Proteiny byly nalezeny s frekvencí nejméně 2 v každém zkoumaném stavu
Sep 06, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Dále, jak ze sloupcových grafů na obrázcích 5B a 6B, je výrazná distribuce proteinů podle hypoxického předkondicionování sekrečních buněk znatelná. V tomto případě byly pro úplnou informaci uvedeny také proteiny, které nepřekračují práh DAve a DCI setu. Fetální výsledky sekretomů obohacené o 60 kDa protein tepelného šoku (HSPD1, obrázek 5B, levý panel) ve své hypoxické formulaci, zatímco perinatální protějšek vysoce exprimuje regulační [52]lehký polypeptid 9 kontraktilního myosinu hladkého svalstva (MYL9, obrázek 5B, pravý panel). Zdá se, že významný podíl rozdílu mezi gestačními stádii závisí více na hypoxickém preconditioningu u hAFS. EV; f-have-EV získané z primární aktivace hypoxických buněk byly nalezeny obohacené o faktory včetně Perlecanu (HSPG2), Agrinu (AGRN), podjednotky lamininu -5 a -1(LAMA5 a LAMB1), trombospondinu{{17 }} (THBS1, obrázek 6B, levý panel). Hypoxické p-hAFS-EV obsahovaly Ferritin Heavy Chain (FTH1), lešení proteiny jako Flotillin-1 (FLOT1), Fascin (FSCN1), Annexin A6 (ANXA6), Rab GDP disociační inhibitor beta (GDI2), spolu s Thy -1 membránový glykoprotein (THY1), neuropilin-1 (NRP1) a matricový metaloprotein 14 (MMP14, obrázek 6B, pravý panel).
Proteiny byly nalezeny s frekvencí alespoň 2 v každém zkoumaném stavu v f-hAFS. EV a p-hAFS-EV byly dále porovnány s databází Vesciclepedia [53]. Jak se očekávalo, většina identifikovaných proteinů (96 procent) byla dříve popsána v EV a exozomech v referenční databázi (obrázek S3A).cistanche výhodyV tomto ohledu byla provedena analýza obohacení genové ontologie (GO) pomocí FunRich [54]. Množství GO termínů v datovém souboru bylo porovnáno s jejich přirozeným množstvím v referenční databázi, aby se našly statisticky nadměrně zastoupené skupiny proteinů podle jejich zapojení do biologických procesů, molekulární funkce a buněčných složek (pro tento poslední aspekt údaje nejsou zobrazeno, ale je k dispozici na vyžádání). Pokud jde o analýzu molekulárních funkcí spojených s identifikovanými proteiny, hAFS-CM frakce indikovaly obohacení strukturní složky extracelulární matrice a cytoskeletu, vazbu cytoskeletálního proteinu a aktivitu strukturní molekuly (obrázek S2), zatímco hAFS-EV byly obohaceny o strukturní složku. složka cytoskeletu a ribozomu, vazba DNA a RNA a vazebné faktory GTPázy a chaperonu (obrázek S3C).
Analýza obohacení biologických procesů pro hAFS-CM i have-EV ukázala, že většina proteinů modulovaných ve fetálních a perinatálních frakcích sekretomu hAFS patří k buněčnému růstu/udržování a metabolismu proteinů (obrázky 5C a 6C). V rámci hAFS-EV jsme si všimli, že termín "strukturní složky extracelulární matrice" byl výhradně spojen s hypoxickými f-hAF-EV; termíny „vazba vápenatých iontů" a „strukturní molekulární aktivita" byly obohaceny hlavně v hypoxických vzorcích f-hAFS a p-hAFS (obrázek S3B).
Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10,4I a DCI (důvěra diferenciální exprese) Větší nebo rovno I5I prošly filtry a byly považovány za diferenciálně vyjádřené; viz Tabulka S3 pro úplný seznam a podrobné parametry uváděných proteinů. (C) Analýza obohacení biologických procesů proteinů identifikovaných s frekvencí alespoň 2 v f-hAFS-EVs (levý panel) a p-hAFS-EVs (pravý panel) po hypoxické předběžné úpravě. Na základě nástroje FunRich jsou termíny genové ontologie zobrazeny ve sloupcových grafech udávajících procento genů obohacených pro každou kategorii (tmavě žluté sloupce pro f-hAFS-EVsnormo, červené sloupce pro f-hAFS-EVShypo, světle zelené sloupce pro p-hAFS -EVsnormo a tmavě zelené pruhy pro p-hAFS-EVShypo). Pouze termíny genové ontologie s opravenou Bonferroni*p<0.05 are="">
Cistanche může proti stárnutí
2.6. Cytokinové a chemokinové profilování fetální vs. perinatální má-CM a mít-EV odhalilo různé distribuční vzorce
Již dříve jsme potvrdili regenerační schopnost f-hAFS-CMhypo na poraněné kardiovaskulární buňky prostřednictvím parakrinních účinků [34,35,49]. Zde jsme porovnávali obsah cytokinů a chemokinů f-hAFS-CMHypo s odpovídajícím protějškem p-hAFS (obrázek 7A, obrázek S4A a tabulka S4) a našli jsme některé diskriminační faktory.
