Ochranné účinky mikrovezikul endoteliálních progenitorových buněk na poškození ledvin potkanů vyvolané Ang II
Mar 11, 2022
Abstraktní.Chronická hypertenze může vést kpoškození ledvin,známá jako hypertenzní nefropatie nebo hypertenzní nefroskleróza. Další pochopení molekulárních mechanismů, kterými se hypertenzní nefropatie vyvíjí, je nezbytné pro účinnou diagnostiku a léčbu. Tato studie zkoumala mechanismy, kterými endoteliální progenitorové buňky (EPC) opravují primární krysyledvinabuňky (PRK). ELISA, Cell Counting Kit-8 a testy průtokové cytometrie byly použity k analýze účinků EPC nebo EPC-MV na oxidační stres, zánět, buněčnou proliferaci, apoptózu a cyklus PRK indukovaný AngII. Model poranění PRK byl vytvořen pomocí angiotensinu II (Ang II). Po indukci Ang II byla proliferace PRK snížena, apoptóza byla zvýšena a buněčný cyklus byl blokován ve fázi G1 před vstupem do S fáze. Bylo zjištěno, že hladiny reaktivních forem kyslíku a malondialdehydu byly zvýšeny, zatímco hladiny glutathionperoxidázy a superoxiddismutázy byly sníženy. Navíc byly významně zvýšeny hladiny zánětlivých cytokinů IL‑1, IL‑6 a TNF‑. Ang II tedy poškodil PRK stimulací oxidačního stresu a podporou zánětlivé reakce. Nicméně, když byly PRK kokultivovány s EPC, poškození indukované Ang II bylo významně sníženo. Současná studie shromáždila mikrovezikuly (MV) vylučované EPC a kokultivovala je s PRK indukovanými Ang II a zjistila, že EPC-MV si zachovaly svůj ochranný účinek na PRK. Závěrem lze říci, že EPC chrání PRK před poškozením vyvolaným Ang II prostřednictvím sekretovaných MV.
CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL
Úvod
Hypertenze je rizikovým faktorem pro výskyt kardiovaskulárních a cerebrovaskulárních onemocnění a s nimi spojenou mortalitu (1). Theledvinymohou způsobit hypertenzi a jsou jedním z cílových orgánů hypertenzního poškození (2). Chronickýnemoc ledvin(CKD) byla v posledních dvou desetiletích celosvětově jednou z hlavních příčin zvýšené úmrtnosti jedinců s vysokým krevním tlakem [3,4]. Existuje tedy naléhavá potřeba podporovat léčbu hypertenzní nefropatie a studovat její patologický mechanismus. Předchozí studie ukázaly, že angiotenzin II (Ang II) indukoval vaskulární poškození a hrál klíčovou roli u vaskulárních onemocnění prostřednictvím několika mechanismů, jako je indukce apoptózy (5), zástava buněčného cyklu (6), zvýšení hladin reaktivních forem kyslíku (ROS) ( 7), podporující reakci na oxidační stres zvýšením sekrece malondialdehydu (MDA) a snížením sekrece glutathionperoxidázy (GSH‑Px) a superoxiddismutázy (SOD) (8,9). Ang II také podporuje produkci faktorů souvisejících se zánětem, jako je IL-6, IL-1 a TNF- (10-12). Poškození indukované Ang II bylo proto použito k modelování hypertenze in vitro, včetně primárního potkanaledvinabuňky (PRK) (13,14).
