Rapalogs a inhibitory MTOR jako terapeutika proti stárnutí

Rapamycin, inhibitor mechanistického cíle rapamycinu (mTOR), má dosud nejsilnější experimentální podporu jakopotenciální terapeutikum proti stárnutíu savců. Na rozdíl od mnoha jiných sloučenin, o kterých se tvrdilo, že ovlivňují dlouhověkost, byl rapamycin opakovaně testován na dlouhověkých, geneticky heterogenních myších, u kterých prodlužuje střední i maximální délku života. Mechanismus, který odpovídá za tyto účinky, však není zdaleka jasný a rostoucí seznam vedlejších účinků vyvolává pochybnosti, zda by rapamycin byl nakonec prospěšný u lidí. Tato recenze pojednává o vyhlídkách na vývoj novějších, bezpečnějšíchterapie proti stárnutízaložené na analogech rapamycinu (nazývaných rapalogy) nebo jiných přístupech zaměřených na signalizaci mTOR.

Kliknutím sem získáte další informace o Cistanche pro ošetření proti stárnutí

Stručná historie rapamycinu a mechanistický cíl rapamycinu Rapamycin byl objeven v půdě Velikonočního ostrova jako sloučenina produkovaná Streptomyces hygroscopicus, která byla schopna inhibovat proliferaci kvasinky Candida albicans, ale neovlivňovala růst bakterií (1). U savců bylo zjištěno, že rapamycin inhibuje imunitní odpověď a následně byl přijat jako standardní terapie k prevenci rejekce štěpu u příjemců transplantátu a k léčbě autoimunitních poruch (2, 3). Rapamycin také široce inhibuje růst a proliferaci savčích buněk, což podnítí novější zájem o jeho použití jako terapie rakoviny (4). Mechanicky rapamycin váže FKBP12, imunofilin s prolylizomerázovou aktivitou. Dva další proteiny potřebné pro jeho účinky v kvasinkách byly identifikovány v genetickém screeningu v roce 1991 a byly označeny jako cíle rapamycinu 1 (TOR1) a TOR2 (5). Během let 1994 a 1995 tři samostatné skupiny izolovaly 289-kDa kinázu, která je vázána a inhibována komplexem rapamycin-FKBP12 v savčích buňkách (6–8). Tato kináza je nyní známá jako mechanický cíl rapamycinu (mTOR) a je přibližně ze 40 procent homologní s proteiny TOR Saccharomyces cerevisiae a mezi eukaryoty je vysoce konzervovaná. mTOR se nachází ve dvou komplexech, které mají odlišné funkce a různou citlivost na působení rapamycinu. mTOR komplex 1 (mTORC1; sestávající z mTOR, raptor, mLST8/GL, PRAS40, DEPTOR) hraje klíčovou roli v regulaci translace a buněčného růstu prostřednictvím fosforylace substrátů, které zahrnují S6 kinázu (S6K) a eukaryotický iniciační faktor eIF4E vazebný protein (4E-BP) a je silně inhibován rapamycinem. Naproti tomu mTORC2 (skládající se z mTOR, Rictor, mLST8/GL, mSIN1, pro tor, DEPTOR) reguluje různorodou sadu substrátů, včetně AKT S473, sérem/glukokortikoidy regulované kinázy a PKC-, a je akutně rezistentní vůči rapamycinu, i když se při chronické expozici může fyzicky narušit. mTORC přijímají vstupy prostřednictvím široké škály signalizačních mechanismů a hrají roli v mnoha aspektech fyziologie, které byly do hloubky přezkoumány (9). Stručně řečeno, mTORC1 reaguje na signály, které zahrnují aminokyseliny, glukózu, WNT ligandy, kyslík, cAMP a inzulín/IGF-1. Regulace aktivity mTORC2 je méně jasná, ale může zahrnovat interakci s ribozomy (10). Signalizace inzulinu/IGF-1 do mTORC1 je částečně zprostředkována mTORC2 prostřednictvím fosforylace AKT. Aktivace mTORC1 zase zpětně zeslabuje signalizaci inzulinu/IGF-1 prostřednictvím S6K1 a GRB10 (obrázek 1 a odkaz 11).