ANGIOGENIN, induktor metaloproteinázy extracelulární matrice (EMMPRIN), interleukin 8 (IL-8) a monocytový chemoatraktantový protein-1 (MCP-1) byly nalezeny výhradně obohacené inf-hAFS-CMNypo a nebyly detekovaný v p-hAFS-CMhypo. Inzulinu podobný růstový faktor vázající protein 2 (IGFBP2) a osteopontin (OPN) byly významně zvýšeny u f-hAFS-CMhypo oproti p-hAFS-CMHypo o 3.5-a 3.{18}}násobně („" p<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">
Zatímco fetální versus perinatální CM vykazovaly rozdílnou expresi v jejich cytokinovém a chemokinovém profilu, odpovídající fetální versus perinatální EV protějšky byly distribuovány homogenněji, i když s nižšími profily exprese (obrázek 7B, obrázek S4B a tabulka S5). Nicméně některé rozdíly lze ocenit: DiPeptidyl-Peptidáza IV (DPPIV), Růstový/diferenciační faktor 15 (GDF-15) a IL-8 byly vyjádřeny pouze pomocí f-hAFS-EVSHypo, i když na nízké úrovni úrovně; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND a vitamin D-binding Protein (VDBP) byly nalezeny pouze v p-hAFS-EVShypo, přestože byly opět detekovány v nízkých množstvích. Další cytokiny, jako je mozkový neurotrofický faktor (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, inzulinu podobný růstový faktor vázající protein 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, stromální faktor{101} {23}} alfa (SDF-1a), byly nalezeny jak u f-hAFS-EVShypo, tak u p-hAFS-EVSHvpo, přičemž PAI-1 a EMMPRIN byly více exprimovány (obrázek 7B)
BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 a SDF-lo byly výhradně obohaceny ve všech hypoxických have-EV ve srovnání s odpovídajícím hAFS-CM, bez ohledu na gestační fázi. Navíc, zatímco EMMPRIN nebyl detekován v p-hAFS-CMhypo, bylo zjištěno, že je obohacený o EV odpovídající frakci; naopak OPN byl hojnější u f-have-CMhypo než u f-have-EVShypo, zatímco byl srovnatelný mezi odpovídajícími frakcemi sekretomu p-hAFS. FGF-19, MIF a PTX3 byly podobně exprimovány ve fetálním i perinatálním has-CM a v odpovídajících hAFS-EV. PAI-1 byla vysoce obohacena o hypoxické frakce sekretomu.
Obrázek 7. Cytokinové a chemokinové profilování ve formulacích fetálního a perinatálního sekretomu hAFS. (A) Exprese cytokinů a chemokinů detekovaných v hypoxickém fetálním versus perinatálním have-CM (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo) jsou uváděny v hustotě pixelů v libovolné jednotce [AU]. Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± sem z nezávislých experimentů a jsou uvedeny v tabulce S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B)Obsah cytokinů a chemokinů zjištěný v hypoxickém plodu versus perinatální hAFS-EVs (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) a vyjádřeno hustotou pixelů v libovolných jednotkách [AU].cistanche cholesterolHodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± sem z n =3 nezávislých experimentů a jsou uvedeny v tabulce S5. CST3: Cystatin C;EMMPRIN:Metaloproteinázový induktor extracelulární matrix;FCFF-19: Fibroblastový růstový faktor-19;IGFBP2:Inzulinu podobný růstový faktor (IGF)vazebný protein 2;IL-8:interleukin -8;IL-17a:Interleukin-17a; MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein-1;MIF: Inhibiční faktor migrace makrofágů; PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: Inhibitor aktivátoru plazminogenu{17}}; BDNF: Neurotrofický faktor odvozený z mozku; DPPIV: dipeptidyl peptidáza IV; GDF-15:Růstový diferenciační faktor-15;IGFBP3:Inzulinu podobný růstový faktor (IGF)Binding Protein 3;SDF-1a: Stromální odvozený faktor-1 alfa; VDBP: Protein vázající vitamín D.
2.7. Fetální a perinatální EV jsou obohaceny o informace RNA v jejich nákladu
Protože malé nekódující RNA byly považovány za hlavní regulátory parakrinního vlivu EV na cílové buňky [4,55], zaměřili jsme analýzu sekvenování RNA především na obsah mikroRNA (miRNA) v rámci f-hAFS-EV a p-hAFS-EV. Malé profilování RNA ukázalo obohacení miRNA ve fetálních i perinatálních hAFS-EV (kolem 35-36 procent) ve srovnání s celkovým malým množstvím RNA (obrázek 8A). Složka miRNA skutečně patřila mezi dva nejvíce zastoupené druhy RNA v obou formulacích EV, spolu s rRNA(***p) p < 0.0001).="" v="" analyzovaných="" vzorcích="" ev="" byly="" nejvíce="" obohaceny="" následující="" mirna:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,let-7a-5p,let-7b-5p,let-7f{="" {27}}p,let-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" a="" mir-221-3p.="" je="" třeba="" poznamenat,="" že="" fetální="" a="" perinatální="" ev="" sdílely="" většinu="" takových="" mirna="" (jmenovitě="" -7a-5p,="" let-7b-5p,="" let{{47="" }}f-5p,="" let-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" a="" mir-221-3p,="" obrázek="" 7b).="" 15="" nejvíce="" obohacených="" druhů="" mirna="" pokrývalo="" více="" než="" 60="" procent="" celkového="" obsahu="" mirna="" v="" každém="" vzorku.="" na="" druhé="" straně="" bylo="" ve="" zbývajících="" 30="" procentech="" obsahu="" vezikulární="" mirna="" nalezeno="" asi="" 100="" mirna="" (obrázek="">
Abychom dále charakterizovali obsah miRNA v hAFS-EV, zkoumali jsme, zda hAFS gestační stádium nebo in vitro hypoxické předkondicionování buněk může ovlivnit obohacení specifických miRNA. Nejsilnější modulace byla nalezena mezi gestačními stádii, kde byly téměř všechny modulované miRNA obohaceny o f-hAFS-EVs oproti perinatálnímu protějšku (obrázek 9A a tabulka 1). Hypoxické předkondicionování mělo mírnější účinek na náklad miRNA, zatímco v tomto srovnání byla modulace v obou směrech, přičemž některé miRNA byly obohaceny o hypoxické a jiné v normoxických kontrolních podmínkách (obrázek 9A).
Jako doplňkovou analýzu jsme se zaměřili na identifikaci zkoumaných miRNA s nejnižší variabilitou napříč různými dárci a předkondicionováním kultury, pro EV odvozené z obou zkoumaných gestačních stadií. miRNA vyplývající z této analýzy se pohybovaly od vysokých po nízké úrovně exprese (obrázek 9B). V nejstabilnějším miRNA jádra nákladu hAFS-EVs byly identifikovány některé sdílené miRNA mezi f-hAFS-EV a p-hAFS-EV (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p na vysoké úrovni; miR-221-3p,miR-221-5p a miR-22-3p na úrovni šera, tabulka 2).