Pro pacienty sfunkce ledvinpoškození, poškození endoteliálních buněk a snížená regenerace a reparace jsou hlavními příčinami ztráty peritubulárních mikrovezikul (MV) (15). Endoteliální progenitorové buňky (EPC) odvozené z kostní dřeně mohou podporovat endoteliální opravu (16,17). Předchozí studie odhalily, že EPC mohou zlepšit kardiovaskulární regeneraci (18) a regulovat angiogenezi (19), stejně jako mít terapeutické účinky na akutníledvinovéischemicko-reperfuzního poškození (20) au pacientů stransplantaci ledvin(21). Podle našich nejlepších znalostí však nebyl účinek EPC na hypertenzní nefropatii dříve popsán. Předpokládali jsme, že EPC mohou mít ochranný účinek proti hypertenzní nefropatiiledvinovébuňky. MV jsou nepřetržitě vylučovány řadou buněk v těle, jako jsou epiteliální buňky, nádorové buňky a kmenové buňky, a existují v několika tělesných tekutinách, jako je krev, moč a mléko, kde zprostředkovávají biologické funkce (22). Hromadné důkazy naznačují, že ochranný účinek EPC je úzce spojen s uvolňováním MV (23,24) V této studii byla zkoumána potenciální aplikace EPC-MV pro léčbu hypertenzní nefropatie zkoumáním ochranných účinků a mechanismů prostřednictvím kterých EPC-MV chrání před poškozením PRK indukovaným Ang II, aby poskytl biologický teoretický základ pro léčbu hypertenzní nefropatie.
klíčová slova:EPC-MVs, hypertenzní nefropatie, Ang II, ROS, MVs, zánět, ledviny, ledviny
Materiály a metody
Zvířata.Celkem 12 8-týdenní samci krys Wistar-Kyoto (WKY) bez specifických patogenů (hmotnost, 80-120 g) byli získáni od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (licence č. SCXK, Guangdong, 2015-0063). Potkani byli umístěni do místnosti s konstantní teplotou a vlhkostí (teplota 23 ± 2 °C; vlhkost 50 ± 10 procent), pod 12hodinovým cyklem světlo/tma s ad libitním přístupem ke standardní potravě pro krysy a vodě. polystyrenová klec. Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro péči o zvířata a použití Lékařské univerzity Hainan (Haikou, Čína; číslo schválení HYLL-2021-053) a byly provedeny v souladu s pokyny Národního institutu zdraví (25).
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCE LEDVIN/RENÁL
Izolace a kultura PRK.Krysy WKY s volným přístupem k vodě před experimentem 12 hodin hladověly. Myši WKY byly usmrceny pomocí intraperitoneální injekce pentobarbitalu sodného (200 mg/kg tělesné hmotnosti).ledvinybyly asepticky odstraněny a kortikální částledvinabyl vyříznut a transplantován do malé kádinky. Theledvinovékortex byl nařezán na tkáňové fragmenty ~1 mm3, třikrát promyt PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), centrifugován při 1,000 xg při 25 °C po dobu 5 minut a supernatant byl odstraněn. Tkáňové fragmenty byly přidány ke kolagenáze typu I (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) v konečné koncentraci 1 g/l a tkáňové fragmenty byly oscilovány a štěpeny při 37 °C po dobu 30 min. Po filtraci přes síto z nerezové oceli 200 mesh (0,075 mm) byly buňky odděleny centrifugací s hustotním gradientem Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) (26). Po centrifugaci při 1,000 xg při 25 °C po dobu 2 minut byla meziproduktová suspenze shromážděna a smíchána s médiem MEM/F12 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), naočkována do 6jamkové destičky a kultivované při 37 °C pod 5 procenty CO2. Po 24 hodinách bylo médium odstraněno a nahrazeno čerstvým médiem a odpojenoledvinovébuňky a tkáň byly vyřazeny. Po 48 hodinách bylo médium znovu odstraněno, buňky byly dvakrát promyty PBS a byly označeny jako PRK (27,28); hlavní složkou byly potkaní glomerulární mesangiální buňky. PRK byly kultivovány po tři generace a ošetřeny Ang II (1 uM; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) při 37 °C po dobu 24 hodin, aby se stanovila PRKpoškození ledvinModelka. Ang II-indukovaný zánět u potkanůledvinovétubulární epiteliální buňky byly provedeny tak, jak bylo dříve popsáno v Nair et al (29).