Propojení signalizace mTOR s věkem Role signalizace TOR při stárnutí byla poprvé odhalena v roce 2003, kdy Vellai a kolegové ukázali, že RNAi proti let-363/ CeTor významně prodlužuje životnost Caenorhabditis elegans a funguje nezávisle na daf{{2} }, homo log FOXO, u kterého bylo dříve prokázáno, že ovlivňuje délku života (12). Poté rychle následovala demonstrace, že genetická inhibice signalizace TOR prodlužuje životnost u Drosophila melanogaster a pučící kvasinky S. cerevisiae (13, 14). Genetická inhibice signalizace mTOR u savců je choulostivá záležitost, protože protein kináza mTOR, raptor, ricor a mLST8 jsou všechny nezbytné pro vývoj (15). Nedávno jsme prokázali, že samice myší Mtor plus /–Mlst8 plus /– snížily aktivitu mTORC1 a prodloužily životnost, podobně jako fenotyp uváděný Sel manem a kolegy u myší, kterým chybí S6K1, jeden z hlavních substrátů mTORC1 (16, 17 ). Zdá se tedy, že spojení mezi signalizací mTOR a dlouhověkostí je zachováno od kvasinek po savce (tabulka 1).

Účinky rapamycinu na dlouhověkost

Rapamycin prodlužuje životnost u kvasinek, červů a much (tabulka 2 a odkazy 18–21). V roce 2009 bylo prokázáno, že rapamycin prodlužuje střední i maximální délku života samců a samic geneticky heterogenních myší (potomky čtyřcestného křížení mezi dlouhověkými, inbredními kmeny) (22). Je pozoruhodné, že léčba nebyla zahájena, dokud myši nedosáhly pokročilého věku (20 měsíců), což je zhruba ekvivalent lidského věku 60 let. V následné studii začínající ve věku 9 měsíců prodloužil rapamycin střední délku života u mužů o 10 procent au žen o 18 procent a maximální délku života o 16 procent a 13 procent (23). Rapamycin byl během těchto studií mikroenkapsulován v enterosolventním povlaku, který umožňoval dodání v potravě, a dosažená hladina v krvi byla přibližně třikrát vyšší než typické terapeutické rozmezí pro imunosupresi u lidí (24).

Obrázek 1 Signalizace mTOR. mTOR se nachází ve dvou komplexech, mTORC1 a mTORC2. mTORC1 je regulován částečně prostřednictvím komplexu TSC, který normálně působí jako protein aktivující GTPázu pro Rheb k potlačení signalizace mTORC1. mTORC1 je také regulován aminokyselinami prostřednictvím rodiny malých GTPáz souvisejících s GTP (Rag) Ras. Proteiny Rag aktivují mTORC1 lokalizací mTORC1 do lysozomu prostřednictvím interakce s komplexem regulátoru (110). mTORC1 podporuje růst posílením ribozomální biogeneze, translace a dalších anabolických procesů a zároveň inhibuje autofagii. mTORC1 potlačuje signalizaci inzulínu/IGF-1 prostřednictvím přímé regulace Grb10 a S6K, což následně snižuje signalizaci k mTORC2. AKT, inhibitor TSC1/2, je jedním z několika přímých substrátů mTORC2. Procesy, které jsou upregulovány signalizací mTOR, jsou zobrazeny červeně; ty, které jsou down-regulovány signalizací mTOR, jsou zobrazeny modře.

Jiné studie také zjistily pozitivní účinek rapamycinu na délku života. Chen a kol. zjistili, že rapamycinsnížila úmrtnost u starších mužůC57BL/6 myši (25). Anisimov a kol. prokázali, že rapamycin prodlužuje maximální délku života (průměrnou délku života posledních 10 procent přeživších) u krátkodobého kmene myší náchylných k nádorům (FVB/N HER-2/neu transgenní) (26). I když tato studie poskytuje silný důkaz, že rapamycin může být prospěšný při léčbě rakoviny, výběr kmene ztěžuje oddělení protirakovinných účinků od stárnutí jako takového. Nicméně rapamycin také prodlužuje životnost u 129/Sv myší, inbredního kmene s typičtější délkou života a výskytem nádorů (27). Působivé je, že 22,9 procenta léčených myší zůstalo naživu při smrti posledního kontrolního zvířete.

Celkově vzato, tato pozorování činí z rapamycinu nejlépe podporovaného kandidáta na lék na dlouhověkost u savců. Pochopení mechanismu jeho působení má potenciál nabídnout vhled do podstaty základního procesu stárnutí a může vést k novým terapeutickým přístupům ke zmírnění zátěže nemocí souvisejících s věkem. Mechanismus odpovědný za účinky rapamycinu proti stárnutí však zatím není jasný (tabulka 2).