Obrázek 9. Analýza rozdílného obohacení miRNA ve fetálních a perinatálních hAFS-EV. (A) Vulkánové grafy pro rozdílné obohacení hAFS-EV miRNA nákladu podle gestačního stádia (levý panel) a in vitro hypoxické předkondicionování sekrečních buněk (pravý panel). Podrobnosti o miRNA naleznete v tabulce 1. (B) Bodový graf korelace mezi variabilitou (osa X) a úrovní obohacení (osa Y) stabilních miRNA v rámci fetálních hAFS-EVs (levý panel) a perinatálních hAFS-EVs (pravý panel) podle vysoké (žluté tečky), slabé (zelené tečky) a nízké (tmavě fialové tečky) obohacení. Podrobnosti o miRNA naleznete v tabulce 2. RPM: čtení na milion.
3. Diskuse
Zbylé vyřazené vzorky lidské plodové vody byly identifikovány jako cenný zdroj stromálních buněk se slibným potenciálem v regenerativní medicíně a tkáňovém inženýrství. Etické obavy spojené s jejich izolací jsou minimální, protože je lze získat buď ze zbylých vzorků rutinní prenatální screeningové amniocentézy, během II. trimestru gestace (fetální hAFS), nebo z plodové vody vyřazené jako klinický odpad ve III. trimestru plánovaného císařského řezu. V posledních letech byl hAFS navržen jako potenciální terapeutika pro obnovu a regeneraci lidské tkáně vzhledem k povzbudivým důkazům získaným z experimentálních modelů onemocnění. Je zajímavé, že byly také navrženy pro in utero terapii fetálně-neonatálních neurologických onemocnění; předklinické studie skutečně naznačovaly, že hAFS podávaný prenatálně prostřednictvím intraamniotického porodu chránil míchu během gestace prostřednictvím parakrinní aktivity na potkaním modelu myelomeningokély [56-58] a snižoval poškození exponovaného střeva při experimentální gastroschíze hlodavců[59] ]. Z translačního hlediska by in utero transplantace hAFS mohla být nahrazena podáním nejvhodnějšího preparátu jejich sekretomu (hAFS-CM nebo hAFS-EVs).vedlejší účinky cistanche deserticolaTato strategie by umožnila rychlý a včasný zásah během těhotenství překonáním omezení kanonické buněčné terapie (tj. časově náročnou in vitro buněčnou expanzí) při současném poskytování standardních farmaceutických formulací připravených k použití.
Nedávný vývoj méně invazivních technik prenatální diagnostiky může v blízké budoucnosti vést k poklesu amniocentézy, a proto obhajuje perinatální hAFS jako dostupnější možnost. Nicméně, protože fetální hAFS jsou vývojově nezralejší, mohou mít účinnější parakrinní potenciál. V rámci tohoto scénáře jsme zde porovnávali fetální a perinatální c-KITt hAFS a zaměřili jsme se na profilování jejich sekretomových frakcí. Zdůraznili jsme relevantní rozdíly, které je třeba vzít v úvahu pro možný klinický překlad jejich parakrinní kapacity.
Ve shodě s předchozími nezávislými studiemi jsme prokázali, že gestační stadium neovlivnilo heterogenní morfologii hAFS a jejich mezenchymální antigenní profil [25,26]. Poté jsme hodnotili parametry, které pravděpodobněji ovlivňují buněčnou sekreční a parakrinní aktivitu nad rámec kanonického stromálního imunofenotypu. Nedávno bylo prokázáno, že přítomnost CD146-pozitivní subpopulace s vysokým obsahem CD107a v mezenchymálních progenitorech kostní dřeně koreluje s pozoruhodnou modulační a terapeutickou parakrinní aktivitou [47]. Zde jsme odhalili, že jak fetální, tak perinatální hAFS jsou silně charakterizovány tímto molekulárním podpisem podporujícím jejich sekreční sílu s relevantními translačními důsledky. Navíc fetální hAFS byly charakterizovány neefektivním aerobním metabolismem, zatímco zralejší perinatální hAFS vykazovaly vyšší spotřebu kyslíku a syntézu ATP. To může naznačovat nezralejší metabolický profil hAFS v II. trimestru, který se podobá buňkám pupečníkového stromatu předčasně narozených novorozenců, které vykazovaly stejný trend [60].
Aby se spustil parakrinní potenciál, byly hAFS vystaveny 24hodinovému hypoxickému primingu bez séra, strategii, kterou jsme dříve úspěšně vyvinuli [34,35,37] pro fetální buňky a kterou jsme zde poprvé zkoumali na jejich perinatálním protějšku. Předkondicionování fetálního a perinatálního hAFS při hypoxii mělo za následek pozitivní trend ve zvýšení koncentrace jejich sekretomů a množství uvolněných EV, zatímco gestační stadium nemělo žádný vliv na výtěžek buněčného sekretomu ani na morfologii a distribuci velikosti EV.
Charakterizace parakrinního nákladu hAFS odhalila některé specifické rozdíly podle různých podmínek, které jsme hodnotili. Proteomické profilování fetálního sekretomu hAFS odhalilo rozeznatelné rozdělení faktorů založené na gestačním stadiu a hypoxickém předkondicionování buněk. To ukazuje, že hAFS parakrinní potenciál může získat zřetelnou identitu během zrání od Ⅱ do Ⅲ trimestru gestace, která může být zase modulována stimulací sekrečních buněk in vitro. Analýza obohacení biologických procesů hAFS-CM a hAFS-EV naznačila, že většina modulovaných proteinů se může shodovat s buněčným růstem/udržováním a metabolismem proteinů, čímž podporuje prospěšné buněčné parakrinní účinky, které byly dosud uváděny. Konkrétně bylo zjištěno, že hypoxický fetální totální sekretom hAFS je obohacen o protein tepelného šoku HSPD1 (HSP60), u kterého bylo prokázáno, že podporuje hojení ran v modelu poranění kůže u diabetických myší a podporuje zkreslení makrofágů do fenotypu M2 [61]. . Podobně byly hypoxické fetální hAFS-EV obohaceny o faktory podporující neurogenezi (HSPG2[62], sebeobnovu buněk a vývoj mozku a kardiovaskulárního systému (LAMA5[63]a LAMB1[64]a migraci (THBS1 [2]). Proteoglykan AGRN byl také nalezen v EV po hypoxickém primingu fetálního hAFS.cistanche dávkování redditNaše zjištění jsou v souladu s předchozími důkazy o upregulaci AGRN v proteomu mezenchymálních stromálních buněk při zánětlivých a hypoxických instruktivních stimulech[65]. Bylo také prokázáno, že AGRN se podílí na signalizaci imunitních synapsí [66] a shoduje se s regenerací srdce neonatálních myší [67], čímž podporuje výraznou predispozici vývojově mladého fetálního hAFS k regeneračním parakrinním účinkům. Navíc bylo potvrzeno, že fetální hAFS citlivěji reaguje na hypoxické předkondicionování, jak ukazuje obohacení prediktorů vaskulární regenerační účinnosti, jako je ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 a MCP-1 cytokin[68]. jejich podmíněné médium. To podporuje předchozí důkazy o parakrinní síle fetálního hAFS-CM při posilování endogenní neoarteriogeneze v preklinických modelech hlodavců infarktu myokardu, ischemie zadní končetiny a ischemického fasciokutánního laloku [34,{10}}]Kromě toho fetální hAFS totální sekretom byl nalezen významně více obohacený o IGFBP2 a OPN ve srovnání s perinatálním, což naznačuje výraznější modulační profil podporující rozlišení a proti stárnutí[72-75]. Perinatální MKM, i když byla méně zesílena v parakrinních faktorech, byla podobně doplněna neurotrofickými a imunomodulačními faktory, jako jsou CST3[76,77] a MIF[78].
