Předběžná studie na vzorcích těstovin charakterizovaných antioxidačními sloučeninami a jejich biologickou aktivitou na buňkách ledvin

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Federico Di Marco a kol

Abstraktní:Těstoviny jsou jednou ze základních potravinStředomořídieta a z tohoto důvodu byl pro tuto studii vybrán pro hodnocení jeho antioxidačních vlastností. Byly vybrány tři druhy těstovin: pohankové, žitné a vaječné těstoviny. Kvalitativně-kvantitativní charakterizační analýzy byly provedeny společnostíHPLC-DADidentifikovat antioxidační sloučeniny. Údaje ukázaly přítomnost karotenoidů, jako je lutein, a polyfenolů, jako je kyselina indoloctová, (karotenoidy od {{0}},08 až 0,16 mg/100 g,polyfenolyod 3,7 do 7,4 mg/100 g). Pro posouzení účinku detekovaných metabolitů byly provedeny experimenty in vitroledvinamodely buněk: HEK-293 a MDCK. Standardy -karotenu, kyseliny indoloctové, kyseliny kávové, hydroalkoholu a extraktů obohacených o karotenoidy ze vzorků těstovin byly testovány v přítomnosti antioxidačního činidla, aby se určily variace životaschopnosti. -standardy karotenu a kyseliny indoloctové měly ochranný účinek na buňky HEK-293, zatímco na MDCK nebyl detekován žádný účinek. Testované koncentrace jsou pravděpodobně v rozmezí koncentrací dosažených v těle po konzumaci standardních těstovinových jídel. Extrakty obohacené o karotenoidy a hydroalkoholové extrakty vykazovaly různé účinky, pozorování záchrany u hydroalkoholového extraktu z žitných těstovin a extraktu z pohankových těstovin obohaceného karotenoidem, zatímco vaječné těstoviny vykazovaly mírnější účinky závislé na dávce za předpokladu prooxidačního chování při vysokých koncentracích. Předběžné výsledky naznačují, že chování lze vysledovat zpět k celým fytokomplexům s ohledem na jednotlivé molekuly a vyžadují další zkoumání.

klíčová slova:těstoviny;Středomořístrava; polyfenoly; karotenoidy; antioxidační sloučeniny;ledvinazdraví;HPLC/DADanalýzy

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

1. Úvod

Navzdory tomu neexistuje jednoznačná definiceStředomoříDieta – kvůli variacím a adaptacím v kulinářských tradicích nejen v oblasti Středomoří, ale také po celém světě [1] – může být středomořská strava považována za stravu obsahující několik složek, které splňují důležitá kritéria pro zdravou výživu: nízký obsah nasycených mastné kyseliny, vysoký obsah složených sacharidů, dietní vlákniny a molekul antioxidantů a hojnost v zelenině.

Je obtížné určit, které potraviny nebo aktivní složky v nich obsaženéStředomořístrava je nejvíce zodpovědná za zdravotní přínosy; hromadící se údaje naznačují, že jeho hlavní výhody spočívají v kombinaci komplexní a široké škály různých živin, které působí synergicky a aditivně [2].

V posledních letech rostoucí literatura (observační studie a randomizované kontrolní studie) prokázala zdravotní přínosy spojené se středomořskou stravou, snížení rizika rozvoje mnoha chronických onemocnění, jako jsou kardiovaskulární onemocnění [3–5], diabetes [6–10], rakovina [11,12], obezita [13–15] nebo kognitivní zdraví [16–19] a prodlužující se délka života [20].

Zdá se, že mechanismy působení odpovědné za blahodárné účinky na celkové zdraví. Všechny tyto biologické účinky podporované dodržováním středomořského životního stylu by mohly být relevantní nejen pro výše uvedená chronická onemocnění, ale také pro prevenci renálního kazu v běžné populaci. Chronické onemocnění ledvin (CKD) představuje celosvětový problém veřejného zdraví, který postihuje více než 750 milionů lidí na celém světě a působí často tiše a bez zábran díky svému asymptomatickému klinickému obrazu. Různé linie důkazů podtrhly silný vztah mezi středomořskou stravou a konzervací ledvin [29].

