Ochranné účinky odvaru New Wenshen Shengjing na narušení syntézy testosteronu a spermatogenní apoptózu vyvolané cyklosporinem
Mar 03, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
XIAOYAN PAN, XIYAN WANG, XUENAN WANG, WANSHENG ZHANG4, ZHANXUAN SUN1, XUAN XUAN LIANG, XUE ZHANG, WENJUN LI a ZHIXIN LI
Abstraktní
Cílem této studie bylo prozkoumat potenciální ochranné účinky nového odvaru Wenshen Shengjing (nové WSSJD; včetně Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum a Angelica Sinensis) o cyklosporinem indukovaném poškození syntézy testosteronu a spermatogenní apoptóze u myší. Celkem 90 dospělých samců myší Kunming bylo rozděleno do následujících 6 skupin: kontrola (bez zásahu), dimethylsulfoxid (DMSO; dostával pouze DMSO), cyklosporin A (CSA), klomifen citrát (CC; CsA plus CC, 15 mg/kg /den), WSSJD (CsA plus WSSJD, surová droga 12 g/kg/den) a nová WSSJD (CsA plus nová WSSJD, surová droga 12 g/kg/den). Všechny myši byly léčeny po dobu 30 dnů orální sondou. Varlata byla následně fixována a obarvena hematoxylinem a eosinem, aby se vyhodnotil vývoj semenotvorného epitelu. Imunohistochemické techniky byly použity k detekci exprese receptoru luteinizačního hormonu (LHR) a štěpení postranního řetězce P450 (P450scc) v testikulárních Leydigových buňkách. Kromě toho byla detekována apoptóza spermatogenních buněk ve varlatech pomocí terminálního deoxynukleotidyltransferázou zprostředkovaného testu dUTP nick-end značení a průtoková cytometrie byla použita k analýze míry přežití a časné apoptózy spermií v nadvarleti. Ve srovnání se skupinami CsA a CC nové podávání WSSJD významně zvýšilo hladiny sérového testosteronu a exprese LHR a P450scc v testikulárních Leydigových buňkách (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">
Úvod
Cyklosporin A (CSA) je běžně používané imunosupresivní činidlo, které se specificky zaměřuje na T buňky a inhibuje sekreci interleukinu-2 a dramaticky zvyšuje úspěšnost transplantací jater, ledvin a rohovky a také míru přežití příjemci (1-3). Imunosuprese navozená dlouhodobým užíváním CsA však významně zvyšuje riziko kardiovaskulárních onemocnění, infekcí a maligních nádorů (4). Eid et al (5) uvedli, že koncentrace a motilita spermií negativně korelovaly s koncentrací sérového CsA u příjemců transplantátu ledviny, což naznačuje, že CsA může vyvolat dysfunkci reprodukčního systému u příjemců mužského pohlaví. Dále bylo zdokumentováno, že CsA může být odpovědný za zhoršenou spermatogenezi a poškození mužského reprodukčního systému (6).
Předchozí studie prokázaly, že CsA snižuje hladiny sérového testosteronu ovlivněním biosyntézy testosteronu a sekrece ve varlatech. He et al (7) pozorovali, že krysy léčené 40 mg/kg/den CsA vykazovaly významně vyšší hladiny luteinizačního hormonu (LH) a významně nižší hladiny testosteronu v séru, což vedlo k poškození vývoje varlat. Ali et al (8) uvedli, že léčba CsA snížila expresi LH receptoru (LHR) na membráně Leydigových buněk, což následně snížilo LH-zprostředkovanou syntézu testosteronu a sekreci z Leydigových buněk. Jiná studie Seethalakshmiho et al (9) uvádí, že CsA snížil hladinu testosteronu tím, že během biosyntézy testosteronu kompetitivně inhiboval aktivitu 17-alfa-hydroxylázy a kompetitivně aktivitu 17 -hydroxysteroiddehydrogenázy a primárním místem inhibice CsA byl přerušený cyklický adenosin monofosfátová stimulace. Dále tato zpráva ukázala, že snížená sekrece testosteronu vyvolaná CsA v Leydigových buňkách přímo ovlivnila vývoj mužského reprodukčního systému a udržení reprodukční schopnosti. Seethalakshmi et al (10) injikovali exogenní testosteron krysám ošetřeným CsA, aby zvýšili endogenní hladiny testosteronu. Bylo pozorováno, že zvýšené dávky exogenního testosteronu významně obnovily hmotnost reprodukčního orgánu, sérové hladiny folikuly stimulujícího hormonu (FSH) a zvýšily počet zárodečných buněk, což naznačuje, že CsA-indukovanému poškození spermatogeneze lze částečně zabránit exogenními podávání testosteronu (10). Bylo však zjištěno, že exogenní testosteron je nedostatečný při opravě poškozené testikulární tkáně, protože sekrece testosteronu a spermatogeneze byly stále ovlivněny CsA a vysoká míra apoptózy byla pozorována u spermií a spermatogenních buněk (10).