Ve srovnání s celkovým hAFS-CM vykazovaly odpovídající hypoxické fetální a perinatální EV protějšky nižší expresi cytokinů a chemokinů, s výjimkou mediátoru vaskulární remodelace EMMPRIN [79], který byl většinou obohacen v kompartmentu vezikul. Dříve uváděný kardioaktivní a proregenerační profil fetálních hAFS-EVs[34,37] zde byl potvrzen důkazem jejich výlučné exprese kardioprotektivního IL-8 [80] a GDF-15, klíčový parakrinní faktor spouštějící endogenní hipokampální neurogenezi dospělých [81,82] a také působící proti antracykliny indukované kardiotoxicitě [78]. Fetální i perinatální hAFS-EV vykazovaly podobnou expresi pro progenitor/regulátor obchodování s kmenovými buňkami SDF-1 [83-85]. Proteomická analýza zaznamenala zvýšenou expresi proteinů souvisejících s angiogenezí, jako je NRP1 [86] a MP14[87] v hypoxických perinatálních hAFS-EV; takový stimulační profil může vysvětlit předchozí výsledky endoteliálních regeneračních vlastností hAFS ve Ⅲ trimestru na preklinickém myším modelu ischemického poškození kosterního svalstva [25], navzdory důkazům, že jejich hAFS-CM je méně proangiogenní než odpovídající fetální. Nervový růstový faktor BDNF byl nalezen ve fetálním i perinatálním EV nákladu, i když v malých množstvích, což naznačuje domnělou neurotrofickou aktivitu pro hAFS-EV v neuronálním přežití a neurovývojových procesech, jak bylo také pozorováno u extracelulárních vezikul vylučovaných lidskou kostí. dřeně a pupečníkové krve-MSC[8889]. Ukázalo se, že obě sekretomové formulace z fetálního a perinatálního hAFS podstupující hypoxickou stimulaci jsou obohaceny o PAI-1, facilitátor endoteliální aktivace [90], který se také účastní polarizace M2 makrofágů v srdci a je vybaven kardioprotektivy a antifibrotický potenciál [91].
MikroRNA (miRNA) jsou široce považovány za klíčové regulátory parakrinní aktivity kmenových buněk a mezenchymálních stromálních buněk EV [92,93]. Zde jsme zjistili, že 15 nejvíce obohacených druhů miRNA v rámci hAFS-EV pokrývá více než 60 procent celkového obsahu miRNA v každém vzorku. Bylo popsáno, že tyto miRNA charakterizují molekulární náklad mezenchymálních stromálních buněk-EV (buď-7a-5p [4,95]), chrání před ischemií myokardu ovlivněním vaskulární regenerace a inhibicí fibrózy (let -7b-5p, let-7f-5p, miR-21-5p a miR-155-5p [96,97]), propagovat hojení ran regulací funkce keratinocytů (miR-16-5p [98]) a působí proti smrti neuronů po ischemii předního mozku (miR-29a-3p [99,100]). Na druhou stranu bylo ve zbývajících 30 procentech obsahu vezikulárních miRNA nalezeno asi 1000 miRNA. Taková nevyvážená distribuce je v souladu s předchozími studiemi [4] a zdůrazňuje většinou obohacené miRNA jako domnělé odpovědné za hlavní biologickou aktivitu hAFS-EV. Je zajímavé, že fetální a perinatální hAFS-EV sdílely většinu 15 miRNA. Je třeba poznamenat, že jsme také pozorovali, že jak fetální hAFS-EV, tak perinatální obsahovaly sadu velmi stabilních miRNA napříč různými úrovněmi obohacení. Takové důkazy mohou naznačovat širokou škálu "hospodářských" kandidátů, které mají být použity jako interní referenční kontrola v experimentech qPCR na hAFS-EV. Navíc konzistentní podmnožina takových stabilních miRNA (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) je sdílen mezi dvěma gestačními stádii a překrývá se s 15 většinou obohacenými, což naznačuje ještě konstantnější chování a spolehlivý molekulární podpis před rozlišením ([96,{45 }}]). Je třeba poznamenat, že několik kandidátů v rámci takového výrazného jádra bylo nedávno hlášeno jako referenční miRNA v neuroprotektivních EV získaných z mezenchymálních stromálních buněk získaných z plodové vody II. trimestru (miR-29}a-3p a miR{{ 49}}s [95]). Nicméně jsme si také všimli, že gestační věk může modulovat náklad miRNA více než hypoxické předkondicionování. Vývojově více juvenilních EV získaných z fetálního hAFS ve III. trimestru bylo obohaceno miRNA, u kterých bylo dříve prokázáno, že podporují životaschopnost embryonálních kmenových buněk (miR-302-3p [101]), buněčnou proliferaci a osteogenní diferenciaci stromálních buněk kostní dřeně (miR -217 [102]), přičemž také obsahuje nádorový supresorový potenciál (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).
Na základě našich výsledků zde potvrzujeme, že fetální a perinatální hAFS může představovat atraktivní parakrinní zdroje využitelné pro regenerativní medicínu. Zatímco jejich fenotyp a sekreční aktivita byly podobné, zdůraznili jsme některé zvláštní aspekty v jejich sekretomových formulacích jako užitečné poznatky pro jejich budoucí terapeutickou translaci.