Potenciální mechanismy prodloužení životnosti rapamycinem

Protirakovinné účinky. Rakovina je nejčastější příčinou smrti laboratorních myší a rapamycin je protirakovinný lék. Proto zůstává možné, že prodloužení životnosti rapamycinem je sekundární k potlačení nádoru a nesouvisí se základním procesem stárnutí. Důvodů, proč tento model neupřednostňujeme, je několik. Za prvé, počáteční experimenty spojující inhibici rapamycinu a mTOR s dlouhověkostí byly provedeny na organismech, které jsou převážně postmitotické (červi a mouchy) nebo jednobuněčné (kvasinky), a proto nemají rakovinu. Za druhé, rapamycin zvyšuje maximální dlouhověkost a poskytuje podporu pro myšlenku, že zpomaluje četné patologické stavy související s věkem. Zaměření na jednu nemoc by nemělo podstatně prodloužit délku života nejdéle žijících jedinců ve skupině, protože nejstarší jedinci budou vystaveni velmi vysokému riziku většiny nebo všech příčin smrti, pokud nebude odložen základní proces stárnutí. Za třetí, bylo prokázáno, že rapamycin oddaluje četné změny související s věkem u myší, včetně ztráty funkce kmenových buněk (25), kognitivního poklesu (28), retinopatie (29), akumulace subcelulárních změn v myokardu, degenerace jater, hyperplazie endometria , ztuhnutí šlach a pokles fyzické aktivity (30). Kromě toho je rapamycin léčebný u modelů srdeční hypertrofie na hlodavcích (31, 32) a neurodegenerativních onemocnění (33–35), což jsou stavy, které ovlivňují stárnoucí lidi. Zatímco prevence rakoviny jasně hraje hlavní roli v přínosu rapamycinu pro přežití, je důležité pochopit, že rakovina je onemocnění související s věkem a její prevence je očekávaným důsledkem jakékoli terapie, která zpomaluje stárnutí.

Překlad. mTORC1, prostřednictvím S6K a 4E-BP, hraje ústřední roli v regulaci translace a stojí za zvážení, zda snížená syntéza proteinů sama o sobě může zprostředkovat účinky rapamycinu na dlouhověkost. Například snížení celkové rychlosti translace může umožnit lepší věrnost během syntézy a/nebo zmírnit stres na mechanismy, které degradují chybné, špatně složené nebo poškozené proteiny (36). Experimenty na S. cerevisiae, C. elegans a D. melanogaster skutečně prokázaly, že delece nebo siRNA zprostředkované knockdown ribozomálních podjednotek, S6K nebo iniciačních faktorů translace vede ke zvýšení délky života a delece S6K1 prodlužuje životnost u myších samic, zatímco delece 4E-BP blokuje život prodlužující účinky kalorické restrikce (CR) u much (13, 37–40).

Nedávné poznatky zpochybňují názor, že translace jako taková je klíčem k výhodám inhibice TOR/mTOR. Zatímco samice myší bez S6K1 mají prodlouženou životnost, není patrný žádný vliv na celkovou translaci, alespoň v kosterním svalstvu (41). Kromě toho lze dlouhou životnost červů, kterým chybí klíčový iniciační faktor translace, dále zvýšit delecí TOR, což znamená, že ve hře jsou odlišné mechanismy (38). Navíc prodloužení životnosti v důsledku odstranění faktorů iniciace translace závisí na daf-16, zatímco prodloužení životnosti vyčerpáním TOR, S6K nebo ribozomálních podjednotek není, což opět ukazuje na zapojení více odlišných mechanismů (12 , 37). Je zajímavé, že snížení TOR pomocí RNAi nedokáže dále prodloužit životnost eat-2 mutantních červů, což je model pro CR, navzdory potlačení již tak nízké rychlosti syntézy proteinů o dalších 49 procent (37). Kromě toho inaktivace červího homologu AMPK je dostatečná k potlačení prodloužení délky života u zvířat postrádajících S6K, zdánlivě bez ovlivnění translace (16). Je zřejmé, že vztah mezi překladem a životností je složitější, než se původně předpokládalo

Translace specifických mRNA může ovlivnit délku života.

