Předchozí učení o strachu umožňuje rychlou asimilaci nových vzpomínek na strach přímo do kortikálních sítí, část 3

Experimentální design

Reprodukovatelnost dat byla hodnocena s různými replikáty (tabulka S1). První experimenty inaktivace CNQX v Te2 (obr. 1A–1C) byly provedeny ve větším počtu replikátů, protože to byly první experimenty, které jsme provedli a sloužily k testování hlavní hypotézy naší studie. Zvířata byla a priori zařazena do různých behaviorálních skupin způsobem vyváženým podle hmotnosti. Samci ze stejného chovu byli náhodně rozděleni do každé experimentální skupiny. Nejprve jsme se zabývali hlavní hypotézou naší studie, tj. kortikální inaktivace může odlišně ovlivnit konsolidaci nové strachové paměti u experimentálně naivních potkanů ​​a u zvířat, která se naučila předchozí událost strachu.

Samci mají extrémně silnou paměť, protože mají silnější instinkt přežití a touhu po rozmnožování. Zvířata přežívající ve volné přírodě si musí pamatovat spoustu geografických informací, druhy potravy, stopy predátorů a umístění členů skupiny, aby se lépe přizpůsobila prostředí a chránila život.

Například lví samci si potřebují pamatovat stav celého území, členské vztahy a umístění konkurentů, aby chránili území a své postavení. Samci zeber si musí pamatovat umístění vodních zdrojů a potravy na pastvinách, aby přežili a rozmnožili se. Společnost vyrábějící limonády kdysi zveřejnila reklamu, která ukazovala, že samec ledního medvěda si pamatuje potápěče a jeho jedinečnou vůni, aby ho mohl identifikovat, až ho příště uvidí.

Proto samci potřebují mít silnou paměť, pokud jde o ochranu svého území, poskytování dostatku potravy a reprodukci potomstva. To z nich také dělá důležité předměty v lidském výzkumu, například při zkoumání nemocí, jako je zhoršení paměti a Alzheimerova choroba.

V lidském světě se můžeme inspirovat i vzpomínkou na zvířecí samce. Neustálé vystavování se novým věcem, neustálé učení a myšlení může zlepšit naši paměť a přizpůsobivost a zlepšit naši životní úroveň a efektivitu práce. Učme se proto od samců, nadále shromažďujeme znalosti a zkušenosti, mějme silné instinkty pro přežití a reprodukční touhy a vytvářejme lepší budoucnost. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť. Cistanche deserticola může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola je tradiční čínský léčivý materiál s mnoha unikátními účinky, z nichž jedním je zlepšení paměti. Účinnost mletého masa vychází z různých aktivních složek, které obsahuje, včetně kyselin, polysacharidů, flavonoidů atd. Tyto složky mohou podporovat zdraví mozku různými způsoby.

Klikněte na možnost poznat způsoby, jak zlepšit funkci mozku

V případě statistických rozdílů mezi těmito skupinami jsme nakonec provedli další kontrolní skupiny pomocí injekce fyziologického roztoku. Podobný přístup byl aplikován na optogenetické experimenty, kde AAV-kontrolní skupina byla provedena až poté, co byly zjištěny statistické rozdíly mezi naivními a dříve trénovanými potkany. Tyto harmonogramy pokusů nám umožnily vyhnout se zbytečným kontrolním skupinám a používání nepotřebných zvířat, což je klíčový problém evropské a italské legislativy o pokusech na zvířatech (princip 3 Rs).

Behaviorální postupy

Všechny experimenty byly prováděny během denní fáze světla (8:00 až 16:00). Zvířata byla přepravována jednotlivě ze zařízení do experimentálních místností v různých malých průhledných kbelících v závislosti na požadavcích experimentu.

Sluchový trénink: První behaviorální sezení. Sluchově podmíněná zvířata (CS1-CS2). V této skupině byly krysy opatrně odebrány z jejich domácí klece a přeneseny z místnosti pro ustájení do zvukotěsné místnosti. Jakmile tam byla, byla zvířata umístěna do kondicionačního zařízení sestávajícího z obdélníkové černé klece (35 × 40 cm) vybavené mřížkou z nerezových tyčí (1 cm v průměru, vzdálená od sebe 1,5 cm) připojenou k zařízení pro podávání šoku.