4. Materiály a metody
4.1. Izolace kmenových buněk z lidské amniotické tekutiny a kultivace in vitro
Lidské kmenové buňky plodové vody (hAFS) byly izolovány ze zbylých vzorků plodové vody (AF) odebraných rutinním prenatálním screeningem prostřednictvím amniocentézy ve Ⅱ trimestru (fetální hAFS, f-hAFS) nebo jako klinický odpad během plánovaného porodu císařským řezem během Ⅲ trimestru (perinatální hAFS,p-hAFS) na jednotce prenatální diagnostiky a perinatální medicíny, nemocnice IRCCS San Martino, na fetální a perinatální lékařské a chirurgické jednotce a laboratoři lidské genetiky v nemocnici IRCCS Istituto Gaslini (Genova, Itálie). Od všech dárců byl získán informovaný písemný souhlas v souladu s povolením místní etické komise (protokol PR428REG2015) a v souladu s pokyny Helsinské deklarace. Vzorky fetální AF v II. trimestru byly získány od dárců s průměrným věkem přibližně 37,42±0,32 let (n=15 v rozmezí od 36-do 41 let);Ⅲ vzorky perinatální AF v trimestru byly získány od dárkyně s průměrným věkem 34,25±1,31 let (n=10 v rozmezí od 26- do 42 let). Fetální a perinatální hAFS byly získány ze vzorků validovaných pro normální karyotyp a izolovány imunomagnetickým tříděním pro expresi c-KIT (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Itálie) z adherentních AF mezenchymálních stromálních buněk[16].výhody extraktu z cistanchec-KIT* hAFS byly kultivovány v minimálním základním médiu (MEM)-alfa s 15 procenty FBS (fetální bovinní sérum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itálie), 18 procenty Chang B a 2 procenty média Chang C (Irvine Scientific , Santa Ana, CA, USA) s 1 procentem L-glutaminu a 1 procentem penicilinu/streptomycinu (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itálie), v inkubátoru při 37 stupních s 5 procenty CO2 a 20 procenty Oz atmosféry a kultivované až 5 pasáží in vitro před použitím k izolaci jejich sekretomu.
4.2. Biochemické hodnocení metabolismu hAFS
Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) buňky byly použity pro každý experiment. K vyhodnocení bazální respirace byly hAFS permeabilizovány 0,03 mg/ml digitoninu po dobu 10 minut a suspendovány ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem (PBS). Ke stimulaci dráhy bylo přidáno 10 mM pyruvát plus 5 mM malát nebo 20 mM sukcinát -cesty složené z komplexů I, II a IV nebo komplexů Ⅱ a IV [60].
Za účelem vyhodnocení relativních příspěvků k respiraci glutaminu, oxidaci mastných kyselin s dlouhým řetězcem a glukóze byly buňky po permeabilizaci digitoninu suspendovány v růstovém médiu a 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir a 4 uM UK5{{22} }99 byly přidány k inhibici glutaminázy, karnitin palmitoyl-transferázy 1A (CPT1A), respektive mitochondriálního pyruvátového nosiče (MPC). Aktivita Fi-F.ATP syntázy (ATP syntázy) byla detekována měřením produkce ATP vysoce citlivou luciferin/luciferázovou metodou. Testy byly prováděny při 37 stupních po dobu 2 minut a data byla sbírána každé 30 s. V první sadě experimentů byly buňky 10 stupně inkubovány po dobu 10 minuty v médiu obsahujícím 50mM KCl, 1mMEGTA,2mMEDTA,5mMKH2PO4,2mMMgC12,0,6mMouabain,1mM P1P5-Di (adenosin-5')penta-fosfát, 0,040 mg/ml ampicilinu a 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Poté byla indukována syntéza ATP přidáním respiračních substrátů (10 mM pyruvát plus 5 mM malát nebo 20 mM sukcinát) a 0,1 mM ADP. Reakce byla měřena pomocí luciferin/luciferázové ATP bioluminiscenční testovací soupravy CLSII (Roche, Basel, Švýcarsko) v luminometru (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milán, Itálie) standardních roztocích ATP (Roche, Basilej, Švýcarsko) v rozmezí {{ 42}}/M byly použity pro kalibraci. Ve druhé sadě experimentů byla syntéza ATP hodnocena v přítomnosti 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxiru nebo 4 uM UK5099. V tomto případě bylo 10 buněk inkubováno po dobu 10 minut v růstovém médiu v nepřítomnosti nebo přítomnosti inhibitor metabolismu a syntéza ATP byla indukována 0,1 mM ADP. Účinnost OxPhos (oxidační fosforylace) (P/O poměr) byla vypočtena jako poměr mezi koncentrací produkovaného ATP a množstvím spotřebovaného kyslíku v přítomnosti respiračního substrátu a ADP. Když je spotřeba kyslíku zcela věnována výrobě energie, poměr P/O by měl být přibližně 2,5 a 1,5 po přidání pyruvátu plus malátu nebo sukcinátu [48] Pro hodnocení příspěvku anaerobní glykolýzy k metabolismu hAFS byly hodnoceny koncentrace glukózy a laktátu. v růstovém médiu. Spotřeba glukózy byla hodnocena hexokinázovým (HK) a glukózo-6-fosfátdehydrogenázovým (G6PD) vazebným systémem po redukci NADP při 340 nm. Testovací médium obsahovalo 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12, 2 IU hexokinázy a 2 IU glukóza-6-fosfátdehydrogenázy. Uvolňování laktátu bylo testováno po snížení NAD plus při 340 nm. Testovací médium obsahovalo 100 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM NAD plus a 1 IU/ml laktátdehydrogenázy. Vzorky byly analyzovány před a po přidání 4 ug purifikované laktátdehydrogenázy. V obou případech byla data normalizována na počet buněk a vyjádřena jako mM glukózy/10 stupňů buněk nebo mM uvolněného laktátu/10 stupňů buněk, v daném pořadí [107].