Wenshen Shengjing Decoction (WSSJD) se skládá z 15 rostlinných léků, především včetně Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicorneum a Angelica Sinensis (11). Bylo prokázáno, že WSSJD zmírňuje spermatogenní apoptózu indukovanou cyklofosfamidem (11). Pro další zlepšení terapeutického účinku WSSJD tato studie vyvinula nový WSSJD založený na mechanismu poškození testikulární tkáně vyvolané CsA úpravou dávkování složek WSSJD. Moderní farmakologické studie prokázaly, že aksamitník u WSSJD může fungovat jako pohlavní hormon (12); Radix Astragali může zlepšit proliferaci a zásobení testikulárními Sertoliho buňkami živinami (13) a Panax ginseng může snížit hladiny testikulárního hyperoxidu a inhibovat spermatogenní apoptózu (14). Výše uvedené léky mohou také zvýšit funkci ledvin a podpořit vývoj spermatogenních buněk (12-14). V předchozích klinických studiích bylo prokázáno, že klomifen citrát (CC) má terapeutický účinek na mužskou neplodnost (15,16). Kromě toho je CC spojován se zlepšenými parametry testosteronu a spermatu a ochranné mechanismy CC mohou být podobné jako u WSSJD (15,16). Navíc ve studii Wanga et al (17) byl CC použit jako kontrola léčby ke zkoumání účinku čínské medicíny Shengjing na poruchy spermatogeneze u myší. Na základě toho byl CC v této studii použit jako pozitivní kontrola.
V této studii byl zkoumán mechanismus, který je základem ochranného účinku nového WSSJD v testikulárních tkáních, aby se stanovila terapeutická účinnost modifikovaného léku. Objasnění ochranného mechanismu může poskytnout základ pro použití nového WSSJD při zmírnění CsA-indukovaného spermatogenního poškození.
Účinky Cistanche deserticola: Preventivníspermatogenní poškození
Materiály a metody
Zvířata. Celkem 90 samců myší Kunming (8-týdnů starých; 35-40 g) poskytl Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd. (Changchun, Čína). Tato studie byla provedena se souhlasem Etického výboru Lékařské univerzity Jilin (Changchun, Čína). Myši byly chovány při 21 ± 3 °C a 55-65 procentech relativní vlhkosti v 12hodinovém cyklu tmavého světla. Myším byl poskytnut volný přístup ke standardní laboratorní myší stravě a sterilní vodě.
Příprava WSSJD. 15 složek čínské medicíny WSSJD, včetně Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum a Angelica Sinensis (11), byly zakoupeny od Tongrentang (Peking, Čína). Tyto materiály byly odvarovány podle tradiční metody čínského léčivého odvaru (18). Stručně řečeno, ingredience byly odváženy podle receptury a bylo přidáno celkem 250 ml destilované vody, aby byly bylinky ponořeny. Byliny byly namočené po dobu 30 minut a následně zahřáté. Bylinky se nejprve 10 minut povařily a poté se plamen snížil na 20 minut. Po 30 minutách zahřívání byl tekutý odvar oddělen od bylin, které byly dále odvarovány 200 ml destilované vody při 80 °C po dobu dalších 30 minut. Tento proces byl opakován a konečný objem dekokční kapaliny byl přefiltrován přes 4-5 vrstvy gázy. Do přefiltrovaného odvaru se z bylinek vymačkávala i tekutina. Odvar byl následně zahříván na 80 °C ve vodní lázni po dobu 6–7 hodin, dokud koncentrace nedosáhla 2 g surové drogy/ml, a před použitím byl odvar skladován při 4 °C. nový WSSJD byl připraven na základě formulace WSSJD s drobnými úpravami dávek Panax ginseng, Cynomorium solarium, Radix Astragali a Epimedium brevicornum. Metoda dekoktování byla stejná jako u WSSJD. nový WSSJD složený z následujících látek: Panax ginseng, 6 g; Solárium Cynomorium, 9 g; Radix Astragali, 12 g; Epimedium brevicornum, 6 g; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1 g;Cistanche deserticola, 9 g; Angelica Sinensis, 6 g; Ploché semeno Milkvetch Seed, 9 g; Rhizoma Dioscoreae, 15 g; Velká hlava Atractylodes Rhizome, 6 g; Ligusticum wallichii, 3 g; Radix Paeoniae Alba, 6 g; Cinnamomum cassia, 1 g; Costustoot, 1,5 g, a Fructus Foeniculi, 3 g.