Krysy byly ponechány v klidu po dobu 1 minuty. Po této době bylo aplikováno 7 podmíněných stimulů (CS) skládajících se z čistého tónu o frekvenci 15 kHz (každý o délce 15 s, 80 dB, 36s interval pokusů). Poslední 1 s každého tónu byla spárována s bolestivým US (0,5 mA, 1 s). Na konci kondičního sezení byly krysy přeneseny zpět do jejich domácí klece.

Zvířata pouze pro šok (šok-CS2). V této skupině byly krysy podobně umístěny do stejného kondicionačního zařízení. Bezprostředně poté byla každá krysa vystavena 7-šokům do nohou (1 s, 0,5 mA) jeden bezprostředně po druhém. Na konci stimulace byla zvířata přivedena zpět do jejich domovské klece. Doba trvání v klimatizační kleci byla méně než 9 sekund. Předchozí studie ukázaly, že tento postup umožňuje vyhnout se asociativním procesům mezi bolestivými podněty a smyslovými podněty [29,30].

Zvířata podmíněná pachem strachem (zápach-CS2). V této skupině byly krysy umístěny do stejné obdélníkové černé klece používané ve výše uvedených experimentálních skupinách a připojeny k zařízení pro podávání šoku. Krysy byly ponechány v klidu po dobu 2 minut. Po této době bylo podáno 7 CS sestávajících z vanilkových vůní (každý o délce 10 s, zkušební interval 24 s). Poslední 1 s každého zápachu byla spárována s bolestivým US (0,5 mA, 1 s). Kondicionační modul byl umístěn blízko zdroje ventilace, aby se zabránilo přetrvávání dodaných stimulů po jejich posunutí. Klec byla zajištěna horní mřížkou. Pachy byly prezentovány pomocí průtokového zřeďovacího olfactometru. Čistý vzduch (1,5 l/min) byl nasměrován do solenoidového ventilu, který, když byl uveden do provozu, propouštěl vzduch do 15 ml lahvičky obsahující 10 ml vanilkové vůně.

Zvířata pouze s tónem (Tone-CS2). Potkani v této skupině byli umístěni do stejné černé klece a byl jim prezentován tón 15-kHz (7 podnětů, trvání 15 s, 36 s ITI) dodávaný v nepřítomnosti USA.

Předexponovaná zvířata (Tone-CS1-CS2). Potkani byli umístěni do klimatizační klece a o 1 minutu později jim byl 20krát prezentován pouze tón 15-kHz a o 24 hodin později byl stejný tón spárován s tím, že USA se staly CS1.

Zvířata podmíněná strachem z bílého šumu (WN-CS2). V této skupině byly krysy umístěny do obdélníkové černé klece a ponechány v klidu po dobu 1 minuty. Po této době bylo podáno 7 CS sestávajících z WN (každý o délce 15 s, 75 dB, 36 s interval mezi pokusy). Poslední 1 s každého tónu byla spárována s bolestivým US (0.5 mA, 1 s). Na konci kondičního sezení byly krysy přeneseny zpět do jejich domácí klece.

Učení sluchového strachu: Druhý trénink chování. Dva týdny po postupech popsaných ve výše uvedeném odstavci byla zvířata trénována v jiném jiném úkolu podmiňovat sluchový strach. Krysy byly umístěny do standardního boxu na stahování kůže, jako v naší předchozí práci [10], a ponechány v klidu po dobu 2 minut. Po uplynutí této doby bylo dodáno 7 CS složených z čistých tónů o frekvenci 3 kHz (každý o délce 8 s, 80 dB, 22 s interval mezi pokusy). Poslední 1 s každého tónu byla spárována s bolestivým US (0,5 mA, 1 s). Na konci kondičního sezení byly krysy přeneseny zpět do jejich domácí klece.

