (F1) a Mab 59 (LcrV), které byly dříve uvedeny v [18] jako standardní křivky zahrnuté v každé {{14} }jamková testovací destička. Limity detekce (LOD) pro protilátky anti-F1 IgG a anti-LcrV v BALF byly stanoveny na 0,8 ng/ml a 0,15 ng/ml.

2.5. Infekce myší

Intranazální (in) infekce byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve v [19]. Stručně řečeno, smyčka plná typických bakteriálních kolonií Y. pestis Kim53 byla sklizena a zředěna v bujónu pro srdeční infuzi (HIB, Difco) doplněném 0,2 procenta xylózy a 2,5 mM CaCl2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) na OD660 0.01 a pěstuje se 22 hodin při 28 ◦C a 100 ot./min. Na konci inkubační doby (OD660 ≈ 4) byla kultura promyta a zředěna ve fyziologickém roztoku (0,9 procenta NaCl) na požadovanou infekční dávku, která byla ověřena počítáním jednotek tvořících kolonie po nanesení a inkubaci na BHIA miskách (48 hodin při 28 ◦C). Myši byly anestetizovány směsí 0,5 procenta ketamin HCI a 0,1 procenta xylazinu a poté byly intranazálně infikovány 35 ul/myš bakteriální suspenze. Intranazální LD50 kmene Kim53 u myší C57BL/6 je 1100 cfu a 2100 cfu u myší CD-1. Hodnoty LD50 byly vypočteny podle metody popsané Reedem a Muenchem [20]. Morbidita a mortalita myší byly sledovány denně po dobu 21 dnů. Na konci tohoto období byla clearance patogenu ověřena nanesením slezinných homogenátů z přeživších zvířat na BHIA plotny doplněné 200 ug/ml streptomycinu (48 h při 28 °C).

2.6. Charakterizace myšího modelu pneumonického moru

Intranazálně infikované myši byly anestetizovány v uvedeném časovém bodě po expozici roztokem ketaminu/xylazinu a heparinizovaná krev byla odebrána srdeční punkcí. Následně byly vyříznuty mediastinální lymfatické uzliny (mdLN), plíce a slezina a rozdrceny na jednobuněčnou suspenzi na 70 µm nylonové síťce (buněčné sítko, Falcon, Corning, NY, USA) v 1× PBS . Počet Y. pestis Kim53 v různých orgánech a krvi byl stanoven nanesením sériově zředěných buněčných suspenzí na destičky BHIA doplněné 200 ug/ml streptomycinu. Pro histologickou analýzu byly myši anestetizovány a jejich průdušnice byly kanylovány, jak je uvedeno výše. Ke kanyle byla připojena kolona (0,7 × 30 cm, KONTES, St. Louis, MO, USA) naplněná pufrovaným roztokem formaldehydu (10procentní konečná konc.) a plíce byly „nafukovány“ pouze gravitací. Plíce naplněné fixativem byly udržovány ve stejném pufru po dobu 14 dnů a poté zpracovány za vzniku bloků zalitých v parafinu. Řezy o délce jednoho až tří mikrometrů byly obarveny standardním barvením eosin/hematoxylin (H&E) a barvicí soupravou Masson-Goldner (Merck, Rehovot, Izrael) pro detekci fibrózy. Kromě toho byly řezy plic obarveny na Y. pestis pomocí vlastních králičích anti-F1 IgG protilátek (1:10,000) a soupravy Histostain®-SP (ZYMED®, Invitrogen, Waltham, MA, USA ). Obarvené řezy byly zobrazeny pomocí kamery ICC3 spojené s mikroskopem Axioscope A1 (Zeiss, Německo).

2.7. Statistická analýza

Významnost mezi titry zaznamenanými u myší patřících do více než dvou skupin byla stanovena neparametrickým Kruskal-Wallisem s Dunnovým post hoc testem. Pro srovnání mezi křivkami přežití získanými v různých vakcinačních skupinách byl použit log-rank test (Mantel-Cox). Rozdíly byly považovány za významné, pokud p menší nebo rovno 0,05. Výpočty byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism.