Koncentrace extraktů surového léčiva byly stanoveny následovně: Hmotnost surového materiálu/konečný objem. Tato metoda výpočtu je široce používána při studiu tradiční čínské medicíny (19-21). Podávání léků. Myši byly náhodně rozděleny do 6 skupin (15 myší na skupinu) a bylo jim podáváno léčivo intragastricky. Skupiny byly následující: kontrola (normální fyziologický roztok); dimethylsulfoxid (DMSO); CsA; CC; WSSJD; a nové WSSJD. Myším ve skupinách CsA, CC, WSSJD a nových WSSJD bylo intraperitoneálně (ip) injikováno 15 mg/kg/den CsA (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, Čína) po dobu 30 dnů, jak bylo popsáno dříve (8 ). Myši v kontrolní a DMSO skupině dostávaly denně ip injekci stejného objemu normálního fyziologického roztoku nebo rozpouštědla DMSO, v daném pořadí, během 30-denního experimentálního období. Koncentrace DMSO zředěného v normálním fyziologickém roztoku byla 3,25 procent (obj./obj.). Skupině CC bylo podáváno 21,6 mg/kg/den CC (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, Čína), jak bylo popsáno dříve (13), který byl také naředěn v 3,25 procentech (obj./obj.) DMSO (pH{{14} }.2). Myším ve skupině WSSJD a nové WSSJD bylo podáváno 12 g surového léčiva/kg/den WSSJD a nové WSSJD, v daném pořadí.Barvení hematoxylinem a eosinem (H&E). Myší varlata byla sklizena a okamžitě fixována ve 4% paraformaldehydu (pH =7 0,2) při teplotě místnosti po dobu 24 hodin, následovala dehydratace ethanolem, ošetření xylenem pro odstranění ethanolu, zalití voskem a nařezání. Histologické řezy (5 um) byly získány pomocí rotačního mikrotomu. Ty byly připevněny na sklíčka pro H&E barvení. Testikulární řezy byly pozorovány pomocí histopatologické mikroskopie pro vyhodnocení vývoje semenotvorných tubulů a získání histometrických dat. Vývoj semenotvorných tubulů byl hodnocen pomocí Johnsenova skórovacího systému (22).
ELISA. 3. den 0 léčby byly myši anestetizovány 10% chloralhydrátem (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd) v 0,004 ml/g tělesné hmotnosti ip před eutanazií CO2. Byla odebrána kmenová krev a sérum bylo odděleno a skladováno při -20 °C. Stručně řečeno, krev byla odebírána do 1,5 ml zkumavek a skladována při 4 °C přes noc. Zkumavka byla poté centrifugována při 1300 xg při 4 °C po dobu 6 minut a bylo odebráno sérum. Ke stanovení obsahu testosteronu v séru (kat. č. EIA-2380) a LH (kat.č. EIA-2385) byly použity soupravy ELISA (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Shanghai, Čína). ) podle protokolu výrobce. Optická hustota (OD) byla stanovena za použití čtečky mikrodestiček Model 680 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) a hladiny testosteronu a LH byly stanoveny na základě standardní křivky.