Uchování paměti strachu. Uchování paměti sluchového strachu nedávno získané v CS2 (3 kHz) bylo testováno o 4 dny později. U optogenetických experimentů byl test nedávné paměti proveden laserem 24 hodin po CS2-učení USA analogicky k časovému intervalu, ve kterém jsme provedli kortikální inaktivaci podáním CNQX (tj. 24 hodin po výcvik). Potkani byli navyknutí na jiný přístroj, než jaký se používá pro kondicionování, a byli umístěni do jiné místnosti, aby se vyhnuli podmíněnému chování strachu vůči kontextovým podnětům [10,62].

Nová aparatura sestávala z průhledné plastové klece s černě lakovanou stranou uzavřenou v odhlučněné skříni vybavené odtahovým ventilátorem, který eliminoval zapáchající vzduch z krytu a poskytoval hluk pozadí 60 dB. Zvířatům bylo umožněno prozkoumávat klec po dobu 5 minut denně během habituačního sezení. V den testu uchování paměti strachu, po 2 minutách volného zkoumání, jsme dodali 4 CS2 3 kHz (8 s–22 ITI), po kterých nenásledovala žádná US.

Pokud to experimentální požadavek vyžadoval, krysy byly poté testovány na uchování vzdálené paměti strachu, získané 2 týdny před druhým testem podmiňování sluchového strachu. Za tímto účelem byla 7 dní po testu uchování paměti strachu na tón 3-kHz zvířata umístěna do nového prostředí (černobílá pruhovaná klec) a poté jim byl předložen tón 15-kHz. Čtyři tóny byly prezentovány v 36s intervalech.

Kontextový trénink: První behaviorální sezení. Kontextová skupina podmiňující strach (CtxA-CtxB). V této skupině byly krysy opatrně vyjmuty z jejich domácí klece, umístěny do kbelíku a přeneseny z ustájovací místnosti do zvukotěsné místnosti. Jakmile tam byli, byla zvířata umístěna do kondicionačního zařízení sestávajícího z výše uvedené obdélníkové černé klece, vybavené mřížkou z nerezových tyčí připojenou k zařízení pro podávání šoku. Krysy byly ponechány v klidu po dobu 1 minuty. Po této době bylo podáno 5 US (0,5 mA, 1 s) v 51s časových intervalech. Na konci sezení byla zvířata přivedena zpět do jejich domácí klece.

Skupina pouze pro šok (shock-CtxB). Jakmile byly krysy umístěny do klimatizačního zařízení, okamžitě dostaly jeden po druhém 5-šoky do nohou (1 s, 0,5 mA). Doba trvání v klimatizační kleci byla méně než 7 sekund. Předchozí studie ukázaly, že tento postup umožňuje vyhnout se asociativním procesům mezi bolestivými podněty a smyslovými podněty [29,30].

Skupina pouze pro šok (shock-CtxB). Jakmile byly krysy umístěny do klimatizačního zařízení, okamžitě dostaly jeden po druhém 5-šoky do nohou (1 s, 0,5 mA). Doba trvání v klimatizační kleci byla méně než 7 sekund. Předchozí studie ukázaly, že tento postup umožňuje vyhnout se asociativním procesům mezi bolestivými podněty a smyslovými podněty [29,30].

Nové kontextové podmiňování strachu a nedávné uchování paměti strachu. Dva týdny po procedurách popsaných ve výše uvedeném odstavci byly všechny skupiny trénovány, aby spojily nové kontextové prostředí (modul skinner box, umístěný v jiné místnosti) s bolestivým US (0,5 mA, 1 s) . Každé zvíře bylo umístěno do nové komory a ponecháno v klidu po dobu 2 minut. Poté byla exponována 5 US oddělenými intervaly 30 s.

Uchování kontextové paměti strachu bylo testováno 4 dny po proceduře podmiňování strachu tak, že se krysy znovu umístily do komory Skinnerova boxu na 3 minuty. U optogenetických experimentů byl test nedávné paměti proveden laserovým podáním 24 hodin po učení CtxB-US analogicky k časovému intervalu, ve kterém jsme prováděli kortikální inaktivaci podáním CNQX (tj. 24 hodin po tréninku). Pokud to vyžadovala experimentální poptávka, krysy byly poté testovány na uchování vzdálené paměti strachu uvedením zvířat do kontextu spárovaného s USA 2 týdny před novým spojením.