4.3. Průtoková cytometrie Charakterizace hAFS
Sto tisíc (105) fetálních-a p-hAFS buněk bylo odděleno a inkubováno s myší anti-lidský-CD107a-Alexa Fluor 647-a anti-lidským CD146-FITC- konjugované protilátky (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Itálie). Buněčná apoptóza byla hodnocena pomocí FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Itálie) podle pokynů výrobce. Události byly získány na třídiči a analyzátoru BD Bioscience FACS Aria II vybaveném softwarem FACS Diva (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milán, Itálie). Data byla analyzována pomocí softwaru FlowJo V9.0 (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milán). , Itálie). 4.4. Barvení senescence
Senescence fenotyp hAFS kultivovaný až do pasáže 5 ve standardních podmínkách in vitro byl hodnocen pomocí Senescence-Galactosidase Stained Kit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA): p-hAFS byly fixovány 1x Fixačním roztokem na 70 procent konfluence a obarveny na SA- -gal při 37 stupních přes noc, podle pokynů výrobce. Senescentní události byly získány na mikroskopu Leica DMil (vybaveném softwarem Leica Acquire V3.4.4, Leica Microsystems, Milán, Itálie) a vyhodnoceny jako procento SA- -gal-pozitivních buněk z celkového počtu buněk na pole.
4.5. Separace a koncentrace frakcí sekretomu hAFS
f-hAFS a p-hAFS byly kultivovány po dobu 24 hodin v bezsérovém médiu (SF) v 1% O2 hypoxii versus 20% O2 normoxii (kontrola), druhá z nich byla použita jako základní referenční hodnota. Tato strategie předkondicionování byla použita ke zvýšení uvolňování bioaktivních parakrinních faktorů, jak jsme již dříve uvedli [34,35,37,49]. hAFS byly kultivovány po dobu 24 hodin v médiu bez séra (SF) (vysokoglukózové Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium, DMEM, s 1 procentem L-glutaminu a 1 procentem penicilinu/streptomycinu, vše od Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itálie), za normoxic (20 procent O2 a 5 procent CO2 při 37 stupních) nebo hypoxické (1 procento O2 a 5 procent CO2 při 37 stupních v CO2 inkubátorech CellXpert C170i a Galaxy 48R z Eppendorfu, Milán, Itálie).
f-hAFS-CM a p-hAFS-CM byly shromážděny a centrifugovány při 4 stupních při 300x g po dobu 10 minut a 2000xg po dobu 20 minut, aby se odstranily buněčné zbytky; hAFS-CM byl koncentrován pomocí ultrafiltračních membrán se selektivním limitem 3 kDa (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Německo) při 4 stupních při 3000× g po dobu 90 minut a poté dále koncentrován při 4 stupně při 3000× g po dobu 30 min. hAFS-EV byly odděleny a koncentrovány sériovou ultracentrifugací z hAFS-CM. Stručně, hAFS-CM byl shromážděn a centrifugován při 4 stupních při 300 x g po dobu 10 minut a 2000 x g po dobu 20 minut, aby se odstranily zbytky buněk. Supernatant byl poté zpracován při 10 000 x g po dobu 40 minut. Peleta byla odstraněna a supernatant byl dále zpracován ultracentrifugací v Optima L-90}K (Beckmann Coulter, Milán, Itálie) při 10 000 x g po dobu 120 minut za použití otočných rotorů odstředivky Beckman Coulter SW55Ti. Peleta obsahující heterogenní hAFS-EVs byla promyta v PBS s konečnou centrifugací při 100 000 x g po dobu 120 minut a poté resuspendována v PBS filtrována s 0,22 um póry filtrační membrány. Koncentrace proteinu v hAFS-CM a na povrchu hAFS-EVs byly měřeny pomocí testu s kyselinou cinchonovou (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itálie). Vzorky byly získány na Gen5 Microplate Reader při 570 nm pro vyhodnocení výtěžku hAFS-CM a hAFS-EVs ve smyslu ug roztoku/10 stupňů produkujících buněk.
4.6. Charakterizace hAFS-EV pomocí transmisní elektronové mikroskopie a analýzy sledování nanočástic
Analýza transmisní elektronovou mikroskopií (TEM) byla provedena na mikroskopu Hitachi TEM (série HT7800, Hitachi High Technologies, Monza, Itálie). Digitální snímky byly pořízeny kamerou Mega view 3 a softwarem Radius (EMSIS, Muenster, Německo). f-hAFS a p-hAFS byly fixovány v 3,7% roztoku paraformaldehydu (PA) zředěném 1:1 kompletním médiem hAFS, promyty v 0,1 M kakodylátovém pufru a poté okamžitě inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti v 0,1 M kakodylátový pufr obsahující 2,5 procenta glutaraldehydu (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA). Buněčné pelety byly dodatečně fixovány v oxidu osmičelém po dobu 1 hodiny a v 1% roztoku uranylacetátu po dobu 1 hodiny. Vzorky byly dehydratovány po dobu 24 hodin při 42 stupních a 48 h při 60 stupních pomocí odstupňovaného ethanolu a zalité do epoxidové pryskyřice (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Německo). Ultratenké řezy (50 nm) byly nařezány mikrotomem Leica Ultracut (Leica Microsystems, Milán, Itálie) a kontrastně obarveny 5% uranylacetátem v 50% roztoku ethanolu. f-hAFS-EV a p-hAFS-EV byly resuspendovány ve 20 ul roztoku PBS a fixovány přidáním stejného objemu 2% paraformaldehydu v 0,1 M roztoku fosfátového pufru (pH 7,4). EV byly poté adsorbovány po dobu 10 minut na měděné mřížky potažené formvarem a uhlíkem tak, že se mřížky vznášely na 5 μl kapkách na parafilmu. Následně byly mřížky s přilnutými EV opláchnuty v PBS a negativně barveny 2% roztokem uranylacetátu po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Obarvené mřížky byly zality do 2,5 procenta methylcelulózy pro lepší konzervaci a před vyšetřením vysušeny na vzduchu. Morfometrická analýza hAFS-EVs byla měřena na 10 náhodně pořízených mikrosnímcích při 40000× g zvětšení. Velikost byla vypočítána pomocí libovolné čárové funkce zabudované v dialogovém okně měření softwaru Radius (EMSIS, Muenster Německo). Pro vizualizaci distribuce velikosti hAFS-EVs byly výsledky vyneseny jako bodový graf a jako distribuce frekvence, ve které je každá velikost reprezentována jako bod spolu s čarami pro střední hodnotu a rozsah.