Imunohistochemie. Testikulární tkáně byly fixovány ve 4% formaldehydu při pokojové teplotě po dobu 24 hodin a zalité v parafínu. Parafinové řezy byly nařezány na 5 um řezy a následně byly zbaveny vosku. Získání antigenu bylo dosaženo inkubací řezů v 0.01 M citrátovém pufru (pH=6.0) při 95–98˚C po dobu 5 minut. Řezy byly následně blokovány 5% hovězím sérovým albuminem (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Německo; A3675) při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po blokování byly řezy inkubovány s králičími polyklonálními protilátkami proti LHR (kat. č. L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) nebo P450 štěpení postranního řetězce (P450scc; kat. č. ab75497; Abcam, Cambridge, UK ; 1:200) při 4 °C přes noc ve tmě. Metoda streptavidin-biotin complex (SABC) byla použita k detekci exprese LHR a P450scc pomocí SABC kitu (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA), podle protokolu výrobce. Pro tkáně izolované z myší s negativní kontrolou byla primární protilátka nahrazena PBS. Leydigovy buňky se žlutým nebo hnědým zbarvením na membráně nebo plazmě byly považovány za LHR-pozitivní buňky. Z každého vzorku bylo získáno pět sklíček a náhodně bylo vybráno pět polí v oblastech Leydigovy tkáně a hodnoceno pod fluorescenčním mikroskopem (zvětšení x 400). Průměrná OD pozitivních buněk v oblastech Leydigovy tkáně byla získána pomocí softwaru Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Exprese LHR a P450scc byly úměrné hodnotám OD, přičemž vyšší hodnoty OD představovaly vyšší expresi proteinů.
Test dUTP nick-end značení (TUNEL) zprostředkovaný terminální deoxynukleotidyltransferázou (TdT). Varlata myší byla vypreparována, zalita do vosku a rozřezána. Řezy (tloušťka 5- um) byly poté obarveny pomocí testovací soupravy TUNEL (MK1024; Boster Biological Technology) podle protokolu výrobce. Stručně řečeno, testikulární tkáně z kontroly (normální fyziologický roztok), DMSO, CsA, CC, WSSJD a nových skupin WSSJD byly obarveny pomocí 1:100 ředění biotinem značené digoxinové protilátky po dobu 30 minut při 37 °C. Obarvená krysí intersticiální epiteliální tkáň (dodaná v soupravě) byla použita jako pozitivní kontrola a vzorky inkubované s PBS místo biotinem značené digoxinové protilátky byly použity jako negativní kontrola. Frekvence TUNEL-pozitivních buněk vykazujících zelené nukleární barvení byla hodnocena pomocí laserového skenovacího konfokálního mikroskopu. Celkem 10 náhodných polí bylo hodnoceno při velkém zvětšení (x400) a byly spočítány pozitivní buňky. Byl vypočten průměrný počet pozitivních buněk na pole.
Barvení propidium jodidem (PI) nebo Annexin V-fluorescein isothiokyanátem (FITC) a analýza průtokovou cytometrií. Ocasní nadvarle bylo odebráno při následujícím usmrcení a epidermis byla naříznuta čepelí, aby se uvolnily spermie z nadvarlete do 2 ml PBS při 37 °C, aby se získaly suspenze nadvarlete. Suspenze byly následně inkubovány při 37 °C po dobu 10 minut, aby spermie mohly vyplavat. Agregace spermií byly odstraněny a zbývající vzorky spermií byly izolovány a resuspendovány v PBS, aby se získala koncentrace 106 buněk/ml. Apoptóza spermií byla analyzována pomocí soupravy pro detekci apoptózy Annexin V-FITC (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Čína) podle protokolu výrobce. Stručně řečeno, 1 ml suspenze spermií byl obarven 10 ul PI nebo 500 ul vazebného pufru a 5 ul Annexin V-FITC ve tmě po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Buňky byly okamžitě analyzovány průtokovou cytometrií Epics XL (Beckman Coulter, Inc.) a za použití systému TetraONE™ (6915050; Beckman Coulter, Inc.). Buňky v raných stádiích apoptózy byly identifikovány barvením pozitivním na Annexin V a nekrotické buňky byly identifikovány barvením pozitivním na PI.