Vzhledem ke všem výše uvedeným efektům jako rizikovým faktorům poklesu renálních funkcí lze ledviny považovat za jeden z primárních cílů. Nedávná metaanalýza kohortových studií ukázala, že rostlinná strava, jako je středomořská strava nebo dietní přístup k zastavení hypertenze (DASH), byly spojeny s nižším rizikem výskytuCKDa albuminurie v běžné populaci [30]. Jedním z vysvětlení by mohlo být, že ovoce a zelenina obsahují bioaktivní sloučeniny chránící před zánětem a endoteliální dysfunkcí, které podporují dynamické změny filtrační frakce, což vede k progresivnímu snižování rychlosti glomerulární filtrace, expanzi objemu extracelulární tekutiny, abnormální iontové rovnováze a nakonec k hypoxii ledvin. vedoucí ke ztrátě funkce ledvin [31–33]. Nárůst spotřeby zeleniny, ovoce, obilovin a luštěnin navíc mohl vést ke snížení spotřeby živočišných bílkovin, což pozitivně ovlivnilo acidobazickou rovnováhu a glomerulární hemodynamikuledvinachrání před glomerulární sklerózou a ztrátou funkce [34–37].

Navzdory tomu existuje několik studií s kontrastními údaji o dopadu diety s vysokým obsahem bílkovin na pokles renálních funkcí v obecné populaci [38–41], rostoucí důkazy naznačují, že zdroj bílkovin hraje důležitou roli při zachování renálních funkcí a že posun od živočišného k rostlinnému zdroji bílkovin může být prospěšný [42,43].

Těstoviny jsou jednou z nejvíce konzumovaných potravin na světě a jsou jednou ze základních potravin středomořské stravy. Tradičně je Itálie hlavním výrobcem a lídrem ve spotřebě těstovin, i když se těstoviny spotřebovávají po celém světě z důvodu nízké ceny, chutnosti a delší trvanlivosti než jiné pekařské výrobky [44]. Těstoviny jsou dobrým zdrojem sacharidů a energie (100 g vařených těstovin obsahuje asi 31 g sacharidů a asi 158 kcal), ale typicky mají nízký obsah lipidů, bílkovin, fosforu a draslíku, což jsou složky živin omezené ve většině ledvinových diet. onemocnění ledvin (dostupné online na https://fdc.nal.usda.gov, přístupné 1. prosince 2020). Přirozeně obohacené pšeničné těstoviny, které představují většinu komerčně dostupných těstovin, také nabízejí dobré hladiny thiaminu, riboflavinu, niacinu, folátu, železa a selenu a také polyfenolů. Kromě toho se těstoviny vždy konzumují v kombinaci s jinými potravinami, které lze považovat za silnější zdroj polyfenolů, jako je olivový olej a zelenina. Těstoviny se obvykle vyrábějí s krupicí z tvrdé pšenice, a to pro její vynikající reologické vlastnosti, vynikající barvu těstovin, kvalitu vaření a přijatelnost spotřebitelem, ale v poslední době lze těstoviny vyrábět i z jiných obilovin, jako je rýže, pohankový, žitný, špaldový.

Spotřebitelé si v posledních letech více uvědomují, že vyvážená strava, jako je ta středomořská, může pozitivně ovlivnit zdraví, a proto se potravinářský průmysl snaží těmto nárokům vyhovět výrobou kvalitních a funkčních potravin a složek potravin.

Přestože byly obohacené potraviny vyráběny pro zdravé účely, lidé by mohli být přivedeni k tomu, aby je přijali namísto vyvážené stravy. Toto je tak důležité téma, které přimělo FDA publikovat ad hoc dokument nazvaný „politika opevnění FDA“, který by poskytl odpověď na jedné straně potravinářskému průmyslu a na druhé straně akademickému světu [44].

Vyvážená, přiměřená a pestrá strava je důležitým krokem ke spokojenému a zdravému životnímu stylu bez rizika přetížení některými přidanými složkami obsaženými v obohacených potravinách. Právě z tohoto důvodu byly znovu objeveny netradiční cereálie a pseudoobiloviny, které otevřely cestu pro jejich použití jako funkční složky potravin, protože mají některé nutriční a funkční vlastnosti, které v tradičních cereáliích chybí nebo chybí. Pohanka a žito jsou bohatými zdroji fytochemikálií, jako jsou polyfenoly, sloučeniny, které silně korelují s antioxidačními aktivitami [45,46].