3. Výsledky

V předchozí studii jsme prokázali, že vakcinace myší nativní polymerní formou F1 kapsulárního antigenu Yersinia pestis vedla k rychlému vyvolání ochrany proti dýmějovému moru. V souladu s tím bylo navrženo, že podávání F1 by mohlo být zvažováno nejen jako profylaktické opatření, ale také jako terapeutický zásah v naléhavých případech, jako jsou ohniska zahrnující přirozeně se vyskytující nebo úmyslně upravené kmeny rezistentní na antibiotika [12]. V této zprávě bylo vyvolání rychlé ochrany zkoumáno v případě plicního moru za použití dobře zavedeného myšího modelu sestávajícího z expozice myší patogenu intranazální inokulací. Ukázalo se, že tento model zachovává patogenitu charakterizující respirační projevy primárního pneumonického moru (doplňkový obrázek S1) [10,19,21–24].

3.1. Rychlá ochranná imunita poskytovaná F1 a LcrV v myším modelu pneumonického moru

Schopnost antigenu F1 vyvolat rychlou ochranu byla testována experimenty, ve kterých byly myši C57BL/6 očkovány jednorázovým podáním polyF1 adsorbovaného na AlOH (20, 80 a 160 ug/myš), zatímco kontrolním zvířatům byla injikována pouze adjuvans. Schopnost očkovaných myší přežít letální intranazální infekci virulentním kmenem Y. pestis Kim53 (10LD50=11,000 cfu) byla hodnocena tři a sedm dní po vakcinaci ve srovnání s kontrolními zvířaty (obrázek 1 ). Po třech dnech bylo pozorováno pouze mírné prodloužení doby do smrti a přežití (neuspokojivé statistické významnosti) (obrázek 1A). Prodloužení doby mezi vakcinací a expozicí pouze o 4 další dny (celkem 7 dní) umožnilo záchranu všech myší očkovaných vysokými dávkami polyF1 (80 a 160 µg/myš), jakož i 87 procent myší očkovaných nízkou dávkou polyF1 (obrázek 1B).

Schopnost antigenu F1 vyvolat rychlou ochrannou imunitní odpověď proti pneumonickému moru nás povzbudila k tomu, abychom prozkoumali, zda by imunizace dalším ochranným antigenem, LcrV, dále zlepšila imunitní stav zvířat urychlením nástupu ochranné imunity. Když byla letální expozice Y. pestis provedena 3 dny po kombinované vakcinaci, podání směsi LcrV a polyF1 (80 µg nebo 160 µg každého z antigenů) dokázalo zachránit 30–50 procent myši (obrázek 1C). Nejpozoruhodnější je, že prodloužení období mezi vakcinací a expozicí na sedm dní poskytlo plnou ochranu všem očkovaným zvířatům při všech dávkách antigenů (obrázek 1D). Schopnost polyF1 samotného nebo v kombinaci s LcrV poskytnout rychlou ochrannou imunitu proti pneumonickému moru během týdne nebyla ovlivněna desetinásobným zvýšením provokační dávky intranazální expozice (obrázek 1E), což potvrzuje robustnost chráněného stavu.

3.2. Kinetika humorální odpovědi po vakcinaci F1 a LcrV

Pozorování, že kombinovaná vakcína LcrV a F1 vyvolala rychlou ochrannou imunitu, naznačovala, že krátce poté byla vyvolána humorální odpověď. Za účelem řešení této možnosti a stanovení příspěvku humorální odpovědi proti každému z antigenů k ochraně proti Y. pestis byla 5–9 dní po vakcinaci jednorázovou dávkou analyzována kinetika specifických IgG protilátek vytvořených proti dvěma jednotlivým antigenům. C57BL/6 myší se smíšenou formulací polyF1 a LcrV (obrázek 2A). Jak se očekávalo, na základě předchozích pozorování byly titry protilátek anti-F1 IgG (GMT=1,35 x 103) již detekovatelné v séru všech očkovaných zvířat v den 5 po vakcinaci (obrázek 2B).

V následujících dnech bylo pozorováno postupné zvyšování titrů protilátek anti-F1 IgG, které dosahovaly ~60-násobně vyšších hladin v den 9 po vakcinaci (GMT=8,26 × 104, obrázek 2B). Anti-F1 IgG protilátky mohly být také detekovány v plicní tekutině počínaje 7. dnem po vakcinaci a dosahovaly koncentrace až -1 ug/ml v den 9 (obrázek 2C). Zajímavé je, že zatímco humorální odpověď anti-LcrV se zpožďovala ve srovnání s reakcí vyvolanou polyF1 (7. den GMT=613, obrázek 2D), v následujících dnech byl naměřen vyšší nárůst hladin protilátek anti-LcrV IgG, který vykazoval celkový nárůst ~160-násobek (GMT=1 × 105, obrázek 2D). Anti-LcrV IgG protilátky mohly být také detekovány v plicní tekutině očkovaných myší počínaje dnem 8, i když v nižší koncentraci ve srovnání s hladinami anti-F1 (obrázek 2E).