Statistická analýza. Analýza dat byla provedena pomocí softwaru SPSS 13.{1}} (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) a vyjádřena jako průměr plus nebo ± standardní odchylka, jak je uvedeno. Rozdíly mezi skupinami byly hodnoceny na významnost pomocí jednosměrné analýzy rozptylu následované Tukeyho post hoc testem. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche deserticola
Výsledek
Účinky nového WSSJD na vývoj testikulárních semenotvorných kanálků. Pro zkoumání potenciálního ochranného účinku nového WSSJD na vývoj myších testikulárních semenotvorných kanálků byla morfologie varlat myší barvených H&E porovnána pod světelnou mikroskopií. Semenotvorné tubuly myší ze skupin CsA a CC vykazovaly smrštění okrajového tubulu, zmenšené průměry tubulů a zmenšené vrstvy testikulárního semenotvorného epitelu ve srovnání s kontrolou. Navíc spermatogenní buňky vykazovaly neuspořádané uspořádání, počet spermatogenních buněk byl snížen a v lumenu bylo vidět jen málo zralých spermií (obr. 1). U myší ze skupin DMSO, WSSJD a nových WSSJD bylo vidět více vrstev testikulárního semenotvorného epitelu a okraj semenotvorného tubulu byl integrován bez smrštění nebo kolapsu (obr. 1). Johnsenovo skóre se významně nelišilo mezi skupinou s DMSO a kontrolními skupinami nebo mezi skupinami CC a DMSO. Johnsenovo skóre však bylo významně sníženo ve skupině CsA a skupině WSSJD ve srovnání s kontrolní skupinou a skóre skupin WSSJD a nových WSSJD bylo významně zvýšeno ve srovnání se skupinou CC nebo CsA (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">
Účinky nového WSSJD na sérový testosteron a LH. Následně byly měřeny hladiny testosteronu a LH v séru. Sérové hladiny testosteronu a LH nebyly po podání DMSO ovlivněny. Naproti tomu sérový testosteron byl významně downregulován a LH byl významně upregulován u myší léčených CsA ve srovnání s kontrolami (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">
Účinky nového WSSJD na expresi LHR a P450scc. Exprese P450scc a LHR byly hodnoceny v testikulárních Leydigových buňkách imunohistochemicky (obr. 3 a 4). V kontrolní skupině byl LHR exprimován na vnějších membránách Leydigových buněk mezi semenotvornými tubuly (obr. 3A) a P450cc byl exprimován v cytoplazmě testikulárních Leydigových buněk (obr. 4A). Ošetření DMSO nemělo žádný významný účinek na expresi LHR a P450scc. Naproti tomu léčba CsA významně snížila expresi LHR a P450scc ve srovnání s kontrolními myšmi (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">
Vliv nového WSSJD na apoptózu spermatogenních buněk. Apoptóza spermatogenních buněk v myších varlatech byla analyzována testem TUNEL. Jádra apoptotických buněk byla pozorována především ve spermatogonii a primárních spermatocytech (obr. 5A). Spermatogonie jsou větší než spermatocyty a jsou umístěny blíže bazální membráně (23). Léčba DMSO neměla žádný významný vliv na počet apoptotických spermatogenních buněk ve varlatech. Naproti tomu léčba CsA významně zvýšila počet apoptotických spermatogenních buněk ve srovnání s kontrolní skupinou a skupinou DMSO (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">
Účinky nového WSSJD na přežití a časnou apoptózu spermií. Pro ověření ochranných účinků nového WSSJD proti apoptóze spermií indukované CsA bylo stanoveno přežití a časná apoptóza spermií v nadvarleti. Epididymální spermie byly obarveny PI nebo Annexinem V a analyzovány průtokovou cytometrií (obr. 6 a 7). Po výše uvedených výsledcích léčba CsA významně snížila procento živých spermií a významně zvýšila procento časně apoptotických spermií (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">
Diskuse
Již dříve bylo zdokumentováno, že dlouhodobé užívání CsA jako imunosupresiva ovlivňuje reprodukční kapacitu (6). Xu (24) uvedl, že morfologie a vitalita spermatu u pacientů léčených CsA byly významně nižší než u neléčené skupiny, jak bylo pozorováno ve vzorcích spermatu 26 příjemců transplantátu ledvin léčených různými dávkami CsA a 12 zdravých dobrovolníků. Bylo také pozorováno, že míra deformace hlavy spermií byla významně vyšší u příjemců léčených CsA (24). Tyto výsledky naznačují, že CsA měl účinek na parametry spermatu závislý na dávce. Proto jsou zapotřebí studie k identifikaci nových farmakologických činidel schopných zmírnit poškození varlat vyvolané CsA a zlepšit reprodukční schopnost samců po transplantaci orgánů.