Zatímco úplná ztráta funkce mTOR má hlavní vliv na obecnou translaci, rapamycin má jemnější účinek, s největší pravděpodobností proto, že podskupina funkcí 4E-BP je na rapamycin rezistentní (42, 43). Jak rapamycin, tak úplná inhibice mTOR preferenčně potlačují translaci mRNA s 5′ terminálními oligopyrimidinovými motivy, což naznačuje potenciální roli těchto genů v dlouhověkosti (43, 44). Navzdory snížení celkové syntézy proteinů CR u much specificky zvyšuje translaci podskupiny mRNA, které mají krátké a méně strukturované 5' UTR, včetně mitochondriálních genů kódovaných v jádře (40). Pro tento efekt a pro prodloužení životnosti je vyžadován TOR substrát 4E-BP. U kvasinek bez ribozomálních podjednotek nebo TOR vyžaduje prodloužení plné životnosti zvýšenou translaci specifického transkriptu, GCN4 (45). Exprese GCN4 je omezena několika upstream ORF, které normálně sekvestrují ribozomy, které se vážou na mRNA. Za podmínek snížené aktivity TOR nebo velkého množství ribozomálních podjednotek jsou upstream ORF častěji vynechány, aby se iniciovala translace GCN4 ORF. Tyto příklady zdůrazňují jemnosti regulace překladu, které teprve začínáme oceňovat.

Tabulka 2 Účinky rapamycinu na dlouhověkost

Autofagie. Dalším účinkem inhibice mTOR, který byl spojen s dlouhověkostí, je indukce autofagie, což je proces, při kterém buňky recyklují své proteiny a organely. Autofagie umožňuje buňkám přežít podmínky omezené živinami a je ústředním mechanismem, kterým jsou poškozené složky odstraněny. Za podmínek dostatku živin mTOR fosforyluje a inhibuje autofagii iniciující kinázu ULK1 (46). Inaktivace genů zapojených do autofagie snižuje délku života u kvasinek (chronologicky), C. elegans a Drosophila a podpora autofagie v nervovém systému much prodlužuje životnost (47–49). Kromě toho je autofagie vyžadována pro prodloužení chronologické délky života kvasinek rapamycinem (47) a pro prodloužení životnosti pomocí CR nebo genetické inhibice signalizace mTOR u červů (50).

U savců se také zdá, že autofagie hraje významnou roli v procesu stárnutí. Nejdramatičtější je, že indukce autofagie je dostatečná k omlazení jaterní histologie a funkce starých myší (51). Navíc se zdá, že autofagie je u CR myší upregulována a zprostředkovává některé příznivé účinky CR diety na srdce, játra a ledviny (52–54). Buňky z dlouhověkých trpasličích myší Snell také vykazují známky zvýšené autofagie (55).Kardiomyocyty iizolované ze starých myší mají nižší autofagii a vykazují defekty v zacházení s vápníkem, které jsou oba korigovány expozicí rapamycinu ex vivo (56). Zvýšená autofagie však nemusí být vždy prospěšná a skutečně může přispívat k pro-stárnutí fenotypu progeroidních myší (57).

Je zajímavé, že rapamycin zmírňuje nukleární puchýře a předčasné stárnutí v buňkách pocházejících od pacientů s Hutchinson Gilford progerií, vzácným syndromem předčasného stárnutí (58). Onemocnění je důsledkem chybně napsané varianty laminu A, nazývané progerin, která se ve velké míře hromadí u pacientů a je také detekována v menším množství během normálního buněčného stárnutí (59, 60). Zdá se, že rapamycin stimuluje clearance progerinu z nemocných buněk prostřednictvím autofagie, a tak může také omezit normální akumulaci progerinu související s věkem. Celkově je vhodná regulace autofagie pravděpodobně kritickým determinantem zdravého stárnutí.