PRK byly identifikovány pomocí imunofluorescenčního (IF) testu.Po trojím propláchnutí PBS a fixaci 4% paraformaldehydem při 25°C po dobu 1 hodiny byly buňky inkubovány (25°C) s Tritonem X-100 po dobu 2 hodin, následně 5% BSA (Peking Solar Science & Technology Co., Ltd.) při 25˚C po dobu 30 minut. PRK byly poté inkubovány přes noc ve tmě s -aktinem hladkého svalstva (-SMA; 1 ug/ml; kat. č. ab7817; Abcam) a vimentinem (1:250; kat. č. ab92547; Abcam) při 4 °C. Po trojím promytí PBS byly buňky inkubovány se sekundárními protilátkami Alexa Fluor® 488‑ (1:100; kat. č. ab150077; Abcam) nebo 647‑značenými (1:200; kat. č. ab150075; Abcam) ve 37. ˚C po dobu 1 hodiny. Poté byly buňky obarveny DAPI (0,5 ug/ml; Beyotime Institute of Biotechnology) při 25 °C po dobu 5 minut. Nakonec byly snímky zachyceny pomocí fluorescenčního mikroskopu (zvětšení, x 400; Leica Microsystems GmbH).
Kultura a identifikace EPC.Potkaní femur a holenní kost byly vypreparovány a každá zkumavka kostní dřeně byla propláchnuta sterilním PBS. Výsledná směs byla centrifugována (1,000 xg; 25˚C; 15 min) a částice byly resuspendovány v médiu MEM/F12. Buňky byly izolovány centrifugací s hustotním gradientem Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) (1,000 xg; 25 °C; 20 min) a umístěny do 25-cm2 kultivační baňky potažené fibronektinem (BD Biosciences). Buňky byly udržovány v kompletním médiu za standardních podmínek (37 °C; 5 procent CO2). Kultivační médium bylo vyměněno po 4 dnech a adherentní buňky byly kultivovány další 3 dny (30). K identifikaci EPC bylo použito barvení Dil komplexem acetylovaného lipoproteinu o nízké hustotě (Dil‑Ac‑LDL) (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). Pro systém společné kultivace byly PRK (1x104 ) přidány do spodní komory kokultivační desky (Corning, Inc.) na 24 hodin a poté byly přidány Ang II (1 uM) nebo 200 ul PBS a EPC (3x104). přidány do horní komory a inkubovány při 37 °C po dobu 24 hodin, než byla provedena další analýza buněčné funkce. Při screeningu PRK a nejlepšího podílu EPC byly poměry počtu buněk 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 a 1:7.
Příprava EPC-MV. EPC byly kultivovány po dobu 7 dnů, jak bylo popsáno dříve (30), promyty dvakrát PBS a 12 hodin bez sérového hladovění. Následně bylo shromážděno médium MEM/F12 obsahující kultivované EPC a centrifugováno při 4 °C (1,000 xg; 15 min) a supernatant byl extrahován při 4 °C (100,000 xg; 60 min) pro sběr sekretovaných EPC-MV. Po zalití do epoxidové pryskyřice Pon 812 (Structure Probe, Inc.) byla umístěna přes noc při 37 °C. Poté byl na 4 hodiny přidán fixační roztok pro elektronový mikroskop (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) a octan uranu (2 procenta; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) a citrát olovnatý (Wuhan Service Technology Co., Ltd. ) byly barveny při 25 °C po dobu 15 minut. MV byly potvrzeny transmisní elektronovou mikroskopií. V systému společné kultivace bylo 50 ug/ml EPC-MV (31) přidáno do horní komory testovací destičky Transwell a parky byly přidány do spodní komory, jak bylo popsáno dříve, a inkubovány po dobu 24 hodin.
Test buněčné proliferace.PRK byly štěpeny trypsinem, naočkovány do 96-jamkových destiček v hustotě 3x103 buněk/jamku a kultivovány po dobu 24 hodin. Optická hustota při 450 nm byla měřena pomocí 10 µl činidla Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) při 37 °C po dobu 60 minut podle pokynů výrobce, aby se vyhodnotil rychlost buněčné proliferace.
CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESTI LEDVIN/RENÁL
Test buněčné apoptózy.Test buněčné apoptózy byl proveden pomocí soupravy Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit (BD Biosciences) podle pokynů výrobce. PRK byly sklizeny, dvakrát promyty ledově studeným PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a resuspendovány v 50}0 ul vazebného pufru. Resuspendované PRK byly poté inkubovány s 5 ul Annexin V-FITC a 5 ul PI ve tmě po dobu 15 minut při 23±2˚C. Apoptóza buněk byla hodnocena pomocí průtokové cytometrie (FCM; FACSCanto II; software BD FACSChorus™, verze: 1.0; BD Biosciences).