Specifické mikroprostředí varlete podporuje spermatogenezi, a tak poškození struktury a funkce varlete může vést k zástavě spermatu(25). Monteiro et al(26) léčili potkany Wistar CsA v dávce 15 mg/kg denně po dobu 56 dnů a pozorovali zvýšený objemový podíl pojivové tkáně a snížený objemový podíl Leydigových buněk u potkanů léčených CsA. Bylo také pozorováno, že CsA způsobil degeneraci semenotvorného epitelu, což mělo za následek vakuolizaci Sertoliho buněk, abnormální kulaté a prodloužené spermatidy a akumulaci reziduální cytoplazmy na hranici epitelu přilehlé k lumen (26). V této studii byly myši Kunming léčeny 15 mg/kg CsA denně po dobu 30 dnů, což vedlo ke smrštění a zmenšení průměru semenotvorných tubulů, redukci vrstev semenotvorného epitelu, neuspořádanému uspořádání semenotvorných buněk, snížení zralosti spermií v lumen a významně snížené Johnsenovo skóre.
Léčba pomocí CsA navíc vážně poškodila strukturu varlat. Tato studie také hodnotila ochranné účinky nové WSSJD jako nové čínské medicíny na varlata myší léčených CsA. Bylo pozorováno, že po léčbě novým WSSJD byly obnoveny semenotvorné epiteliální vrstvy varlat a uspořádání semenotvorných buněk. Kromě toho myši v nové skupině WSSJD vykazovaly integrované semenotvorné kanálky bez smrštění nebo kolapsu a měly významně vyšší Johnsenovo skóre ve srovnání s myšmi léčenými CsA. Tyto výsledky naznačují, že WSSJD významně napravil poškození varlat vyvolané CsA, což naznačuje, že tato rostlinná léčivá sloučenina může být účinnou léčbou v prevenci poškození varlat vyvolaného CsA. Zda tato buněčná oprava závisí na výklenku v epitelu, je také důležitá otázka, která by měla být prozkoumána v budoucích studiích.
Osa hypotalamus-hypofýza-varlata hraje důležitou roli v regulaci genitální aktivity (27). Vývoj a funkčnost mužských pohlavních orgánů jsou regulovány hormony z hypotalamu a hypofýzy (28). Krueger et al (29) léčili potkany Sprague Dawley 25 mg/kg/den CsA nebo 40 mg/kg/den CsA po dobu 6 dnů a pozorovali, že sérové hladiny LH a FSH se zvýšily 2-4krát, zatímco exprese P450scc klesl na 30 procent v kontrolní skupině. Kromě toho byly hladiny testosteronu v séru významně sníženy u myší léčených CsA, což mělo za následek zhoršenou spermatogenezi (29). V této studii bylo prokázáno, že léčba CsA významně snížila expresi LHR v Leydigových buňkách. Ačkoli byl sérový LH zvýšen, snížená exprese LHR mohla narušit LH zprostředkovanou obnovu biosyntézy testosteronu a snížit expresi P450scc jako enzymu omezujícího rychlost biosyntézy testosteronu (30), a tak ovlivnit biosyntézu testosteronu Leydigovými buňkami. Nové složky v novém WSSJD, jako je paroh pilose, vykazují účinky podobné pohlavním hormonům (12), které mohou zlepšit hladiny testosteronu v séru a snížit hladiny LH v séru, a tím zvýšit expresi LHR a p450scc v Leydigových buňkách. Současné výsledky zejména ukázaly, že nový WSSJD stimuloval biosyntézu a sekreci testosteronu v Leydigových buňkách, aby podpořil spermatogenezi.
Oxidační stres vyvolaný CSA a poškození varlat indukují dysplazii spermií a spermatogenních buněk (31). Bylo hlášeno, že dlouhodobá léčba CsA poškozuje antioxidační systém ve zvířecích testikulárních tkáních, což vede ke snížení hladin glutathionu, glutathionperoxidázy a peroxidu vodíku a ke zvýšení hladin malonového dialdehydu ve varlatech (31). Proto nelze eliminovat nadměrné hladiny reaktivních forem kyslíku v tkáních varlat, což vede k peroxidaci lipidů membrán spermií, poškození DNA a snížení vitality spermií. V této studii bylo pozorováno, že léčba CsA významně zvýšila zlom DNA a apoptickou rychlost spermatogenních buněk v semenotvorných tubulech. Míra přežití spermií v nadvarlatech se také snížila, zatímco procento časně apoptotických spermií se zvýšilo, což naznačuje, že spermatogenní aktivita varlat byla významně poškozena. Türk et al (32) zdokumentovali, že ochranný účinek kyseliny ellagové na poškození varlat vyvolané CsA byl spojen s oxidačním stresem u samců potkanů. Nový WSSJD použitý v této studii obsahuje různé antioxidační složky, včetně bylinného léku ženšen, u kterého bylo dříve prokázáno, že významně snižuje hladiny hyperoxidu ve varlatech (14).