Zvířata byla přenesena ve 2 různých kbelících do kondicionačních komor podle různých kontextových postupů.

Zmrazovací opatření. Ve všech experimentálních postupech bylo hodnocení retence paměti strachu stanoveno jako mrazivá reakce [10], analyzovaná jako úplná absence somatické mobility s výjimkou respiračních pohybů. U každého zvířete byla doba (v sekundách) strávená zmrazením měřena offline 2 nezávislými pozorovateli, kteří byli slepí vůči skupinám zvířat.

Chirurgické zákroky

Za účelem podání vybraných látek do cílových míst byly krysy anestetizovány isofluranem: Indukce byla provedena při 4 % [obj./obj.] ve 2 l/min lékařského vzduchu a prodloužena na kontinuální expozici při 2 % [obj./obj.]) když byly krysy namontovány do stereotaxického zařízení.

Byl proveden řez lebky a byly vyvrtány malé otřepy, které umožnily proniknutí 28-infuzní jehly. K podávání látek byla použita stříkačka 10-ul Hamilton namontovaná na infuzní pumpě. Po infuzích byla jehla ponechána na místě další 3 minuty. Řez byl poté uzavřen nerezovými svorkami na rány a zvířeti byla podána subkutánní injekce analgetika/protizánětlivého ketoprofenu (2 mg/kg tělesné hmotnosti) a zvíře bylo udržováno v teple a pod pozorováním, dokud se neprobralo z anestezie.

Stejně jako v předchozích studiích [10,32–34] bylo kanylování zvířat zbytečné, přičemž účinné látky byly podávány přímo stereotaxicky. Tento postup je výhodný, protože je zabráněno chirurgickému traumatu spojenému s výkonem permanentní kanylace, čímž je trauma omezeno na jediný průnik jehly [10,32–34]. Celková anestezie totiž významně neovlivňuje konsolidaci paměti [10,32–34]. Aby bylo zajištěno, že načasování podávání sloučenin souvisejících s testem učení bylo přesné, takže krysy dostaly vybrané sloučeniny přibližně 1 hodinu a přibližně 1 den po tréninku, byla indukována anestezie isofluranem 5 minut před načasováním plánované injekce, např. v 55. min u potkanů ​​léčených 60 minut po tréninku a 23 hodin a 55 minut u zvířat, kterým byla podána injekce 24 hodin po tréninku. Každý potkan byl kondicionován a poté provozován samostatně. Zvířata patřící do různých behaviorálních skupin byla manipulována prokládaným způsobem.

Selektivní inhibitor AMPA/kainát glutamátových receptorů CNQX ({{0}}kyano-7-nitrochinoxalin-2,3-dion) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] byl rozpuštěn ve sterilním fyziologickém roztoku (NaCl, 0,9 %) a upraven na pH 7,4 pomocí HCl. Inhibitor syntézy proteinů anisomycin (Merck, 125 ug/ul) byl rozpuštěn v ekvimolární HC1, zředěn sterilním fyziologickým roztokem a pH bylo upraveno na 7,4 pomocí NaOH. Sterilní fyziologický roztok (0,9% NaCl) byl použit jako kontrola vehikula. Tyto látky byly bilaterálně injikovány rychlostí 0,1 ul/min a objemem 0,5 ul na místo v následujících stereotaktických souřadnicích převzatých z Paxinos a Watson atlas [26], s kortikálním polem Te2 podle Zilleského atlasu [25]:

Sekundární sluchová kůra (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: -6.

Přední cingulární kůra (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: -2,2.

Objem injekce (0,5 ul na místo) byl vybrán na základě předchozích studií, kde byly aktivní sloučeniny injikovány do Te2 [10,34] a ACC [55,63] u dospělých potkanů.