Prudký nárůst titrů anti-LcrV IgG pozorovaný 8.–9. den po vakcinaci se nezdálo, že by zahrnoval aktivaci vrozených buněk B1b, jak naznačuje pozorování, že frakce IgG3 těchto protilátek byla pod úrovní detekce ve srovnání s frakce protilátky anti-F1 IgG3 ([12] a doplňkový obrázek S2). Data tedy naznačují, že LcrV by také mohl generovat rychlou humorální odpověď poskytující v kombinaci s F1 účinnou ochranu proti pneumonickému moru již jeden týden po vakcinaci. Kromě toho pozorování, že protilátky anti-F1 a anti-LcrV IgG se akumulovaly v plicích očkovaných zvířat, naznačuje, že lokální reakce v plicích může být důležitá pro dosažení imunity proti pneumonickému moru.

3.3. Význam polymerní struktury F1 pro rychlý nástup ochranné imunity

Již dříve jsme publikovali poznatky silně podporující názor, že kvartérní polymerní architektura F1 je nezbytná pro její schopnost vyvolat rychlou ochrannou reakci proti bubonickému moru [12]. Následně byla v této studii řešena i tato problematika v případě ochrany před plicním morem. Myši byly vakcinovány monomerní nebo polymerní F1, v obou případech to znamenalo společné podávání LcrV (80 ug každého antigenu/myš). O tři, čtyři a pět dní později byly myši intranazálně stimulovány letální dávkou Y. pestis Kim53. Údaje o přežití znázorněné na obrázku 3 ukazují, že vakcinace směsí polyF1 a LcrV chránila 25 procent, 62,5 procent a 87,5 procent myší, v daném pořadí (obrázek 3A), před letální expozicí.

Na rozdíl od toho všechny myši očkované směsí monoF1 a LcrV infekci podlehly kromě skupiny očkované 5 dní před expozicí, která vykazovala nízkou úroveň 25% ochrany (obrázek 3B). Vakcinace nesmíšenými formulacemi obsahujícími buď polyF1, monoF1 nebo LcrV (80 ug/myš) 4 dny před expozicí zvířata nechrání. Vakcinace polyF1 však poskytla významné zpoždění v úmrtnosti ve srovnání se všemi ostatními experimentálními skupinami (p < 0,001; obrázek 3C). Celkově tyto výsledky jasně ukazují, že polymerní forma F1 je nezbytná pro získání rychlé ochranné reakce v kombinaci s LcrV.

3.4. Charakterizace dlouhodobé ochranné imunity navozené jednorázovou vakcinací F1 a LcrV

Nakonec jsme zkoumali, zda se klasická dlouhodobá ochranná imunita proti plicnímu moru liší u myší očkovaných monoF1 nebo polyF1. V souladu s tím byly myši CD1 očkovány jednou monoF1 nebo polyF1 samotným, stejně jako podáváním formulací, které zahrnovaly kombinaci s LcrV. Hladina specifických protilátek v séru očkovaných zvířat byla měřena o šest měsíců později. Data znázorněná na obrázku 4A ukazují, že titry anti-F1 IgG byly vyšší ve všech skupinách očkovaných polyF1 než ve skupinách očkovaných monoF1. Vysoké a konzistentní titry anti-LcrV IgG byly naměřeny u všech myší očkovaných LcrV.