f-hAFS-EV a p-hAFS-EV byly také analyzovány analýzou sledování nanočástic (NTA), aby se vyhodnotily částice uvolněné 10stupňovými buňkami. hAFS-EV byly zředěny 1:100 v roztoku PBS a získány na NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, UK), který zaznamenal alespoň 3 různé snímky po 60 s. Tři různé akvizice každého vzorku byly analyzovány pomocí možnosti Batch Process v softwaru. 4.7. LC-MS/MS Analýza hAFS-CM a hAFS-EVs 4.7.1. Digesce v roztoku
Proteomická analýza byla provedena na 3 biologických replikátech hAFS-CM a hAFS. EV z f-hAFS a p-hAFS po normoxické nebo hypoxické předběžné úpravě (n=24 různých podmínek). Vzorky hAFS-CM a hAFS-EVs byly suspendovány v 0.1M NHCO3 pH 7,9 a ošetřeny RapigestIM SF činidlo (Waters Co, Milford, MA, USA) v konečné koncentraci 0,25 procent (w/v). Výsledné suspenze byly inkubovány za míchání při 100 stupni po dobu 2{{40}} min. Štěpení bylo provedeno u každého vzorku přidáním sekvenačního stupně modifikovaného trypsinu (Promega Inc, Madison, WI, USA) v poměru enzym/substrát 1:50 (hmotn./hmotn.) přes noc při 37 stupních v 0,1 M NH4HC03 pH 7,9. ráno byl přidán další alikvot trypsinu (1:100 w/w) a štěpení pokračovalo po dobu 4 hodin. Navíc přidání 0,5 procenta kyseliny trifluoroctové (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA) zastavilo enzymatickou reakci a následná inkubace při 37 stupních po dobu 45 minut dokončila hydrolýzu kyseliny RapiGest[108]. Produkty degradace nemísitelné s vodou byly odstraněny centrifugací při 13{37}} otáčkách za minutu po dobu 10 minut. Nakonec byly tryptické natrávené směsi odsoleny pomocí kolon PierceTM C-18 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itálie) podle protokolu výrobce a byly resuspendovány v 0,1% kyselině mravenčí (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) ve vodě (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, USA) při koncentraci 0,1 ug/μl.
4.7.2.Kapalinová chromatografie
Směsi štěpené trypsinem byly analyzovány pomocí platformy sestávající z nano-kapalinového chromatografického systému Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D System (Eksigent, součást AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, USA) nakonfigurovaného v režimu past-elute, ve spojení s hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením. Stručně řečeno, vzorky (0.8 ug vstříknuty) byly nejprve naneseny na lapač peptidů (200 um × 500 um ChromXP C18- CL,3 um,120 A) a promývá se plnicím čerpadlem běžícím v izokratickém režimu 0,1% kyselinou mravenčí ve vodě po dobu 10 minut při průtoku 3 μl/min. Automatické přepínání deseticestného ventilu pak eluovalo zachycenou směs na koloně s nanoreverzní fází (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL,3 um,120 A) přes 150minutový gradient eluentu B (eluent A, 0,1 procenta kyseliny mravenčí ve vodě; eluent B, 0,1 procenta kyseliny mravenčí v acetonitrilu) při průtoku 300 nL/min. V hloubce byl gradient: od 5-10 procent Bin 3 min,10-40 procent Bin 130 min, 40-95 procent Bin 10 min a držení na 95 procentech B po dobu 7 min. 4.7.3.Hmotová spektrometrie
MS/MS analýzy byly provedeny na hmotnostním spektrometru LTQ-OrbitrapXL (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itálie) vybaveném nanosprejovým iontovým zdrojem. Napětí rozprašovací kapiláry bylo nastaveno na 1,7 kV a teplota kapiláry pro přenos iontů byla udržována na 220 stupni. Úplná MS spektra byla zaznamenána v rozsahu 400-1600 m/z v režimu kladných iontů, s rozlišovací schopností 60 000 (plná šířka v polovině maxima) a rychlostí skenování 2 spektra/s. Po tomto kroku následovalo pět MS/MS událostí s nízkým rozlišením, které byly sekvenčně generovány způsobem závislým na datech na pěti nejlepších iontech vybraných z celého spektra MS (při 35% energii kolize), s použitím dynamického vyloučení 0,5 min. MS/MS analýza. Skenovací funkce hmotnostního spektrometru a gradienty rozpouštědel pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii byly řízeny datovým systémem Xcalibur verze 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itálie).