Fúze EPC-MV a PRK.Aby bylo možné pozorovat, zda byly EPC-MV fúzovány s PRK, byly EPC-MV před společnou inkubací označeny fluorescenčním barvivem zabudovaným do lipidové membrány (PKH26). Stručně řečeno, 50 µg/ml EPC-MV bylo kombinováno s 2 ml PKH26 (2x10‑6 M; Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) a mícháno při 23±2˚C po dobu 5 minut. Značená směs byla přidána do 2 ml 1% BSA (v) a centrifugována při 100,000 xg při 4 °C po dobu 60 minut, poté promyta studeným PBS. Sraženina byla suspendována v 1 ml média MEM/F12, přidána k PRK a inkubována při 37 °C po dobu 24 hodin. Nakonec byl přidán 1 ug/ml DAPI pro barvení jader při 25 °C po dobu 15 minut. Snímky buněk byly získány pomocí fluorescenčního mikroskopu (zvětšení, x 400; Leica Microsystems GmbH).
Test buněčného cyklu.Test buněčného cyklu byl proveden pomocí soupravy Cell Cycle Detection kit (BD Biosciences). EPC nebo PRK (1x106) byly sklizeny, dvakrát promyty PBS a poté fixovány v 500 ul 70% ledově chladného ethanolu po dobu 2 hodin při 25 °C. Buňky byly poté dvakrát promyty studeným PBS a inkubovány v PI (400 ul) a RNase (100 ul) po dobu 30 minut při 37 °C ve tmě. PI signál byl detekován pomocí FCM (FACSCanto II). Procenta buněk ve fázi G1, S a G2 byla spočítána a porovnána pomocí softwaru FlowJo (verze 10.0.6; FlowJo LLC).
Měření ROS pomocí FCM.PRK byly kultivovány do 60-70 procent konfluence a sklizeny trypsinizací. Všechny buňky byly inkubovány s 1,0 uM 2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetátem po dobu 15 minut při 37 °C. Buňky byly poté dvakrát promyty PBS a analyzovány pomocí FCM pro detekci ROS s použitím 488 nm laseru pro excitaci a 535 nm laseru pro detekci.
ELISA.Po centrifugaci (1,000 xg; 25˚C; 5 minut) byl odebrán buněčný supernatant každé podskupiny za účelem analýzy hladin MDA, GSH-Px, SOD a zánětlivých faktorů IL-6, IL- 1 a TNF‑. Následující soupravy byly použity podle pokynů výrobce: testovací souprava Micro MDA (kat. č. BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), testovací souprava GSH-Px (kat. č. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), souprava pro detekci aktivity SOD (kat. č. BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), souprava potkaního IL‑1 ELISA (kat. č. RLB{ {13}}; R&D Systems, Inc.), potkaní IL‑6 Quantikine ELISA kit (kat. č. R6000B; R&D Systems, Inc.) a potkaní TNF Quantikine ELISA kit (kat. č. RTA00; R&D Systems, Inc. ).
Statistická analýza.Všechny experimenty byly opakovány třikrát a všechna data jsou vyjádřena jako průměr ± SD. Data byla analyzována pomocí softwaru SPSS verze 21.0 (IBM Corp.). Rozdíly mezi více skupinami byly hodnoceny pomocí jednocestné ANOVA a Dunnettova post hoc testu. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Výsledek
Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A). Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 procent, což potvrzuje, že EPC byly úspěšně izolovány. Izolované PRK byly analyzovány pomocí IF (vimentin/-SMA). Výsledky ukázaly, že hladina exprese vimentinu/‑SMA v PRK byla vysoká a pozitivní, což naznačuje úspěšnou izolaci PRK (obr. 1B).
Optimální poměr EPC k PRK.Byl zkoumán účinek kombinace různých podílů PRK/EPC v systému společné kultury a bylo zjištěno, že PRK pěstované v poměru 1:3 PRK/EPC neměly zvýšenou míru proliferace ve srovnání s PRK pěstovanými s 2: poměr PRK/EPC 1, 1:1 nebo 1:2 (obr. 1C). Navíc zvyšující se podíly EPC (1:4, 1:5, 1:6 a 1:7) vedly k významnému zvýšení proliferace PRK ve srovnání s proliferací EPC (1:3). Proto byl pro další studie zvolen poměr 1:3 PRK/EPC, aby se předešlo možné interferenci z nadměrného EPC v následných experimentech.