Období 6 měsíců po imunizaci (3 dny po odběru krve pro stanovení titru) byly myši stimulovány intranazálně letální dávkou sestávající z 100 LD50 Y. pestis Kim53 a přežití bylo monitorováno po dobu 21 dnů (obrázek 5). Myši očkované polyF1 jako jediným antigenem byly chráněny pouze částečně, zatímco všechny myši, které byly očkované monoF1, infekci podlehly, podobně jako kontrolní naivní myši (obrázek 5A). Je pozoruhodné, že titry anti-F1 IgG, které byly měřeny v séru zvířat očkovaných polyF1-, nevykazovaly silnou korelaci s přežitím proti plicní expozici (obrázek 5B). Přidání LcrV umožnilo plnou ochranu pro myši, které byly očkovány monoF1, stejně jako pro ty, které byly očkovány polyF1 (obrázek 5A), což ukazuje, že odpověď antiLcrV umožnila plnou manifestaci ochranné hodnoty odpovědi anti-F1. Podobné výsledky týkající se humorálních odpovědí a přežití po plicní expozici byly získány u očkovaných samců myší CD-1 (doplňkový obrázek S3), což naznačuje, že studie není ovlivněna pohlavím zvířat (všimněte si, že počáteční experimenty byly provedeny se samicemi) .

Celkově tyto výsledky ukazují, že F1 může sám o sobě vyvolat rychlý nástup ochrany proti plicnímu moru, který závisí na jeho přirozené polymerní struktuře. Přidání LcrV k polyF1 nejen zkrátilo čas potřebný k dosažení takové rychlé ochrany, ale také poskytlo prodlouženou a účinnou ochrannou imunitu proti plicní manifestaci moru, jak bylo popsáno dříve.

4. Diskuze

Nedávná izolace virulentních kmenů Y. pestis, které jsou rezistentní vůči několika antibiotikům včetně těch, která jsou doporučena pro terapii [8,25,26], je připisována hledání dalších protiopatření proti plicnímu moru, jako jsou vakcíny, které navozují rychlou imunitu, veřejné zdraví a klinický význam. Vakcíny jsou obecně považovány za preventivní protiopatření proti infekčním chorobám, a proto jsou zdravým lidem dodávány roky dopředu. V souladu s tím většina preklinických studií zkoumajících vývoj vakcíny proti moru zahrnovala prodloužené očkovací režimy před letální expozicí [13,27–29]. Již dříve jsme uvedli, že vakcinace přirozenou polymerní formou kapsulárního antigenu F1 spouští velmi rychlou a silnou imunitní odpověď závislou na B-buňkách, která chrání zvířata i několik hodin po letální subkutánní expozici Y. pestis [11,12].

V těchto studiích jsme ukázali, že jediná vakcinace F1 indukuje akumulaci anti-F1 protilátek (IgM a IgG) v séru během několika dnů prostřednictvím aktivace vrozených B1b buněk. Tato subpopulace B buněk sídlí v peritoneální dutině myší a obvykle generuje sérologické odpovědi proti neproteinovým polymerním antigenům, jako je LPS a polysacharidy, které tvoří pouzdro mnoha patogenů (pneumokoky, meningokoky atd.) [30]. Tyto rychlé imunitní reakce jsou charakterizovány nezávislostí na T buňkách a vytvořením sérotypu myší protilátky IgG3. Ukázali jsme, že všechny výše uvedené vlastnosti platí také pro rychlou ochrannou reakci generovanou F1. Dále jsme ukázali, že polymerní povaha F1 je nezbytná pro tuto rychlou imunitní odpověď, protože monomerní F1 (vytvořený kruhovou permutací genu caf1) nedokázal aktivovat buňky B1b, zaostával za polymerním F1 v kinetice titru IgG. negenerovaly sérotyp IgG3 a nedokázaly poskytnout rychlý nástup ochrany. Tato rychlá reakce je doprovázena konvenční pomalejší adaptivní reakcí závislou na T-buňkách proti F1. Proto předpokládáme, že polymerní F1 generuje dvě sérologické reakce působící paralelně: jedna je nezávislá na T-buňkách prostřednictvím B1b buněk a druhá zahrnuje folikulární B buňky způsobem závislým na T-buňkách [12].

V této zprávě byla předchozí studie rozšířena o schopnost antigenu F1 poskytnout rychlou ochrannou odpověď u náročnějšího myšího modelu plicního moru. Ukázali jsme, že jediné podání AlOH-adsorbovaného polymerního F1, sedm dní před letální intranazální stimulací virulentním kmenem Y. pestis, může vyvolat účinnou ochrannou reakci (obrázek 1). Toto překvapivé pozorování nemá téměř žádný precedens, nejen pokud jde o rychlost reakce, ale také ve smyslu skutečnosti, že schopnost antigenu F1 poskytovat ochranu u myšího modelu plicního moru byla řešena jen zřídka [31]. Zde uvedené pozorování je v souladu s pozorováním zdokumentovaným Derbise a jejími kolegy [32] ohledně detekce protilátek anti-F1 krátce po vakcinaci. Zde ukazujeme, že přidání LcrV k polyF1 bylo nejen výhodné z dlouhodobého hlediska, jak bylo uvedeno dříve [33,34], ale také urychlilo ochrannou imunitní odpověď proti intranazální expozici Y. pestis na pouhých několik dní (obrázky 2 a 5).