K inaktivaci dorzálního hipokampu byly injikovány aktivní sloučeniny v objemu 0,6 ul na místo v následujících stereotaktických souřadnicích:

Dorzální hipokampus: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Ireverzibilní léze dorzálního hipokampu byly vyvolány podáváním NMDA (Tocris, 18 ug/ul, rozpuštěného ve sterilním fyziologickém roztoku, 0,4 ul na místo) rychlostí 0,1 ul/ min v bodech na výše uvedených souřadnicích. Stejné souřadnice byly použity pro kontroly s injekcí fyziologického roztoku a zvířata s falešnou operací.

Red Retrobeads (Lumafluor, 1:2 ředění ve fyziologickém roztoku, 0,6 ul) byly injikovány v BLA podle následujících souřadnic: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8.3.

Na konci experimentů byly histologicky ověřeny stopy jehly v případě injekcí CNQX, anisomycinu nebo fyziologického roztoku nebo rozšíření lézí v případě injekcí NMDA. Krysy byly hluboce anestetizovány a intrakardiálně perfundovány 4% formaldehydem. Jejich mozky byly nařezány na 30 μm na kryostatu. Sériové řezy barvené Nissl byly připraveny konvenčním postupem a řezy byly histologicky ověřeny pod mikroskopem zvětšeným 2,5x.

Optogenetické experimenty

Injekce viru. Adeno-asociovaný virus AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cherry a kontrolní vektor AAV5:CaMKII -cherry byly získány z University of North Carolina Vector Core (Chapel Hill, Severní Karolína, Spojené státy americké). Větný titr viru byl 5:8 Virový titr byl 5,8 × 10^12 vg/ml pro oba viry. Použití promotoru CaMKII umožňuje expresi transgenu podporující pyramidální neurony. Viry byly umístěny v mrazáku o teplotě -80˚C. Virové infuze zaměřené na Te2 nebo ACC byly prováděny ve výše uvedených stereotaxických souřadnicích v objemech 0,5 ul pro každý otvor. Virus byl injikován rychlostí 0,1 ul/min a jehla byla ponechána na místě dalších 5 minut. Virové injekce byly provedeny 4 týdny před optogenetickými experimenty.

Osvětlení.

Optická vlákna (Plexon, jádro 200/230 μm; délka 10 mm) byla implantována bilaterálně do BLA (AP=−2,8, L=± 5,4, V=−8,2 mm od bregmy). Optogenetická inhibice projekcí Te2 do BLA nebo ACC projekcí do BLA byla získána použitím systému PlexBright Optogenetic Stimulation System spojeného s laserovou diodou (Laserglow Technologies). Vzniká žluté světlo (589 nm) a prochází optickým vláknem. Hustota výkonu odhadnutá na špičce optického vlákna byla 10 až 15 mW pro osvětlení promítacích míst. Během uchování paměti strachu byla emise světla zahájena 4 s před začátkem tónu, přetrvávala po celou dobu tónu a byla zastavena 4 s po tónové odchylce. Zvířata patřící do kontextových skupin podmiňujících strach dostávala světelnou stimulaci během celého zkoumání kontextu (3 minuty). Potkani byli seznámeni s propojovacím kabelem 2 dny před zkouškou zachování paměti.

Imunohistochemie. Po dokončení optogenetických experimentů byly krysy hluboce anestetizovány a intrakardiálně perfundovány 4% PAF, aby se zjistila difúze viru. Mozky byly vypreparovány, skladovány přes noc při 4 °C a nakonec přeneseny do 30% sacharózy. Koronální řezy (30 μm) byly nařezány na kryostatu a shromážděny v PBS. Volně plovoucí řezy byly inkubovány v blokovacím roztoku po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Poté byly inkubovány v primární monoklonální myší protilátce anti mCherry (ředění 1:500, Abcam) v blokovacím roztoku přes noc při teplotě místnosti. Následně byly řezy promyty PBS a inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti se sekundární fluorescenční AlexaFluor-568 anti-myší protilátkou (1:600, Invitrogen) zředěnou v PBS. Řezy byly promyty v PBS, upevněny montážním médiem obsahujícím DAPI (Vector) a překryty krycím sklíčkem.