Obrázek 2 Chronická léčba rapamycinem narušuje mTORC2. (A) In vivo živiny a růstové faktory řídí aktivitu mTORC1 a mTORC2, které podporují růst, stárnutí a citlivost na inzulín. (B) Akutní léčba rapamycinem inhibuje signalizaci mTORC1, omezuje růst a podporuje dlouhověkost bez snížení citlivosti na inzulín. (C) Chronická léčba rapamycinem inhibuje mTORC1 i mTORC2, omezuje růst a zhoršuje signalizaci inzulínu, ale podporuje dlouhověkost

Údržba kmenových buněk. Rapamycin má řadu zajímavých účinků na funkci kmenových buněk. Hyperaktivní signalizace upstream od mTORC1 v důsledku delece Pten, delece tuberózní sklerózy 1 (Tsc1) nebo konstitutivní aktivace AKT snižuje počet a funkční kapacitu HSC (61–63). Léčba rapamycinem může obnovit normální schopnost sebeobnovy v subpopulaci myších HSC, které mají spontánně vysoký oxidační stres a sníženou funkční kapacitu (64). Nedávno Chen a kol. poznamenali, že aktivita mTORC1 je zvýšená u HSC odvozených od starých myší, které vykazují funkční deficity připomínající deficity způsobené delecí Tsc1 (25). Rapamycin obnovil funkční kapacitu v HSC ze starých myší a posílil imunitní odpověď na virus chřipky. Rapamycin také zvyšuje samoobnovu střevních kmenových buněk prostřednictvím inhibice mTORC1 v sousedních Panethových buňkách, podobně jako účinky, které byly pozorovány u zvířat s CR (65). Kromě toho rapamycin podporuje přeprogramování somatických buněk, aby generovaly indukované pluripotentní kmenové buňky, což naznačuje obecnou podporu funkce kmenových buněk (66). Na druhé straně rapamycin zhoršuje pluripotenci, snižuje proliferaci a podporuje diferenciaci v lidských embryonálních kmenových buňkách (67, 68). V myších embryonálních kmenových buňkách je exprese pluripotenčních markerů odolnější vůči léčbě rapamycinem, přesto je velikost buněk a proliferace stále snížena a diferenciace je zvýšena (67, 69). Je zajímavé, že rapamycin vyčerpává buňky iniciující leukémii a inhibuje jak sebeobnovovací, tak i diferenciační kapacitu kmenových buněk odvozených z infantilního hemangiomu, což naznačuje ochranný účinek proti rakovinným kmenovým buňkám (61, 70). Dohromady tyto výsledky naznačují, že rapamycin moduluje chování kmenových buněk a obecně podporuje zachování "kmenovky" a mladšího fenotypu u dospělých typů kmenových buněk, které byly studovány.

jako imunosupresivum by nemělo být přehlíženo, pokud jde o dlouhověkost.

Chronický,zánět nízkého stupně je znakem stárnutía téměř každé chronické onemocnění má zánětlivou složku (71). Úplná diskuse o imunologických účincích rapamycinu přesahuje rámec tohoto přehledu a toto téma bylo řešeno jinde (72). Důležité je, že lék má pozitivní i negativní účinky na vrozenou a adaptivní imunitu, s čistým výsledkem, který je složitější než jednoduchá imunosuprese, což dokládá jeho schopnost zvýšit imunizaci starých myší proti viru chřipky (25). mTORC2-závislé mechanismy. Navzdory vysoké specificitě rapamycinu pro mTORC1 během akutní léčby může chronická expozice také inhibovat mTORC2. Tento účinek byl poprvé pozorován u určitých kultivovaných buněčných linií (73) a nedávno jsme ukázali, že se také vyskytuje in vivo ve více tkáních včetně jater, svalů a tukové tkáně (viz obrázek 2). V současné době není jasné, zda inhibice mTORC2 hraje roli v účincích rapamycinu na dlouhověkost. Samice myší postrádající S6K1 a samice myší Mtor plus /–Mlst8 plus /– mají zdánlivě dlouhý život kvůli poruchám signalizace závislé na mTORC1-, ale údaje od C. elegans naznačují, že inhibice mTORC2 může také podporovat dlouhověkost ( 21, 74). Je zajímavé, že prodloužení délky života přerušením mTORC1 u červů vyžaduje skin-1 (homolog savčího NRF1/2) a daf-16 (homolog savčích FOXO), oba transkripční faktory, které řídí geny zapojené do obrany proti stresu. Prodloužení životnosti rapamycinem nebo přerušením mTORC2 však vyžaduje pouze SKN-1. V souladu s úlohou obecné obrany proti stresu v přínosech rapamycinu jsou červi i mouchy s narušenou funkcí TOR odolní vůči stresu a v játrech myší léčených rapamycinem (2 mg) byla detekována indukce cílových genů NRF1/2 a FOXO /kg denně po dobu dvou týdnů) (20, 21).