Schopnost vytvořit rychlou ochranu proti plicnímu moru vakcinací F1 a LcrV posiluje podobná zjištění dříve publikovaná Williamsonem a kolektivem [13], ve kterých vakcinace F1 a LcrV poskytla rychlou ochranu proti aerosolové expozici Y. pestis. Prudké zvýšení titrů anti-LcrV IgG pozorované ve dnech 8 a 9 ukazuje, že velmi silné imunitní mechanismy byly aktivovány LcrV brzy po imunizaci. Nedostatek anti-LcrV IgG3 protilátek v séru, jejich rozdílná kinetika a nižší hladiny anti-LcrV IgG protilátek nalezené v plicní tekutině silně naznačují, že diskrétní imunitní mechanismy byly aktivovány antigeny F1 a LcrV, z nichž oba jsou většinou pravděpodobně přispěl k rychlému vyvolání ochranné reakce (obrázek 3C).

Podobně jako u našich předchozích pozorování na myším modelu dýmějového moru, schopnost vyvolat rychlou ochrannou imunitní odpověď proti pneumonickému moru závisela na polymerní struktuře antigenu F1 (obrázek 3). Toto pozorování naznačuje, že se neočekává, že by převládající kandidátní vakcína proti morové podjednotce, která se skládá z monomerních F1 a LcrV jako fúzního proteinu [35,36], poskytla rychlý nástup imunity proti pneumonickému moru; tento předpoklad je však třeba experimentálně prozkoumat. Sérologická odpověď generovaná LcrV, přestože byla pomalejší než u polyF1 (obrázek 2), stále umožňovala rychlou ochrannou adaptivní reakci, která zabránila letálnímu účinku pneumonického moru. Tato relativně rychlá sérologická odpověď pravděpodobně pramenila ze schopnosti antigenu LcrV tvořit v roztoku dimery nebo tetramery, jak bylo zjištěno v předchozích studiích [37,38] a našich nepublikovaných datech. Ve světle našich zjištění o vlivu multimerní struktury F1 na urychlení generování humorální imunitní odpovědi může rekombinantní inženýrství proteinu LcrV, které umožňuje multimerizaci ve větší míře, dále urychlit reakci. V souladu s tímto předpokladem stojí za zmínku nedávná zpráva dokumentující, že mikrokrystaly obsahující F1 a LcrV byly více protektivní než podobná vakcína složená z těchto antigenů v rozpustné formě [39]. Toto pozorování naznačuje, že zvýšení hustoty antigenů, které se přirozeně vyskytují v F1 polymeru, může zlepšit a případně urychlit ochranné humorální reakce.

Kromě své schopnosti vyvolat rychlou indukci imunity, v experimentech zaměřených na dlouhověkost ochranného stavu, jediná imunizace s polymerním F1 generovala stabilnější a jednotnější IgG titry než imunizace s monomerním F1 (obrázek 4). Vakcinace samotným polyF1 však poskytla pouze částečnou ochranu proti plicnímu onemocnění. Je třeba poznamenat, že specifické titry anti-F1 IgG měřené u jednotlivých myší špatně korelovaly s jejich schopností přežít expozici (obrázek 5B). Vakcinace myší kombinací každé formy F1 spolu s LcrV vytvořila vyšší úrovně ochrany (obrázek 5). Tato zjištění jsou v souladu s předchozími studiemi, které prokázaly, že vakcinace vakcínou s usmrcenými celými buňkami (KWC), která indukuje titry anti-F1 IgG, ale ne anti-LcrV IgG, byla neúčinná při poskytování imunity proti plicnímu moru [13,40] .