Účinek kokultivace EPC na poškození vyvolané Ang II.PRK (1x104) byly naočkovány 24 hodin předem do spodního oddílu destičky Transwell. Horní komora obsahovala 200 ul PBS v kontrolní skupině a 200 ul EPC (3x104) v experimentální skupině. Modelovatpoškození ledvin,Do spodního kompartmentu byl přidán 1 uM Ang II. Po 24 hodinách byly provedeny testy CCK‑8 a FCM k měření rychlosti proliferace PRK. PRK, které dostávaly Ang II v nepřítomnosti EPC, měly významně snížené (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the="" g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">ledvinabuněčný model.
EPC chrání PRK před poškozením vyvolaným Ang II, byly zkoumány hladiny oxidačního stresu indukovaného Ang II v PRK společně kultivovaných s EPC. Výsledky testu FCM odhalily, že Ang II významně vzrostl (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).="" similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted="" mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c="" and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while="" prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">
Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 vs. PRKs:EPCs, skupina 2:1; *P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.="" (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;="" prks,="" primary="" rat="">ledvinabuňky; FCM, průtoková cytometrie; CCK-8, souprava pro počítání buněk-8; Dil‑Ac‑LDL, Dil komplex acetylovaný lipoprotein s nízkou hustotou; OD, optická hustota; ‑SMA, ‑aktin hladkého svalstva; NS, nevýznamné. opačné výsledky s ohledem na sekreci těchto enzymů. Tvorba ROS se proto může podílet na poškození buněk indukovaném Ang II a lze ji zlepšit kokultivací s EPC.
Ang II může také poškodit buňky podporou sekrece zánětlivých cytokinů, zatímco EPC mohou zánětu zabránit (32). Dále bylo zkoumáno, zda Ang II podporuje sekreci zánětlivých cytokinů v PRK a zda EPC mohou vykonávat svou ochrannou roli inhibicí sekrece zánětlivých cytokinů. Sekrece IL‑1, IL‑6 a TNF‑ byla u PRK významně zvýšena přidáním Ang II. Naproti tomu u PRK kokultivovaných s EPC byly hladiny IL-1, IL-6 a TNF- (obr. 2E-G) srovnatelně nižší (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">
Ochranný účinek EPC se uplatňuje prostřednictvím MV.Mechanismy, kterými EPC mají ochranné účinky na indukované Ang IIledvinabuňky byly dále analyzovány izolací MV z EPC (obr. 3A). EPC-MV byly označeny PKH26 a přidány k PRK spolu s Ang II na destičce Transwell, jak bylo popsáno dříve. Fluorescence PKH26 byla detekována v cytoplazmě PRK (obr. 3B), což ukazuje, že EPC-MV fúzovaly s PRK. Poté bylo zjištěno, že Ang II-indukovaná snížená rychlost proliferace, podporovaná apoptóza a zastavení cyklu ve fázi G1, byly inhibovány EPC-MV (obr. 3C-E). Podobně jako PRK kultivované společně s EPC měly PRK pěstované v přítomnosti EPC-MV a vystavené Ang II snížené hladiny ROS a MDA (obr. 4A a B), zvýšené hladiny GSH a SOD (obr. 4C a D) a snížená sekrece zánětlivých cytokinů IL‑1, IL‑6 a TNF‑ (obr. 4E‑G) ve srovnání se skupinou Ang II.
Diskuse
Podle našich nejlepších znalostí tato studie poprvé prokázala, že EPC mohou chránit PRK před poškozením buněk vyvolaným Ang II. Tento ochranný účinek je alespoň částečně zprostředkován MV, které jsou vylučovány EPC a fúzují s PRK během společné kultivace. Přidáním obohacených MV k PRK vystaveným Ang II bylo zjištěno, že samotné EPC-MV by mohly chránit PRK před poškozením vyvolaným Ang II inhibicí oxidačního stresu a zánětu. MV jsou definovány jako membránové nanodebris (0.05‑1 µm) (33) a jsou vylučovány z buněčného povrchu po aktivaci, stresu nebo apoptóze. Kromě toho mohou být MV odvozeny z různých typů buněk, jako jsou krevní destičky, endoteliální buňky, EPC a bílé krvinky (34,35). MV exprimují specifické markery buněčného povrchu, které se liší podle původní buňky a jejich tvorby a mohou mít protizánětlivé, antikoagulační a angiogenní účinky (36). MV uvolněné z EPC mohou nést biologickou informaci své rodičovské buňky, a tak vykonávat podobnou funkci na cílové buňky (33). Například EPC-MV chrání kardiomyocyty před hypertrofií a apoptózou indukovanou Ang II (28), zlepšují endoteliální funkci a schopnost regulovat angiogenezi (37) a zmírňují endoteliální dysfunkci vyvolanou oxidačním stresem (38). Podle našich nejlepších znalostí však nebyl účinek EPC-MV na hypertenzní nefropatii dříve popsán. Cílem této studie bylo prozkoumat potenciální ochranné účinky EPC a EPC-MV vpoškození ledvinových buněk.
V této studii byl vytvořen model poranění PRK indukcí poškození Ang II. V souladu s předchozími zprávami (26,39) Ang II snížil proliferaci PRK, zvýšil apoptózu a zastavil buněčný cyklus ve fázi G1 před vstupem do S fáze. Na základě těchto markerů souvisejících s hypertenzí se dospělo k závěru, že model hypertenze PRK indukovaný Ang II byl úspěšně vytvořen. Dále bylo zjištěno, že kokultivace s EPC chránila PRK před poškozením vyvolaným Ang II. Po společné inkubaci EPC s PRK plus Ang II byly hladiny enzymů oxidačního stresu a zánětlivých faktorů v PRK sníženy. Potenciální mechanismy, kterými EPC uplatňují své ochranné účinky na PRK, tedy mohou zahrnovat regulaci oxidačního stresu a zánětu. Podle našich nejlepších znalostí současná studie poprvé prokázala, že EPC mohou zlepšit reakci na oxidační stres a zánět vyvolanou Ang II u PRK.
EPC účinně chránífunkce ledvinu CKD (40) a hrají hlavní roli při udržování vaskulární integrity a nápravě endoteliálního poškození (15), stejně jako snižují vaskulární prosakování, zlepšují funkci orgánů a zvyšují míru přežití u sepse (41). Hromadné důkazy naznačují, že EPC mohou mít ochrannou roli prostřednictvím sekrece MV (37,42,43). Pro testování ochranného účinku EPC-MV v PRK byly EPC-MV izolovány a označeny PKH26 a poté byly značené MV koinkubovány s PRK plus Ang II. EPC-MV fúzovaly s PRK a významně inhibovaly reakci na oxidační stres a zánět vyvolaný Ang II a tyto výsledky jsou podobné výsledkům Fu et al (44). Inhibiční účinek EPC-MV na hladiny enzymů oxidačního stresu byl větší než účinek samotných EPC; to lze přičíst tomu, že MV jsou přítomny ve vyšší koncentraci v PRK ošetřených EPC-MV než v těch, které jsou kokultivovány s EPC. Tato zjištění naznačují, že ochranný účinek EPC na PRK proti poškození buněk indukovaným Ang II může záviset na vylučovaných MV. Omezením této studie je, že potenciální mechanismy, kterými EPC-MV regulují osy mikroRNA/mRNA/transdukce signálu, nebyly plně prozkoumány. Role a mechanismy, proti kterým EPC-MV vykonávají ochranupoškození ledvinby měly být hodnoceny na zvířecím modelu hypertenzní nefropatie, což je slibný směr budoucího výzkumu. Na závěr tato studie prokázala, že EPC mohou chránit PRK před oxidačním stresem indukovaným Ang II a zvýšeným zánětem prostřednictvím sekrece MV. To poskytuje nový směr pro léčbu hypertenzní nefropatie a vytváří in vitro model pro studiumporanění ledvin.