Projekt MOLI-SANI byl zahájen v březnu 2005 a zapojilo se do něj asi 25000 občanů žijících v Molise (Itálie), aby vyhodnotili environmentální a genetické faktory, které jsou základem kardiovaskulárních onemocnění, nádorů a neurodegenerativních onemocnění. Podle studie z projektu MOLI-SANI je příjem těstovin spojen s nižším BMI a nižší úrovní centrální obezity. Mnoho studií potvrdilo, že vysokokalorické diety vedou k přibírání na váze a ne dieta obsahující sacharidy. Ve skutečnosti, pokud je porce těstovin správná a omáčka není příliš kalorická, může mít talíř těstovin kalorický obsah, který respektuje denní potřebu energie [47]. Těstoviny jsou vysoce ceněny, protože jejich vlastnosti byly spojeny nejen s kontrolou tělesné hmotnosti, ale také s několika pozitivními zdravotními vlastnostmi [48]. Randomizovaná, kontrolovaná studie provedená na zdravých jedincích ukázala, že produkty na bázi žita zlepšují regulaci glykémie, zvyšují střevní hormony podílející se na regulaci chuti k jídlu a metabolismu. Žito snižuje postprandiální apetit tím, že snižuje chuť k jídlu při následujících jídlech, zvyšuje pocit sytosti a snižuje hlad zvýšením hladiny hormonů sytosti GLP-1 (glukagonu podobný peptid-1) a peptidu YY (PYY). Nižší postprandiální glukózová odpověď byla pozorována u skupiny lidí konzumujících potraviny na bázi žita ve srovnání se skupinou subjektů konzumujících rafinovanou pšenici. Je tomu tak proto, že žito je obilovina s nízkým glykemickým indexem, kterou lze použít i u diabetických pacientů [49]. Žito může zlepšit plazmatický lipidový profil, ve skutečnosti je příjem celého žita nepřímo spojen s koncentrací LDL cholesterolu, poměrem LDL/HDL a koncentrací triglyceridů. Tento efekt je způsoben přítomností vlákniny a -glukanů [50].

Těstoviny jsou dobře známé jako zdroj sacharidů, ale mohou také obsahovat minoritní sloučeniny, jako jsou karotenoidy [51], zejména lutein, a další druhy antioxidantů, jako jsou polyfenoly. Tyto bioaktivní molekuly mohou být v závislosti na surovinách obohaceny o různé druhy těstovin. Například obsah karotenoidů v tvrdé pšenici je vyšší než v chlebové pšenici [52] a hladinu antioxidantů lze zvýšit začleněním frakce otrub a celého jádra tvrdé pšenice do těstovin [53]. Pohanka je významným zdrojem fenolických sloučenin, vitamínů a esenciálních aminokyselin [54], zatímco přidání vajec při přípravě těstovin přenáší karotenoidy a lutein. Karotenoidy se podílejí na preventivní aktivitě, zejména u zánětlivého syndromu, a jejich role je dána jejich antioxidačními vlastnostmi [55] proti volným radikálům a singletovému kyslíku [56]. Těstoviny obsahují různé typy molekul antioxidantů a pro časté konzumenty lze jejich velkou spotřebu považovat za významný zdroj těchto zdravých sloučenin.

Zde ukazujeme, že různé druhy těstovin, konkrétně pohankové, žitné a vaječné těstoviny, obsahují různá množství antioxidačních sloučenin, které mají za úkol zlepšit životaschopnost ledvinových buněk v ustáleném stavu nebo při indukci oxidačního stresu.

2. Materiály a metody

2.1. Vzorky

Byly analyzovány a testovány tři vzorky vařených těstovin: jeden vzorek celozrnných pohankových těstovin (1), jeden vzorek celozrnných žitných těstovin (2) a jeden vzorek vaječných těstovin z dl mouky z tvrdé pšenice mleté ​​peckou (3).

2.2. Příprava vzorků těstovin

Celkem 50 g celozrnných pohankových těstovin nebo celozrnných žitných těstovin bylo vařeno v 500 ml vody po dobu 7 minut; 50 g vaječných těstovin z mouky z tvrdé pšenice mleté ​​v kameni bylo vařeno v 500 ml vody po dobu 1 minuty, jak uvádí výrobce.