Zatímco ve studii dlouhověkosti poskytoval polyF1 pouze částečnou pozdní imunitu, tento protein prokázal schopnost plně chránit myši krátce po vakcinaci, což naznačuje zapojení dalších krátkodobých imunitních mechanismů, které přispěly k odstranění patogenu v rychlém pokusy s imunitou. Nedávno jsme prokázali, že vakcinace atenuovaným kmenem Y. pestis EV76 spustila nutriční obranný mechanismus, který zrušil mechanismy virulence zprostředkované siderofory patogenu soutěžícího o ionty železa dostupné v hostiteli, což přispívá k rychlému nástupu imunity proti moru [ 41]. Objasnění podpůrných krátkodobých mechanismů, které synergizují s anti-F1 humorální imunitní odpovědí, může pomoci při vývoji vylepšených vakcín proti plicnímu moru i proti dalším letálním infekčním chorobám.

Doplňkové materiály:

Následující podpůrné informace lze stáhnout na https: //https://www.mdpi.com/article/10.3390/vaccines11030581/s1, Obrázek S1: Charakterizace plicního moru po intranazální inokulaci Y. pestis Kim53. Obrázek S2: Izotypová charakterizace protilátek anti-F1 a anti-LcrV v séru očkovaných myší. Obrázek S3: Dlouhověkost sérologické odpovědi a přežití samců myší po jediné vakcinaci monomerní F1 a polymerní F1 buď samotnou nebo s LcrV.

Příspěvky autora:

Konceptualizace, EM a YL; Správa dat, YL; Formální analýza, YL; Investigation, MA, AT, DG, YV, AZ a YL; Metodika, YL; Zdroje, TH a AM; Dohled, EM; Psaní – původní návrh, EM a YL; Psaní – recenze a úpravy, TC, EM a YL Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasili s ní.

Financování:

Tento výzkum byl financován Izraelským institutem pro biologický výzkum, grant číslo SB/07.

Prohlášení institucionální revizní komise:

Nelze použít.

Prohlášení o informovaném souhlasu:

Nelze použít.

Prohlášení o dostupnosti dat:

Údaje uvedené v této studii jsou k dispozici na vyžádání od příslušných autorů.

Střet zájmů:

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Reference

1. Butler, T. Plague a další infekce Yersinia; Greenough, W., Merigan, TC, Eds.; Plenum Medical Book Company: New York, NY, USA, 1983.

2. Randremanana, R.; Andrianaivoarimanana, V.; Nikolay, B.; Ramasindrazana, B.; Paireau, J.; Ten Bosch, QA; Rakotondramanga, JM; Rahajandraibe, S.; Rahelinirina, S.; Rakotomanana, F.; a kol. Epidemiologické charakteristiky epidemie městského moru na Madagaskaru, srpen-listopad, 2017: Zpráva o vypuknutí. Lancet Infect. Dis. 2019, 19, 537–545. [CrossRef]

3. Kugeler, KJ; Staples, JE; Hinckley, AF; Gage, KL; Mead, PS Epidemiologie lidského moru ve Spojených státech, 1900-2012. Emerg. Infikovat. Dis. 2015, 21, 16–22. [CrossRef]

4. Kugeler, KJ; Medovina, PS; Campbell, SB; Nelson, CA Vzorce antimikrobiální léčby a výsledek nemoci u pacientů ve Spojených státech s morem, 1942–2018. Clin. Infikovat. Dis. 2020, 70, S20–S26. [CrossRef]

5. Godfred-Cato, S.; Cooley, KM; Fleck-Derderian, S.; Becksted, HA; Russell, Z.; Meaney-Delman, D.; Medovina, PS; Nelson, CA Léčba lidského moru: Systematický přehled publikovaných souhrnných údajů o antimikrobiální účinnosti, 1939–2019. Clin. Infikovat. Dis. 2020, 70, S11–S19. [CrossRef]

6. Galimand, M.; Guiyoule, A.; Gerbaud, G.; Rasoamanana, B.; Chanteau, S.; Carniel, E.; Courvalin, P. Rezistence vůči více léčivům u Yersinia pestis zprostředkovaná přenosným plazmidem. N. Engl. J. Med. 1997, 337, 677-680. [CrossRef]

7. Welch, TJ; Fricke, WF; McDermott, PF; Bílá, DG; Rosso, ML; Raško, DA; Mammel, MK; Eppinger, M.; Rosovitz, MJ; Wagner, D.; a kol. Mnohonásobná antimikrobiální rezistence u moru: Nové riziko pro veřejné zdraví. PLoS ONE 2007, 2, e309. [CrossRef]