Podobně byly odebrány mozky krys, které podstoupily injekce NMDA. Volně plovoucí řezy byly po několika propláchnutích inkubovány s primární monoklonální myší anti-Neun (1:1, 000 ředění, Merck) v blokovacím roztoku přes noc při teplotě místnosti. Následně byly řezy promyty PBS a inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s biotinylovanou koňskou anti-myší protilátkou (1:200 ředění, vektor). Komplex avidin-biotin (komplex ABC 1:100, vektor, 2 hodiny a polovina inkubace) byl navázán na diaminobenzidin (0,03 %, Merck), aby se obarvil Neun. Řezy byly poté opláchnuty v PBS a přeneseny na želatinou potažená sklíčka, dehydratována a překryta krycím sklíčkem.

Sekce Te2 krys s injekcí retro perliček podstoupily inkubaci s primární polyklonální králičí anti-Fos protilátkou (1:2, 000, Cell Signaling) v blokovacím roztoku přes noc při teplotě místnosti. Následně byly řezy promyty PBS a inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s anti-králičí Alexa 488 (1:1, 000, Invitrogen, v PBS). Nakonec byly imunoznačené řezy promyty v PBS, upevněny na želatinou potažená sklíčka a pokryty upevňovacím médiem doplněným DAPI.

Mikroskopie

Značení mCherry bylo zkoumáno pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss Airyscan: Byly použity dva lasery (405 a 561 nm), každý odpovídající špičkovému emisnímu spektru pro DAPI (Nissl barvivo pro buněčná jádra) a Alexa 568 (mCherry ), resp. Pro analýzu difúze viru v místech vpichu byly získány mikrofotografie Te2 a ACC jako mozaikové obrazy (každý jednotlivý byl pořízen pomocí 10× objektivu). Terminály axonů do BLA byly analyzovány pomocí 40× objektivu jako sady z 10 řezů, vzdálených od sebe 1 μm (159 μm čtverečních; frakce zvětšení, 1,0).

U zvířat s injekcí retroperliček, která podstoupila imunoznačení cFos, byly snímky pořízeny při 40násobném zvětšení (159 μm čtverec; frakce přiblížení, 1.0) pomocí 3 různých laserů, což odpovídá špičkovému emisnímu spektru pro DAPI (Nissl barvivo pro buněčná jádra), AlexaFluor 488 (cFos), respektive Texas Red (Retrobeads). Sekce 0,7 μm byly získány podél 10- μm z-stacku. Počet jader exprimujících cFos, značených perliček a dvojitě pozitivních (cFos+ perličky značené) byl kvantifikován pro každé zvíře v oblasti Te2 na předozadních souřadnicích od 6,7 do 7,3 mm od bregmatu [10]. Data byla poté zprůměrována, aby se získal průměr pro každé zvíře a výsledky byly statisticky porovnány. Obrazy řezů s DAB barvením Neun byly analyzovány pomocí softwaru Neurolucida připojeného k mikroskopu pomocí barevné CCD kamery [10].

Analýza dat a kritéria vyloučení

n pro každou skupinu bylo stanoveno a priori podle našich předchozích studií [10,16,17], dříve publikovaných prací v oboru (viz odkazy na ACC [6,22,55] a Te2 [10,59]), a prostřednictvím odhadů G-výkonu podle následující tabulky (Tabulka 1):

Pro každou analýzu jsme odhadli konečný průměrný počet 8 až 10 zvířat pro každou skupinu. Skupiny byly spuštěny s vnitřními kontrolami ve stejné experimentální relaci (tabulka S1). Vzhledem k variabilitě chirurgických a behaviorálních postupů jsme a priori zahrnuli větší počet experimentálních subjektů (až o 15 % více), kteří v některých případech splnili experimentální kritéria a byli zařazeni, čímž jsme se vyhnuli svévolnému vyloučení. V případě hipokampálních studií, abychom vyhodnotili účinky injekcí NMDA a CNQX v různých časových intervalech, jsme vyrovnali celkový počet kontrolních zvířat mezi krysami s vehikulem a krysami s falešnou operací v různých skupinách.