4.7.4.Proteomické zpracování dat a dolování dat
Všechna vygenerovaná data byla prohledávána pomocí vyhledávače Sequest HT obsaženého v softwaru Thermo Scientific Proteome Discoverer, verze 2.1. Experimentální MS/MS spektra byla korelována se sekvencemi tryptického peptidu srovnáním s teoretickými hmotnostními spektry získanými in silico digescí databáze proteomů Uniprot Homo Sapiens (746 00 záznamů), stažených 2. ledna 020 (www.uniprot.org, přístup 10 2. března021). Pro identifikaci peptidových sekvencí a příbuzných proteinů byla použita následující kritéria: trypsin jako enzym, tři chybějící štěpení na peptid, hmotnostní tolerance ±50 ppm pro prekurzorové ionty a ±0,8 Da pro ionty fragmentu. Uzel perkolátoru byl použit se strategií target-decoy, aby se dosáhlo konečné míry falešného objevu (FDR) na úrovni Peptide Spectrum Match (PSM) 0,01 (striktní) na základě q-hodnot, s ohledem na maximální deltaCN 0,05 [109]. Byly uvažovány pouze peptidy s minimální délkou peptidu šesti aminokyselin a rank1. Bylo uplatněno seskupování proteinů a přísné zásady šetrnosti. Data MS byla uložena do konsorcia ProteomeXchange Consortium prostřednictvím partnerského úložiště PRIDE [10] (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, přístup 10. března 2021) 48 proteinů získaných z algoritmu SEQUEST bylo srovnáno, normalizováno a srovnání bez štítků. K tomuto účelu byl použit vlastní algoritmus, jmenovitě Multidimenzionální Algorithm Protein Map (MAProMa), využívající shody průměrného peptidového spektra (aPSM) [111,112], které odpovídají průměru všech spekter identifikovaných pro protein a následně na jeho relativní množství v každém analyzovaném stavu. Aby se vybraly odlišně exprimované proteiny, byly hloubkově porovnány podskupiny (pro fetální vs perinatální-hAFS-CM a hAFS-EVs, s ohledem také na předkondicionační stimulaci hypoxických buněk) pomocí prahu 0,4 a 5 na dvou MAProMa indexy DAve (Differential Average) a DCI (Differential Confidence Index). DAve, která hodnotí změny v expresi proteinu, byla definována jako (XY)/(X＋Y)/0,5, zatímco DCI, která hodnotí spolehlivost diferenciální exprese, byla definována jako (X plus Y)×(XY)/2 X a Y termíny představují PSM daného proteinu ve dvou porovnávaných vzorcích. Kromě toho byly průměrné seznamy proteinů, získané z každého zkoumaného stavu, podrobeny lineární diskriminační analýze (LDA) a proteiny s největším poměrem F (větší než nebo rovný 4,5) a nejmenší p-hodnotou (menší nebo rovnou 0,001) byly zachovány a zpracovány hierarchickým shlukováním za použití Wardovy metody a euklidovské vzdálenosti pomocí softwaru JMP 15.2. Konkrétně poměr F představoval modelovou střední kvadratici dělenou střední kvadrátem chyby, zatímco p-hodnota indikovala pravděpodobnost získání hodnoty F větší, než je vypočtená, pokud ve skutečnosti neexistuje žádný rozdíl mezi průměry skupiny populace. 4.8. Cytokin a chemokin Profilování hAFS-CM a have-EV
Cytokinové a chemokinové profilování hAFS-CM a have-EVs získaných pomocí f-hAFS a p-hAFS po hypoxické předkondicionaci bylo hodnoceno pomocí soupravy Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array kit (R&D System, Minneapolis, MN, USA) podle pokyny výrobce. Bylo použito dvacet ug vzorků hAFS-CM a hAFS-EVs. Snímky membrán byly pořízeny přístrojem Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, UK) Specifický obsah cytokinů/chemokinů byl vyhodnocen kvantifikací pozitivní intenzity pixelů (pomocí libovolné jednotky) pro každý detekovatelný cytokin pomocí softwaru ImageJ (dostupný na https: //imagej.nih.gov/ij/,přístup 10. března 2021 [13]). 4.9. Extrakce RNA z hAFS-EV a další
Generační sekvenování
RNA byla izolována z f-hAFS-EV a p-have-EV pomocí miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Milán, Itálie) podle pokynů výrobce. Integrita a distribuce velikosti RNA byly hodnoceny pomocí sady Agilent Small RNA Kit s malým nekódujícím RNA čipem, aby se vyhodnotil obsah malých RNA v rozsahu od 6 do 150 nukleotidů (nt). Ke kvantifikaci obsahu mikroRNA (miRNA) byla použita souprava Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itálie) podle pokynů výrobce. Knihovny pro sekvenování miRNA byly připraveny a amplifikovány pomocí sady QIAseq miRNA Library (Qiagen, Milán, Itálie) s použitím 18,5 ng izolovaných miRNA jako vstupu a podle pokynů výrobce. Knihovny byly sloučeny po kontrole kvality a kvantifikace pomocí TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, CA, USA) byla provedena pomocí Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Sdružené knihovny byly posouzeny z hlediska kontroly kvality pomocí qPCR v reálném čase podle průvodce "Sekvenační knihovna qPCR Quantification" (Illumina Inc, San Diego, CA, USA) a sekvenovány platformou Illumina NextSeq pomocí High Output Hit v2.5 (75 cyklů) ( Illumina Inc, San Diego, CA, USA). Základní volání bylo provedeno s výchozím pracovním postupem Illumina NextSeq500.
4.10.Bioinformatická analýza dat sekvenování miRNA
Soubory Fastq byly nejprve zpracovány oříznutím 3' adaptéru a nekvalitních základen pomocí Cutadapt [114]. Po oříznutí byly identifikovány inzertní sekvence a UMI sekvence. Čtení bez sekvence adaptéru, čtení s méně než 16 bp inzertovými sekvencemi a čtení s méně než 10 bp UMI sekvencemi byly vyřazeny. Pro anotaci inzertových sekvencí byla čtení porovnána se sestavou lidského genomu GRCh38 pomocí Bowtie [15] Pro každý vzorek byla spočítána všechna čtení přiřazená konkrétní miRNA a související UMI byly agregovány, aby se spočítaly jedinečné molekuly. Sekundární analýza byla provedena pomocí vlastních R skriptů dostupných na rozumné vyžádání. Analýza rozdílového obohacení byla provedena pomocí balíčků Limma [116] a EdgeR Bioconductor [117].
4.11. Statistické analýzy
Výsledky jsou prezentovány jako průměr ± sem z alespoň tří (n{{0}}) nezávislých experimentů. Srovnání byla provedena jednocestnou ANOVA následovanou posthoc Tukeyho testem vícenásobného srovnání nebo Studentovým t-testem. Analýzy byly provedeny pomocí Graph-Pad Prism verze 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, přístupný 10. března 2021) se statistickou významností nastavenou na* p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">
Závěrem lze říci, že fetální a perinatální hAFS byly shledány fenotypicky ekvivalentními se srovnatelnou sekreční potencí a obohacením EV ve velikosti a distribuci; přesto lze ocenit určité rozdíly v jejich sekretomovém profilu. Konkrétně, vývojově nezralý profil fetálního hAFS může být rekapitulován jejich sekretomovými formulacemi vybavenými výraznějším pro-vaskulogenním, proregenerativním a omlazujícím sekretomem. Perinatální hAFS si však stále zachovává relevantní parakrinní profil prostřednictvím exprese faktorů souvisejících s migrací endoteliálních buněk, imunomodulačním, protizánětlivým a neurotrofickým potenciálem podobným fetálnímu hAFS. Tato zjištění mohou poskytnout užitečné poznatky podporující budoucí parakrinní terapii zranění souvisejících a zánětlivých/ischemických onemocnění. Výběr fetálního nebo perinatálního hAFS jako nejideálnějšího buněčného zdroje by proto měl být vyhodnocen s ohledem na konkrétní klinický scénář.
Tento článek je převzat z Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms
