Promitotické působení Oenothera Biennis na senescentní lidské kožní fibroblasty část 2

3. Diskuse

V této studii jsme zkoumali účinek hydrofilního buněčného extraktu Oenothera biennis (ObHEx) na stárnutí buněk, protože vykazoval vlastnosti proti stárnutí pokožky při testování na modelech in vitro a ex vivo [18]. Použili jsme podobný senescentní model NHDF podrobený SIPS pro léčbu H2O2 [21,22].

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Fenylethanoidové glykosidy Cistanche mají robustní vychytávací schopnost volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermatu, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a schopnost vychytávat reaktivní formy kyslíku a bránit volným radikálům.

indukuje degradaci kolagenu a má také dobrý opravný účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na Kde mohu koupit Cistanche

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Abychom porozuměli mechanismu působení ObHEx na senescentní lidské dermální fibroblasty, odhalením biologických drah pozměněných extraktem, provedli jsme na datech nezávislý hmotnostní spektrometrii ultra-hluboký proteomický přístup. Umožnilo nám to získat dosud nejúplnější proteomovou analýzu senescentních buněk a poprvé současnou kvantifikaci mnoha markerů stárnutí.

Nejprve jsme pro posouzení indukce stárnutí působením H2O2 na buňkách NHFD kvantifikovali známé markery stárnutí. Naše proteomická data potvrdila indukci stárnutí oxidativním stresem: skutečně jsme pozorovali změněné hladiny již známých markerů stárnutí související se zvýšeným obsahem lysozomů (GLB1 a FUCA1), poškozením DNA (ATR, ATM, MACROH2A1 a MACRO2A2) a buněčným cyklem fáze G2 zatčení (CDK1NA a MKI67). Navíc analýza obohacení dráhy nejvíce downregulovaných proteinů v H2O2 ošetřených proti kontrolním buňkám ukazuje na mitózu, což odráží zastavení senescentní proliferace.

Porovnáním proteomu buněk SIPS NHDF ošetřených ObHEx oproti neošetřeným jsme zjistili, že ošetření extraktem dokázalo částečně obnovit hladiny proteinů a komplexů hrajících zásadní roli v několika fázích mitózy. Inkubace ObHEx zvýšila hladiny CDK1, klíčového mitotického proteinu, který spouští vstup do mitózy tvorbou komplexu s cyklinem B [34]. Navíc všech pět podjednotek komplexu kondenzinu I bylo upregulováno. Tento komplex se skládá ze dvou strukturních podjednotek chromozomů (SMC), SMC2 a SMC4, a tří podjednotek jiných než SMC, NCAPD2, NCAPH a NCAPG. V prometafázi je funkcí komplexu kondenzinu I podporovat typovou kondenzaci chromozomů zavedením pozitivních supercoilů do DNA způsobem závislým na ATP [35]. Kromě toho extrakt upreguloval KNTC1, NUF2 a TRIP13, což jsou tři proteiny spojené s kinetochorem, velkým komplexem, který během prometafáze spojuje centromerický chromatin s mikrotubuly z opačných pólů vřeténka, aby se podpořila segregace sesterských chromatid [ 36,37]. Byla také detekována částečná obnova hladin MCM proteinů. Tyto proteiny jsou jádrem replikačního helikázového komplexu, který odvíjí dvouvláknovou DNA a poskytuje jednovláknová vlákna jako templáty pro DNA polymerázu. Komplex MCM se během S fáze přemění na aktivní helikázu, ale během telofáze je již naložen na chromatin [38,39]. Extrakt také zvýšil hladiny IQGAP3, PBK a DHFR. První, IQGAP3, je důležitým regulátorem mitotické progrese, protože podporuje aktivitu cdk7, která je nezbytná pro aktivaci Cdc2 [40,41]; PBK je kináza aktivní pouze v mitóze; když je fosforylován, interaguje s p53, destabilizuje jej a zeslabuje dráhu poškození DNA [42]; a DHFR je klíčovým enzymem v biosyntéze DNA, jehož hladiny jsou v senescentních lidských fibroblastech výrazně oslabeny [43].

Bio-ortogonální testy také ukázaly schopnost ObHEx částečně zvrátit charakteristické znaky stárnutí, jmenovitě lysozomální aktivitu a zástavu buněčného cyklu. Abychom ověřili, zda obnovení exprese mitotického proteinu pomocí ObHEx znamená reaktivaci buněčného cyklu, provedli jsme experimenty FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) na buňkách SIPS NHDF ošetřených nebo neošetřovaných extraktem. Ukázali, že ObHEx byl schopen snížit frakci buněk blokovaných ve fázi G2 a podpořit jejich opětovný vstup do buněčného cyklu senescentních buněk.

4. Materiály a metody

4.1. Buněčná kultura

Normální lidské dermální fibroblasty (NHDF; Promocell) byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (DMEM; Gibco) doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS; Gibco) a 500 U/ml penicilin-streptomycinu (Gibco) v 95 procentech vzduchu , 5 procent CO2 a zvlhčená atmosféra na 37 ◦C.

4.2. Indukce stresem vyvolaného předčasného stárnutí (SIPS)

Celkem 10 1200 000 NHDF buněk bylo nasazeno do každé z 60mm buněčných kultivačních misek jeden den před jejich inkubací se 100 µM H2O2 při 37 ◦C po dobu 2 hodin [21,22]. Následně byla H202 promyta fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS; Gibco) pro ukončení ošetření a buňky byly pěstovány v normálním médiu po dobu 4 dnů. Pro nesenescentní buňky, použité jako kontrola, byly 2240 000 NHDF buňky nasazeny do každé z 60 mm buněčných kultivačních misek. Experiment byl proveden v 5 biologických replikátech.

4.3. Příprava hydrofilního extraktu Oenothera Biennis (ObHEx).

Extrakt byl připraven v laboratořích Arterra Bioscience SpA [18]. Buněčné kultury byly získány z listů rostlin Oenothera biennis (poskytnuté společností GEEL Floricultura ss) indukcí proliferace meristematických buněk na pevných agarových plotnách až do získaných kalusů. Buňky byly přeneseny do kapalného růstového média (Gamborg B5, doplněné kyselinou 2,4-dichlorfenoxyoctovou (1 mg/l), adeninem (1 mg/l) a kinetinem (0,01 mg/l )) a pěstovány jako suspenzní kultury za orbitálního třepání. Jakmile byly získány kultury přibližně 150 g/l, byly buňky shromážděny a lyžovány v PBS při pH 7,4 za účelem přípravy ve vodě rozpustného extraktu. Po lyofilizaci byl získaný prášek rozpuštěn ve vodě nebo médiu pro kultivaci buněk ve vhodných koncentracích pro testování.

4.4. Ošetření hydrofilním extraktem Oenothera Biennis (ObHEx).

NHDF buňky byly inkubovány po dobu 24 hodin s 0.01 procento (p/v) ObHEx v kompletním médiu. Následně byly buňky třikrát promyty PBS a ošetřeny dalších 24 hodin 0,01 procenta (p/v) ObHEx v médiu bez séra. Poté byly odděleny trypsinizací, centrifugovány při 500 g po dobu 10 minut při 4 °C a dvakrát promyty PBS. Neošetřené kontrolní buňky podstoupily stejné inkubace bez ObHEx.

4.5. Příprava vzorku pro proteomickou analýzu

Pelety byly resuspendovány v 60ul pufru pro radioimunoprecipitační test (RIPA) a lyžovány sonikací. Koncentrace proteinu buněčných lyzátů byla kvantifikována pomocí soupravy DC™ Protein Assay Kit (Biorad; #5000112). S-TrapTM micro spin kolona (Protifi, Huntington, CA, USA) štěpení bylo provedeno na 50 ug buněčných lyzátů podle pokynů výrobce. Stručně, vzorky byly redukovány 20 mM tris(2- karboxyethyl)fosfinem (TCEP) a alkylovány 50 mM thioacetamidem (CAA) po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Poté byla přidána vodná kyselina fosforečná do konečné koncentrace 2,5 procenta a následně byl přidán vazebný pufr S-Trap (90% vodný methanol, 100 mM TEAB, pH 7,1). Směsi byly poté naneseny na kolony S-Trap. Pro důkladnou eliminaci SDS bylo provedeno pět dalších promývacích kroků. Poté byly buněčné lyzáty štěpeny 2,5 ug trypsinu (Promega) při 47 °C po dobu 1 hodiny. Po eluci byly peptidy vakuově vysušeny, resuspendovány ve 2% ACN, 0,1% FA a kvantifikovány pomocí Nanodrop.

4.6. nanoLC-MS/MS identifikace a kvantifikace proteinů

Celkem 400 ng každého vzorku bylo injikováno na nanodesku (Bruker Daltonics, Brémy, Německo) systém vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) spojený s timsTOF Pro (Bruker Daltonics, Brémy , Německo) hmotnostní spektrometr. HPLC separace (rozpouštědlo A: {{30}},1 procenta kyseliny mravenčí ve vodě; rozpouštědlo B: 0,1 procenta kyseliny mravenčí v acetonitrilu) byla prováděna při 250 l/min za použití plněné emitorové kolony (C18, 25 cm × 75 µm 1,6 µm) (Ion Optics, Fitzroy, Austrálie) s použitím gradientové eluce (2 až 13 procent rozpouštědla B během 41 minut; 13 až 20 procent během 23 minut; 20 procent až 30 procent během 5 minut; 30 procent až 85 procent po dobu 5 minut a nakonec 85 procent po dobu 5 minut pro promytí kolony). Hmotnostně spektrometrická data byla získána za použití metody získávání paralelní akumulační sériové fragmentace (diaPASEF) analýzy nezávislé na datech. Nastavení plenek bylo: rozsah hmotnosti od 400 do 1200 Da, rozsah pohyblivosti od 0,60 do 1.43 1/k0, počet okna mobility 1, odhad doby cyklu 1,79 s, hmotnostní kroky na cyklus 32.

4.7. MS zpracování dat a bioinformatická analýza

Analýza dat byla provedena pomocí softwaru DIA-NN (verze 1.8) [44]. Vyhledávání v lidské databázi UniProtKB/Swiss-Prot Homo sapiens (vydání únor 2021, 20 408 záznamů) bylo provedeno pomocí pracovního postupu bez knihoven. Pro tento účel byly zkontrolovány možnosti "FASTA digest pro vyhledávání/generování knihovny bez knihovny" a "Deep learning spectra, RTs a IMs forecast" pro generování prekurzorových iontů. Bylo povoleno maximálně 2 vynechání štěpení trypsinem a maximální variabilní modifikace byla nastavena na 5. Karbamidomethylace (Cys) byla nastavena jako fixní modifikace, zatímco excize proteinu na N-konci methioninu, oxidace methioninu a N-koncová acetylace byly nastaveny jako variabilní modifikace. Rozsah délky peptidu byl nastaven na 7–30 aminokyselin, rozsah náboje prekurzoru 2–4, rozsah m/z prekurzoru 300–1800 a rozsah fragmentových iontů 200–1800. Pro hledání mateřské hmoty a fragmentových iontů byla přesnost odvozena automaticky pomocí DIA-NN a byla nastavena kolem 13 ppm pro každou analýzu. Míra falešného objevu (FDR) na úrovni proteinu a peptidu byla nastavena na 1 procento. Zápas mezi běhy byl povolen. Pro kvantifikační strategii byl použit Robust LC (vysoká přesnost) podle doporučení v dokumentaci k softwaru, zatímco pro ostatní parametry algoritmu byla zachována výchozí nastavení.

Statistická a bioinformatická analýza byla provedena pomocí softwaru Perseus (verze 1.6.15) volně dostupného na webu (přístup 22. června 2021) [45] a R/R Studio a RStudio verze 20 21.09.1 30 (přístup 12. listopadu 2021). Všechny R statistické analýzy byly provedeny pomocí balíčku R stats. Byl použit výstup matice zprávy pg pomocí DIA-NN a intenzity byly log2 transformovány pro statistickou analýzu. Pro statistické srovnání jsme nastavili čtyři skupiny, z nichž každá obsahovala 5 biologických replikátů. Poté jsme filtrovali data, abychom zachovali pouze proteiny s alespoň 3 platnými hodnotami v alespoň jedné skupině. Dále byla data imputována pro vyplnění chybějících datových bodů vytvořením Gaussova rozdělení náhodných čísel se směrodatnou odchylkou 33 procent vzhledem ke směrodatné odchylce naměřených hodnot a 1,8 standardní odchylky posunutím střední hodnoty směrem dolů, aby se simulovalo rozdělení nízkých hodnot. hodnoty signálu. Studentův t-test byl proveden mezi SEN a CTRL FDR < 0,05, S0=0.1, aby se potvrdila přítomnost markerů specifických pro senescenci. Poté, aby se prozkoumalo, zda je rozdíl ve velikosti účinku mezi nepřítomností nebo přítomností léčby stejný pro buňky, u nichž bylo stárnutí indukováno nebo ne, byla zkoumána interakce mezi oběma faktory (tj. indukcí a léčbou) pomocí dvoucestné ANOVA in R. Poté byly hodnoty p získané pro interakci obou faktorů upraveny pro vícenásobné testování pomocí metody Benjamini–Hochberg [46] ke kontrole míry falešného zjišťování (FDR). Nakonec byla provedena post hoc analýza Tukey HSD na proteinech vykazujících hodnotu q < 0,05. Proteomická data hmotnostní spektrometrie byla uložena do konsorcia ProteomeXchange Consortium prostřednictvím partnerského úložiště PRIDE [47] s identifikátorem datové sady PXD034222.

4.8. Barvení ß-galaktosidázou spojené se stárnutím

Aktivita ß-galaktosidázy (SA-ß-gal) spojená se stárnutím byla hodnocena pomocí barvicí soupravy Cell Signaling Technology (#9860). Celkem 1250 000 NHDF buněk/jamka bylo nasazeno do 6-jamkové destičky jeden den před SIPS; zatímco jako kontrola 250 000 buněk/jamka. Po 4 dnech v normálním médiu byly buňky nebo nebyly inkubovány s 0,01 procent (p/v) ObHEx po dobu 48 hodin. Následně byly promyty PBS a ošetřeny fixačním roztokem po dobu 15 minut. Po dvou promytích PBS byly buňky inkubovány s roztokem pro barvení ß-gal (konečné pH 6,0) obsahujícím 5-brom-4-chlor-3-indolyl- -D-galakto -pyranosid (X-Gal) při 37 ◦C v suchém inkubátoru po dobu 20 hodin. Pozitivní buňky jsou modré. Barva je způsobena štěpením X-Gal v galaktóze a 5-Brom-4-chlor-3-indoxylu (X) SA-ß-gal. Indoxyl se oxiduje na 5,50 -dibrom-4,40 -dichlor-indigo, které tvoří intenzivní modrou sraženinu. Procento pozitivních buněk v celkových buňkách bylo hodnoceno spočítáním 100–150 buněk v 5 náhodně vybraných snímcích zachycených mikroskopem pro každý stav. Buňky byly spočítány pomocí softwaru ImageJ. Experiment byl proveden trojmo.

4.9. Fluorescenčně aktivovaná analýza třídění buněk

Celkem {{0}} NHDF buněk/jamka bylo nasazeno do 6-jamkové destičky jeden den před SIPS; zatímco jako kontrola 50 000 buněk/jamka. Po 4 dnech v normálním médiu byly kontrolní a senescentní buňky ošetřeny nebo neošetřovány 0,01 procenta (p/v) ObHEx po dobu 72 hodin. Poté byly buňky inkubovány v přítomnosti 5 ug/ml Hoechst 33342 po dobu 30 minut při 37 °C. Po trypsinizaci a centrifugaci při 500 g po dobu 2 minut byly resuspendovány ve 200 ul PBS. Nakonec byla měřena buněčná fluorescence pomocí BD LSRFortessa Cell Analyzer. Data byla analyzována pomocí softwaru FlowJo v10.8.1. Experiment byl proveden trojmo.

5. Závěry

Zde získané globální profilování proteomů spojené s hlubokým stárnutím poskytuje stovky proteinů deregulovaných pomocí SIPS, které může vědecká komunita využít k dalšímu pochopení stárnutí a k vyhodnocení účinků nových potenciálních modulátorů. Naše práce navíc prokazuje promitotický mechanismus působení ObHEx na senescentní lidské dermální fibroblasty: prostřednictvím zvýšení exprese mitotických proteinů podporuje obnovu proliferace senescentních buněk. Na základě těchto výsledků tedy navrhujeme ObHEx jako silný adjuvans proti stárnutí spojenému se stárnutím kůže.

Příspěvky autora:Konceptualizace, SC, MCM a ICG; metodika, SC, KR, IM, CC (Cerina Chhuon) a ICG; software, KR; vyšetřování, SC, IM, CC (Cerina Chhuon), KT, SF, ADL, IP a CC (Corinne Cordier); zdroje, MCM a ICG; psaní – příprava původního návrhu, SC a ICG; psaní – recenze a úpravy, SC, MCM a ICG Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasí s ní.

Prohlášení o dostupnosti dat:Proteomická data hmotnostní spektrometrie byla uložena do konsorcia ProteomeXchange Consortium prostřednictvím partnerského úložiště PRIDE [47] s identifikátorem datové sady PXD034222 (podrobnosti o účtu recenzenta: uživatelské jméno: recenzent_pxd034222@ebi.ac.uk; heslo: fK0)9Pjv9 .

Poděkování: Tato studie byla podpořena Programma Operativo Complementare Ricerca e Innovazione 2014–2020, Asse I „Capitale Umano“, Azione I.1 „Dottorati Innovativi con caratterizzazione Industriale“. Děkujeme ostatním členům platformy Proteomics Necker Vincent Jung a Joanna Lipecka za jejich neocenitelnou vědeckou podporu a plodné návrhy.

Reference

1. Di Micco, R.; Križanovský, V.; Baker, D.; d'Adda di Fagagna, F. Buněčné stárnutí ve stárnutí: Od mechanismů k terapeutickým příležitostem. Nat. Mol. Cell Biol. 2021, 22, 75–95. [CrossRef] [PubMed]

2. González-Gualda, E.; Baker, AG; Fruk, L.; Muñoz-Espín, D. Průvodce hodnocením buněčného stárnutí in vitro a in vivo. FEBS J. 2021, 288, 56–80. [CrossRef] [PubMed]

3. Sikora, E.; Bielak- ˙Zmijewska, A.; Mosieniak, G. Co je a co není buněčné stárnutí. Postepy Biochem. 2018, 64, 110–118. [CrossRef] [PubMed]

4. Choi, E.-J.; Kil, IS; Cho, E.-G. Extracelulární vezikuly odvozené ze senescentních fibroblastů zeslabují dermální účinek na diferenciaci keratinocytů. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 1022. [CrossRef] [PubMed]

5. Krtolica, A.; Parrinello, S.; Lockett, S.; Desprez, PY; Campisi, J. Senescentní fibroblasty podporují růst epiteliálních buněk a tumorigenezi: Spojení mezi rakovinou a stárnutím. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 2001, 98, 12072–12077. [CrossRef]

6. Wlaschek, M.; Maity, P.; Makrantonaki, E.; Scharffetter-Kochánek, K. Senescence pojivové tkáně a fibroblastů při stárnutí kůže. J. Invest. Dermatol. 2021, 141, 985–992. [CrossRef]

7. Paez-Ribes, M.; González-Gualda, E.; Doherty, GJ; Muñoz-Espín, D. Cílení na senescentní buňky v translační medicíně. EMBO Mol. Med. 2019, 11, e10234. [CrossRef]

8. Soto-Gamez, A.; Demaria, M. Terapeutické intervence pro stárnutí: Případ buněčného stárnutí. Drug Discov. Dnes 2017, 22, 786–795. [CrossRef]

9. Latorre, E.; Birar, VC; Sheerin, AN; Jeynes, JCC; Hooper, A.; Dawe, HR; Melzer, D.; Cox, LS; Faragher, RGA; Ostler, EL; a kol. Modulace exprese sestřihového faktoru malými molekulami je spojena se záchranou před buněčným stárnutím. BMC Cell Biol. 2017, 18, 31. [CrossRef]

10. Munir, R.; Semmar, N.; Farman, M.; Ahmad, NS Aktualizovaný přehled o farmakologických aktivitách a fytochemických složkách pupalky dvouleté (rod Oenothera). Asijský Pac. J. Trop. Biomed. 2017, 7, 1046–1054. [CrossRef]

11. Timoszuk, M.; Bielawska, K.; Skrzydlewska, E. Pupalka dvouletá (Oenothera biennis) Biologická aktivita závislá na chemickém složení. Antioxidanty 2018, 7, 108. [CrossRef]

12. Lee, SY; Kim, CH; Hwang, BS; Choi, K.-M.; Yang, I.-J.; Kim, G.-Y.; Choi, YH; Park, C.; Jeong, J.-W. Ochranné účinky Oenothera Biennis proti oxidačnímu stresu vyvolanému peroxidem vodíku a buněčné smrti v kožních keratinocytech. Life 2020, 10, 255. [CrossRef]

13. Granica, S.; Czerwi ´nska, ME; Piwowarski, JP; Ziaja, M.; Kiss, AK Chemické složení, antioxidační a protizánětlivá aktivita extraktů připravených z nadzemních částí Oenothera Biennis L. a Oenothera Paradoxa Hudziok získaných po kultivaci semen. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 801–810. [CrossRef]

14. Fecker, R.; Buda, V.; Alexa, E.; Avram, S.; Pavel, IZ; Muntean, D.; Cocan, I.; Watz, C.; Minda, D.; Dehelean, CA; a kol. Fytochemický a biologický screening Oenothera Biennis L. Hydroalkoholický extrakt. Biomolekuly 2020, 10, 818. [CrossRef]

15. Schäfer, L.; Kragballe, K. Suplementace pupalkovým olejem u atopické dermatitidy: Vliv na mastné kyseliny v neutrofilech a epidermis. Lipidy 1991, 26, 557–560. [CrossRef]

16. Barbulová, A.; Apone, F.; Colucci, G. Rostlinné buněčné kultury jako zdroj kosmetických aktivních složek. Kosmetika 2014, 1, 94–104. [CrossRef]

17. Caesar, LK; Cech, NB Synergie a antagonismus v extraktech přírodních produktů: Když se 1 plus 1 nerovná 2. Nat. Prod. Rep. 2019, 36, 869–888. [CrossRef]

18. Ceccacci, S.; De Lucia, A.; Tito, A.; Tortora, A.; Falanga, D.; Arciello, S.; Ausanio, G.; Di Cicco, C.; Monti, MC; Apone, F. Výtažek z buněčných kultur z Oenothera Biennis vybavený aktivitou proti stárnutí pokožky zlepšuje mechanické vlastnosti buněk. Metabolites 2021, 11, 527. [CrossRef]

19. Farwick, M.; Köhler, T.; Schild, J.; Mentel, M.; Maczkiewitz, U.; Pagani, V.; Bonfigli, A.; Rigano, L.; Bureik, D.; Gauglitz, GG pentacyklické triterpeny od společnosti Terminalia Arjuna vykazují četné výhody na stárnoucí a suchou pleť. Skin Pharmacol. Physiol. 2014, 27, 71–81. [CrossRef]

20. Bonte, F.; Dumas, M.; Chaudagne, C.; Meybeck, A. Vliv kyseliny asijské, kyseliny madecassové a Asiaticosidu na syntézu lidského kolagenu I. Planta Med. 1994, 60, 133–135. [CrossRef]

21. Chowdhary, S. Účinky oxidačního stresu na indukci stárnutí u lidských fibroblastů. J. South Carol. Akad. Sci. 2018, 16, 2.

22. Wang, Z.; Wei, D.; Xiao, H. Metody indukce buněčného stárnutí pomocí oxidačního stresu. Metody Mol. Biol. 2013, 1048, 135–144. [PubMed]

23. Hildebrand, DG; Lehle, S.; Borst, A.; Haferkamp, ​​S.; Essmann, F.; Schulze-Osthoff, K. -Fukosidáza jako nový pohodlný biomarker pro buněčnou stárnutí. Buněčný cyklus 2013, 12, 1922–1927. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, BY; Han, JA; Im, JS; Morrone, A.; Johung, K.; Goodwin, EC; Kleijer, WJ; DiMaio, D.; Hwang, ES Beta-galaktosidáza spojená se stárnutím je lysozomální beta-galaktosidáza. Stárnoucí buňka 2006, 5, 187–195. [CrossRef] [PubMed]

25. Gorgoulis, V.; Adams, PD; Alimonti, A.; Bennett, DC; Bischof, O.; Bishop, C.; Campisi, J.; Collado, M.; Evangelou, K.; Ferbeyre, G.; a kol. Buněčné stárnutí: Definování cesty vpřed. Cell 2019, 179, 813–827. [CrossRef]

26. Matsuoka, S.; Ballif, BA; Smogorzewska, A.; McDonald, ER; Hurov, KE; Luo, J.; Bakalarski, CE; Zhao, Z.; Solimini, N.; Lenenthal, Y.; a kol. Analýza substrátu ATM a ATR odhaluje rozsáhlé proteinové sítě reagující na poškození DNA. Věda 2007, 316, 1160–1166. [CrossRef]

27. Zhang, R.; Chen, W.; Adams, PD Molekulární disekce tvorby heterochromatinových ložisek spojených se stárnutím. Mol. Cell Biol. 2007, 27, 2343–2358. [CrossRef]

28. LaBaer, ​​J.; Garrett, MD; Stevenson, LF; Slingerland, JM; Sandhu, C.; Chou, HS; Fattaey, A.; Harlow, E. Nové funkční aktivity pro rodinu inhibitorů CDK P21. Genes Dev. 1997, 11, 847–862. [CrossRef]

29. Scholzen, T.; Gerdes, J. The Ki-67 Protein: From the Known and the Unknown. J. Cell Physiol. 2000, 182, 311–322. [CrossRef]

30. Passos, JF; von Zglinicki, T. Metody buněčného třídění mladých a senescentních buněk. Metody Mol. Biol. 2007, 371, 33–44.

31. Dai, Y.; Tang, H.; Pang, S. Zásadní role fosfolipidů ve stárnutí a regulaci délky života. Přední. Physiol. 2021, 12, 1998. [CrossRef]

32. Dashty, M. Hedgehog signalizační cesta je spojena s nemocemi souvisejícími s věkem. J. Diabetes Metab. 2014, 5, 2. [CrossRef]

33. Wang, D.; Lu, P.; Liu, Y.; Chen, L.; Zhang, R.; Sui, W.; Dumitru, AG; Chen, X.; Wen, F.; Ouyang, H.-W.; a kol. Izolace živých předčasně senescentních buněk pomocí technologie FUCCI. Sci. Rep. 2016, 6, 30705. [CrossRef]

34. Qian, J.; Beullens, M.; Huang, J.; De Munter, S.; Lesage, B.; Bollen, M. Cdk1 objednává mitotické události prostřednictvím koordinace fosfatázového přepínače spojeného s chromozomem. Nat. Commun. 2015, 6, 10215. [CrossRef]

35. Kong, M.; Cutts, EE; Pan, D.; Beuron, F.; Kaliyappan, T.; Xue, C.; Morris, EP; Musacchio, A.; Vannini, A.; Greene, EC Human Condensin I a II řídí rozsáhlé zhutňování DNA vázané na nukleozomy závislé na ATP. Mol. Buňka 2020, 79, 99–114.e9. [CrossRef]