Behaviorální analýza, histologické kontroly a počty buněk byly prováděny naslepo. Zvířata s neadekvátní lokalizací dráhy jehly nebo lézí v případě NMDA-ireverzibilních lézí byla vyloučena z analýzy dat (tabulka S1). Ve farmakologických studiích jsme vyloučili 57 zvířat z celkového počtu 465 zvířat kvůli nesprávnému umístění jehly (22/255 pro Te2, 31/179 pro ACC a 4/31 pro hipokampus). Ve sledovacích studiích na 21 zvířatech jsme eliminovali 3 subjekty, u kterých injekce retrokuliček minula BLA. Ve studiích optogenetiky Te2 na celkem 30 zvířatech jsme vyloučili 1 potkana, protože umístění optických vláken nebylo nad cílovou oblastí, 1 potkana. Koneckonců, virus chyběl u Te2 au 2 potkanů, protože difúze viru byla v tomto pořadí menší než 4,7 % a 5,3 % plochy Te2 v místech vpichu. U krys zahrnutých do statistické analýzy byla minimální difúze viru 39,6 % na přední stereotaxické souřadnici a 50,2 % na zadní stereotaktické souřadnici.

Podobně byly v experimentech ACC optogenetiky u celkem 32 zvířat vyřazeny 2 krysy, protože umístění optických vláken nebylo nad cílovou oblastí. Dva potkani byli vyloučeni, protože virus v ACC chyběl, 1 zvíře, protože virus byl v přilehlém sekundárním motorickém kortexu, a 1 potkan, protože difúze viru byla menší než 2,3 % plochy ACC v místech vpichu. U zbývajících potkanů ​​byla minimální difúze viru 33,3 % na přední stereotaxické souřadnici a 42,2 % na zadní souřadnici.

Ve studiích lézí NMDA se léze většinou zaměřovaly na oblast CA1 dorzálního hipokampu. Minimální (červená) a maximální extenze (růžová) hipokampálních lézí po celé ploše dorzálního hipokampu byly v tomto pořadí 23,2 % a 53,5 % na přední stereotaktické souřadnici a 28,3 % a 62,3 % na zadní souřadnici. Z celkového počtu 73 zvířat byly 4 krysy vyřazeny, protože léze chyběla, zatímco další 3 zvířata byla vyřazena, protože rozsah lézí byl menší než 5.0 % (jmenovitě 4,8 %, 4,3 %, 3,1 %) %) týkající se oblasti hipokampu na 2 souřadnicích.

Analýza obrysu plochy byla provedena pomocí vizuální kontroly a ruční kvantifikace pomocí nástroje pro obrysy regionů softwaru ZEN 3.0. Plošné hodnoty byly poté normalizovány na celkovou plochu regionu. Stereotaxické souřadnice Te2, ACC a hippocampu vycházely z atlasu Paxinos [26] a v případě Te2 s kortikálním polem odkazovaným na atlas Zilles [25].

Statistická analýza

Všechna data jsou prezentována jako průměr ± SEM. Všechna data prošla Leveneovým testem na rovnost rozptylů. Parametrické statistiky byly tedy použity ve všech experimentech. Data ze 2 skupin byla porovnána pomocí 2-tailed nepárových Studentových t-testů. Srovnání více skupin bylo hodnoceno pomocí 1-way ANOVA testu s Tukeyho post hoc testem. Abychom se vypořádali s rozdíly mezi skupinami a uvnitř skupin, vypočítali jsme model ANOVA se smíšeným designem 3 × 2 se skupinou (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) jako mezi proměnná subjektů a stav (před a po nedávném kondicionování + injekci) jako proměnná v rámci subjektu. Tam, kde byla interakce skupina × podmínka významná, provedli jsme jednoduchou analýzu hlavních účinků a upravili jsme každou p-hodnotu pomocí Bonferroniho korekce. Pro každý smíšený model ANOVA jsme hodnotili předpoklad sféricity pomocí Mauchlyho testu sféricity.