8. Lei, C.; Kumar, S. Yersinia pestis antibiotická rezistence: Systematický přehled. Osong Public Health Res. Perspektiva. 2022, 13, 24–36. [CrossRef]

9. Zauberman, A.; Gur, D.; Levy, Y.; Aftalion, M.; Vagima, Y.; Tidhar, A.; Chitlaru, T.; Mamroud, E. Postexpoziční podávání živé vakcíny Yersinia pestis pro potenciaci druhé linie antibiotické léčby proti pneumonickému moru. J. Infect. Dis. 2019, 220, 1147–1151. [CrossRef]

10. Vagima, Y.; Gur, D.; Aftalion, M.; Moses, S.; Levy, Y.; Makovitzki, A.; Holtzman, T.; Oren, Z.; Segula, Y.; Fatelevič, E.; a kol. Fágová terapie zesiluje antibiotickou léčbu druhé linie proti pneumonickému moru. Viry 2022, 14, 688. [CrossRef]

11. Levy, Y.; Flashner, Y.; Tidhar, A.; Zauberman, A.; Aftalion, M.; Lazar, S.; Gur, D.; Shafferman, A.; Mahmoud, E. T buňky hrají zásadní roli v anti-F1 zprostředkované rychlé ochraně proti bubonickému moru. Vaccine 2011, 29, 6866–6873. [CrossRef]

12. Levy, Y.; Vagima, Y.; Tidhar, A.; Aftalion, M.; Gur, D.; Nili, U.; Chitlaru, T.; Zauberman, A.; Mahmoud, E. Cílení kapsulárního antigenu Yersinia pestis F1 vrozenými buňkami B1b zprostředkovává rychlou ochrannou reakci proti bubonickému moru. NPJ Vaccines 2018, 3, 52. [CrossRef]

13. Williamson, ED; Stagg, AJ; Eley, SM; Taylor, R.; Green, M.; Jones, SM; Titball, RW Kinetika imunitní odpovědi na vakcínu (F1 plus V) na modelech dýmějového a plicního moru. Vaccine 2007, 25, 1142–1148. [CrossRef]

14. Holtzman, T.; Levy, Y.; Marcus, D.; Flashner, Y.; Mamroud, E.; Cohen, S.; Fass, R. Produkce a čištění oligomerů s vysokou molekulovou hmotností kapsulárního antigenu Yersinia pestis F1 uvolněného kulturou rekombinantních buněk Escherichia coli s vysokou hustotou buněk nesoucích operon cafl. Microb. Cell Factory 2006, 5, P98. [CrossRef]

15. Chalton, DA; Musson, JA; Flick-Smith, H.; Walker, N.; McGregor, A.; Jehněčí, HK; Williamson, ED; Miller, J.; Robinson, JH; Lakey, JH Imunogenicita vakcinačního antigenu Yersinia pestis monomerizovaného cirkulární permutací. Infikovat. Immun. 2006, 74, 6624–6631. [CrossRef]

16. Petsch, D.; Anspach, FB Odstranění endotoxinu z proteinových roztoků. J. Biotechnol. 2000, 76, 97–119. [CrossRef]

17. Leary, SE; Williamson, ED; Griffin, KF; Russell, P.; Eley, SM; Titball, RW Aktivní imunizace rekombinantním V antigenem z Yersinia pestis chrání myši před morem. Infikovat. Immun. 1995, 63, 2854–2858. [CrossRef]

18. Mechaly, A.; Vitner, EB; Levy, Y.; Gur, D.; Barlev-Gross, M.; Sittner, A.; Kořen, M.; Levy, H.; Mahmoud, E.; Fisher, M. Epitope Binning nových monoklonálních protilátek Anti F1 a Anti LcrV a jejich aplikace v jednoduchém, krátkém, HTRF testu pro klinickou detekci moru. Patogeny 2021, 10, 285. [CrossRef]

19. Tidhar, A.; Flashner, Y.; Cohen, S.; Levi, Y.; Zauberman, A.; Gur, D.; Aftalion, M.; Elhanany, E.; Zvi, A.; Shafferman, A.; a kol. NlpD lipoprotein je nový faktor virulence Yersinia pestis nezbytný pro rozvoj moru. PLoS ONE 2009, 4, e7023. [CrossRef]

20. Rákos, LJ; Muench, H. Jednoduchá metoda odhadu padesáti procent koncových bodů12. Dopoledne. J. Epidemiol. 1938, 27, 493–497. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com