V této studii byly zkoumány účinky nového WSSJD na CsA-indukované poškození syntézy testosteronu a spermatogenní apoptózu a bylo pozorováno, že nový WSSJD významně snižoval apoptotické rychlosti spermatogenních buněk a spermií, a tak opravoval poškození testikulárních semenotvorných plodů. epitel. Morfologie testikulárních semenotvorných kanálků a apoptóza spermatogenních buněk a spermií byla zkoumána pomocí histochemie a průtokové cytometrie. Ačkoli distribuce buněčného cyklu a denní produkce spermií nebyly zkoumány, budou předmětem budoucích studií naší skupiny.
WSSJD významně zvýšil hladiny testosteronu ve varlatech a snížil apoptózu spermatogenních buněk a spermií, což účinně napravilo poškození varlat vyvolané CsA. Tyto výsledky naznačují, že nový WSSJD může být užitečným farmakologickým činidlem při léčbě a prevenci poškození varlat vyvolaného CsA.
Cistanche deserticola celé kořeny
Reference
1. Pedersen M a Seetharam A: Infekce po ortotopické transplantaci jater. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360, 2014.
2. Vora GK a Ciolino JB: Reakce rohovkového aloštěpu spojená s neokulárním zánětem. Číslice J Ophthalmol 20: 29-31, 2014.
3. De Pasquale C, Veroux M, Indelicato L, Sinagra N, Giaquinta A, Fornaro M, Veroux P a Pistorio ML: Psychopatologické aspekty transplantace ledvin: Účinnost multidisciplinárního týmu. World J Transplant 4: 267-275, 2014.
4. El-Gowelli HM a El-Mas MM: Centrální modulace cyklosporinem indukované hypertenze. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361, 2015.
5. EidMM, Abdel-Hamid IA, SobhMA a el-SaiedMA: Hodnocení charakteristik pohybu spermií u neplodných příjemců transplantátu ledviny pomocí počítačové analýzy. Int J Androl 19: 338-344, 1996.
6. Zahra A, Gholamreza N, Farokhi F a Shalizar Jalali A: Zmírnění poškození spermií a embryotoxicity vyvolané cyklosporinem vodným extraktem z plodů crataegus monogyna. Buňka J 15: 198-205, 2013.
7. He Z, Qiu J, LiJ, Zhao D, Chen G a Chen L: Dlouhodobé účinky konverze z cyklosporinu na rapamycin na testikulární funkci a morfologii v modelu transplantace potkanů. Transplant Proc 45: 763-769, 2013.
8. AliRB, KlouzA, Boubaker S, LakhalM a BelkahiaC: Zvířecí model testikulární toxicity cyklosporinem: Hodnocení a ochrana. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246, 2009.
9. Seethalakshmi L, Flores C, Malhotra RK, Pallas JD, Tharakan D, Khauli RB a Menon M: Mechanismus účinku cyklosporinu při inhibici biosyntézy testosteronu krysími Leydigovými buňkami in vitro. Transplantation 53: 190-195, 1992.
10. SeethalakshmiL, FloresC, CarboniAA a Menon M: Kvantitativní udržení spermatogeneze u potkanů léčených cyklosporinem exogenním podáváním testosteron propionátu. J Androl 11: 491-497, 1990.
11. Pan XY, Wang XY, Wang XN, Sun ZX, Wang D, Wang X, Yang YY a Li ZX: Účinky 'Wenshen Shengjing Decoction' na apoptózu spermatogenních buněk indukovanou cyklofosfamidem a dimethylaci histonů H3K9. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86, 2014 (v čínštině).
12. Xu ZH, Li SF, Wang JY, Zhou R a Tian SJ: Extrakce pohlavního hormonu z paroží sametu superkritickým CO2. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003, 2007 (v čínštině).
13. Zhao LP, Xu Z, Zhang M, Sun HC a Tang F: Účinky Fructus Lycii a Radix astragali na funkci Sertoliho buněk ve varlatech potkana. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86, 2007 (v čínštině).
14. Xu L, Liu XH a Zhang L: Účinky celkových ginsenosidů na NO, NOS a celkovou antioxygenovou kapacitu ve varlatech myši. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508, 2006 (v čínštině).