Statistické parametry (tj. přesná hodnota n pro každou skupinu, SEM, statistický test, velikost účinku a přesná p-hodnota) jsou uvedeny v legendách. Pro stejné velikosti vzorků byly velikosti účinku pro nepárové t-testy určeny výpočtem Cohenova d nebo Glassova d podle podobnosti SD, zatímco pro různé velikosti vzorků Hedges'g. Korelace mezi počty buněk a zmrazením byly vypočteny pomocí Pearsonova koeficientu. Abychom zjistili, zda data splňují předpoklady statistického přístupu, zamítli jsme nulovou hypotézu na úrovni P < 0.05. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí SPSS Statistics 22 (IBM).

Podpůrné informace

S1 Obr. Zvětšení stop jehel Te2 (A) a ACC kortexu (B) s injekcí CNQX, vybrané jako příklady. (C) Při znázornění ve stejném kontextu 2 týdny po zákroku vykazovala zvířata pouze se šokem nízkou reakci strachu, což dokazuje, že postup nevyvolal podmíněné zmrazení v kontextu, kde byl aplikován šok. (D) Podobné výsledky jako na obr. 1 byly získány vyrovnáním 2 tónů použitých jako CS (CS1, 3 kHz a CS2, 15 kHz) (Student t test, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glassovo d=4.14). (E) U potkanů ​​kondiciovaných zápachem-CS bylo zmrazení na zápach 2 týdny po kondicionování vysoké, i když byly testovány v jiném prostředí týkajícím se kontextu kondicionování, čímž se ukázalo, že strach byl specificky spojen s tímto podáním podnětu. Měřítko, 300 μm. ��P < 0,01. Všechna data jsou průměr a SEM. Souhrnná data pro S1 Fig lze nalézt v podpůrných informacích v souboru s názvem S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Obr. Injekce CNQX narušila uchování nedávných vzpomínek na sluchový strach u krys, kde byla generalizace strachu snížena předexpozicí pouze tónem nebo použitím tónu bílého šumu jako CS1. ANOVA se smíšeným designem 3 × 2 (hlavní efekt skupiny: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0. 236, hlavní účinek podmínky: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, skupina × podmínka interakce F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) ukázala, že zmrazení na tón 3 kHz před jeho přiřazením k USA bylo nižší u zvířat, která obdržela 15 kHz tónovou předexpozici před párováním 15 kHz-US (n=10, p=0,001) nebo u krys kondicionovaných na bílý šum (n=13 , p=0,008) ve srovnání se zvířaty CS1-CS2 (n=22), která vykazovala proměnlivou reakci generalizace strachu. Avšak po CS-US učení a cnqx injekcích do Te2 kortexu byla nedávná paměť strachu narušena ve všech skupinách (p > 0,05). Jednoduchý hlavní efekt v rámci skupin (před a po učení CS-US následované injekcí cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Tone-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0,347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Všechna data jsou průměr a SEM. Souhrnná data pro S2 Fig lze nalézt v podpůrných informacích v souboru s názvem S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Obr. (A) Náhodný příklad injekce retrokuliček zacílených na BLA. (B a C) Příklady umístění optických vláken nad BLA zvířat injikovaných AAV vektory v Te2 (B) a ACC kortexu (C). Měřítko, 500 μm.

Poděkování

Děkujeme Dr. E. Manasserovi za jejich nepřetržitou podporu a rady.

Autorské příspěvky

Konceptualizace: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Správa dat: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Formální analýza: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Akvizice financování: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Vyšetřování: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodika: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Dozor: Benedetto Sacchetti.

Ověření: Benedetto Sacchetti.

Scénář – původní předloha: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Psaní – recenze a editace: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Reference
1. Frankland PW, Bontempi B. Organizace nedávných a vzdálených vzpomínek. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Neurobiologie konsolidací aneb jak stabilní je engram? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Konsolidace paměti. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, panoš LR. Konsolidace paměti a mediální temporální lalok: jednoduchý síťový model. Proč Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Proč existují komplementární systémy učení v hippocampu a neokortexu: pohledy z úspěchů a neúspěchů konekcionistických modelů učení a paměti. Psychol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com