36. Kops, GJPL; Gassmann, R. Crowning the Kinetochore: The Fibrous Corona in Chromosome Segregation. Trends Cell Biol. 2020, 30, 653–667. [CrossRef]

37. Ma, HT; Poon, RYC TRIP13 Funkce při zřizování kontrolního bodu sestavy vřetena doplňováním O-MAD2. Cell Rep. 2018, 22, 1439–1450. [CrossRef]

38. Kuipers, MA; Staševič, TJ; Sasaki, T.; Wilson, KA; Hazelwood, KL; McNally, JG; Davidson, MW; Gilbert, DM Vysoce stabilní nanášení proteinů Mcm na chromatin v živých buňkách vyžaduje replikaci, aby se uvolnilo. J. Cell Biol. 2011, 192, 29–41. [CrossRef]

39. Meng, Q.; Gao, J.; Zhu, H.; On, H.; Lu, Z.; Hong, M.; Zhou, H. Proteomická studie sériově pasážovaných lidských kožních fibroblastových buněk odhaluje down-regulaci proteinů komplexu chromozomového kondenzinu zapojených do replikativního stárnutí. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2018, 505, 1112–1120. [CrossRef]

40. Larochelle, S.; Pandur, J.; Fisher, RP; Salz, HK; Suter, B. Cdk7 je nezbytný pro mitózu a pro in vivo aktivitu kinázy aktivující Cdk. Genes Dev. 1998, 12, 370–381. [CrossRef]

41. Leone, M.; Cazorla-Vázquez, S.; Ferrazzi, F.; Wiederstein, JL; Gründl, M.; Weinstock, G.; Vergarajauregui, S.; Eckstein, M.; Krüger, M.; Gaubatz, S.; a kol. IQGAP3, cíl YAP, je nezbytný pro správný průběh buněčného cyklu a stabilitu genomu. Mol. Cancer Res. 2021, 19, 1712–1726. [CrossRef] [PubMed]

42. Nandi, AK; Ford, T.; Fleksher, D.; Neuman, B.; Rapoport, AP Atenuation of DNA Damage Checkpoint pomocí PBK, nové mitotické kinázy, zahrnuje interakci protein-protein s tumor supresorem P53. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007, 358, 181–188. [CrossRef] [PubMed]

43. Dobrý, L.; Dimri, praktický lékař; Campisi, J.; Chen, KY Regulace exprese genu dihydrofolát reduktázy a složek E2F v lidských diploidních fibroblastech během růstu a stárnutí. J. Cell Physiol. 1996, 168, 580–588. [CrossRef]

44. Demichev, V.; Messner, CB; Vernardis, SI; Lilley, KS; Ralser, M. DIA-NN: Neuronové sítě a korekce rušení umožňují hluboké pokrytí proteomem při vysoké propustnosti. Nat. Metody 2020, 17, 41–44. [CrossRef]

45. Tyanova, S.; Temu, T.; Sinitcyn, P.; Carlson, A.; Hein, MY; Geiger, T.; Mann, M.; Cox, J. Výpočetní platforma Perseus pro komplexní analýzu dat (Prote)Omics. Nat. Metody 2016, 13, 731–740. [CrossRef]

46. ​​Benjamini, Y.; Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: Praktický a výkonný přístup k vícenásobnému testování. JR Stat. Soc. Ser. B (Methodol.) 1995, 57, 289–300. [CrossRef]

47. Perez-Riverol, Y.; Bai, J.; Bandla, C.; García-Seisdedos, D.; Hewapathirana, S.; Kamatchinathan, S.; Kundu, DJ; Prakash, A.; Frericks-Zipper, A.; Eisenacher, M.; a kol. Zdroje databáze PRIDE v roce 2022: Centrum pro proteomické důkazy založené na hmotnostní spektrometrii. Nucleic Acids Res. 2021, 50, D543–D552. [CrossRef]

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】