15. Patel DP, Brant WO, Myers JB, Presson AP, Johnstone EB, Dorais JA, Aston KI, Carrell DT a Hotaling JM: Bezpečnost a účinnost klomifen citrátu u hyperandrogenních a subfertilních mužů. Int J Impot Res 27: 221-224, 2015.
16. ElSheikh MG, Hosny MB, Elshenoufy A, Elghamrawi H, Fayad A a Abdelrahman S: Kombinace vitaminu E a klomifencitrátu při léčbě pacientů s idiopatickou oligo jako azoospermií: Prospektivní, randomizovaná studie. Andrologie 3: 864-867, 2015.
17. Wang R, Xu L, Zhang WX, Wu YF, Shi JH a Zhang YX: Granule Shengjing: Účinná čínská medicína na spermatogenní poruchy u myší. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049, 2008 (v čínštině).
18. Fan BT: Chinese Medicine Pharmacy, Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68, 1997 (v čínštině).
19. Zhang J, Li H, Lu L, Yan L, Yang X, Shi Z a LiD: Formule Yiqi a Yangyin zlepšuje poškození hematopoetického systému způsobené celkovým ozářením těla. J Radiat Res 58: 1-7, 2017.
20. Minami M, Konishi T, Jiang Z, Arai T a Makino T: Účinek Shin'iseihaito na alergickou reakci myší vyvolanou senzibilizací nosu. J Tradit Complement Med 6: 252-256, 2015.
21. Rong R, Li RR, Hou YB, Li J, Ding JX, Zhang CB a Yang Y: Odvar z Mahuang-xixin-fuzi snižuje infekci virem chřipky u myší se syndromem selhání ledvin a yangu. J Ethnopharmacol 192: 217-224, 2016.
22. Johnsen SG: Testikulární biopsie skóre – metoda pro registraci spermatogeneze v lidských varlatech: normální hodnoty a výsledky u 335 hypogonadálních mužů. Hormony 1: 2-25, 1970.
23. Mays-Hoopes LL, Bolen J, Riggs AD a Singer-Sam J: Příprava spermatogonií, spermatocytů a kulatých spermatid pro analýzu genové exprese pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk. Biol Reprod 53: 1003-1011, 1995.
24. Xu LG: Vliv cyklosporinu A na parametry spermatu pacientů po transplantaci ledviny. J Clin Urol 20: 603-605, 2005.
25. Pintus E, Ros-Santaella JL a Garde JJ: Mimo velikost varlat: Vazby mezi spermatogenezí a znaky spermií u sezónního chovného savce. PLoS One 10: e0139240, 2015.
26. Monteiro JC, Predes FS, Matta SL a Dolder H: Infuze Heteropterys aphrodisiaca snižuje vedlejší účinky cyklosporinu A na varlata. Anat Rec (Hoboken) 291: 809-817, 2008.
27. Oseko F, Note S, Morikawa K, Endo J, Taniguchi A a Imura H: Vliv chronické hyperprolaktinémie vyvolané sulpiridem na osu hypotalamo-hypofýza-varlata u normálních mužů. Fertil Steril 44: 106-111, 1985.
28. Wisniewski P, Romano RM, Kizys MM, Oliveira KC, Kasamatsu T, Giannocco G, Chiamolera MI, Dias-da-Silva MR a Romano MA: Expozice dospělých bisfenolu A (BPA) u potkanů Wistar snižuje kvalitu spermií a narušuje je osy hypotalamus-hypofýza-varlata. Toxicology 329: 1-9, 2015.
29. Krueger BA, Trakshel GM, Sluss PM a Maines MD: Cyklosporinem zprostředkovaná deprese receptorů luteinizačního hormonu a biosyntézy hemu ve varlatech potkana: Možný mechanismus poklesu sérového testosteronu. Endocrinology 129: 2647-2654, 1991.
30. Nolan CJ a Payne AH: Genotyp v lokusu P450scc určuje rozdíly v množství proteinu P450scc a maximální produkci testosteronu v myších Leydigových buňkách. Mol Endocrinol 4: 1459-1464, 1990.
31. Türk G, Ateşşahin A, Sönmez M, Yüce A a Ceribaşi AO: Lykopen chrání před testikulární toxicitou vyvolanou cyklosporinem A u potkanů. Theriogenology 67: 778-785, 2007. 32. Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A a Ateşşahin A: Zmírnění poškození varlat a spermií vyvolané cyklosporinem A spojeného s oxidačním stresem kyselinou ellagovou. Int Immunopharmacol 10: 177-182, 2010.