Pro získání extraktů obohacených o karotenoidy bylo 10 g vařených těstovin rozpuštěno ve 100 ml acetonu, sonikováno za studena po dobu 30 minut. Vzorek byl odstřeďován po dobu 5 minut při 5000 ot./min., supernatant byl odpařen do sucha na rotační odparce a zbytek byl rozpuštěn v acetonu nebo DMSO v závislosti na následné analýze. Pro získání extraktů obohacených o polyfenoly bylo 10 g každého vzorku vařených těstovin rozpuštěno v 50 ml 70:30 EtOH/H2O při pH 3,2. Vzorky byly třepány po dobu 24 hodin, centrifugovány po dobu 5 minut při 1400 ot./min. Vzorek byl odstřeďován po dobu 5 minut při 5000 otáčkách za minutu a supernatant byl shromážděn a analyzován v HPLC-DAD, zatímco alikvot byl odpařen za sucha a zbytek byl rozpuštěn v DMSO pro ošetření buněk.

2.3. HPLC-DA-MS analýza

Kvalitativní kvantitativní analýzy karotenoidů a polyfenolů byly provedeny pomocí kapalinové chromatografie HP 1100 vybavené detektorem DAD a spravované pracovní stanicí HP 9000 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) a napojené na shromažďovací spektrometr s rozhraním API/elektrosprej (Agilent Technologies). Provozní podmínky hmotnostního spektrometru byly následující: teplota plynu, 350 ◦C; průtok dusíku, 11,0 l/min; tlak nebulizátoru, 40 psi; kvadrupólová teplota, 100 ◦C; a kapilární napětí, 4000 V. Hmotnostní spektrometr pracoval v kladném a záporném módu při 80–180 eV.

Sloučeniny byly separovány pomocí 250 x 4,6 mm id, 5 um LUNA C18 kolony (Phenomenex, Torrance, CA, USA). UV/Vis spektra byla zaznamenána v rozsahu 190–600 nm a chromatogramy byly pořízeny při 250, 280, 330, 350 a 450 nm. Vzorky byly analyzovány gradientovou elucí při druhé rychlosti 0,8 ml/min. Mobilní fází pro karotenoidy byl vícestupňový lineární rozpouštědlový gradientový systém (rozpouštědlo A: aceton, rozpouštědlo B: H20, pH 3,2 kyselinou mravenčí), počínaje 80 procenty acetonu až 100 procenty za 30 minut. polyfenoly byly eluovány s použitím následujícího gradientu: od 90 procent H20 (upravené na pH 3,2 kyselinou mravenčí) do 100 procent CH3CN během 40 minut. Všechna použitá rozpouštědla měla čistotu HPLC (BDHLaboratory Supplies, Poole, UK).

2.4. Kvantitativní analýza

Kvantifikace jednotlivých polyfenolických sloučenin byla přímo provedena pomocí HPLC-DAD pomocí pětibodové regresní křivky (R2 větší nebo rovno 0,998) v rozsahu 0–30 µg na základě autentické standardy. Konkrétně flavonoly byly stanoveny při 350 zábavném kvercetin 3-O-glukosidu jako referenční sloučenině, zatímco deriváty kyseliny kávové byly stanoveny při 330 nm s použitím kyseliny chlorogenové jako referenční sloučeniny a derivátu kyseliny indoloctové při 280 nm za použití 3 kyselin indoloctových (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Karotenoidy byly stanoveny při 450 nm za použití beta-karotenu jako referenční sloučeniny (Extrasynthese, Lione, Francia). Ve všech případech byly skutečné koncentrace derivátů vypočteny po aplikaci korekcí na rozdíly v molekulové hmotnosti.

2.5. Celkový obsah fenolů

Celkový obsah fenolů byl stanoven metodou Folin–Ciocalteu, popsanou Singletonem et al. [57] a mírně upraveno podle Dewanto et al. [58]. Ke 125 µL vhodně naředěného extraktu vzorku bylo přidáno 0,5 ml deionizované vody a 125 µL Folin-Ciocalteuova činidla. Směs byla udržována po dobu 6 minut a poté bylo přidáno 1,25 ml 7% vodného roztoku Na2C03. Konečný objem byl upraven na 3 ml vodou. Po 90 minutách byla měřena absorpce při 760 nm proti vodě jako slepému pokusu. Množství celkových fenolických látek je vyjádřeno jako ekvivalenty kyseliny gallové (GAE, mg kyseliny gallové/100 g vzorku) prostřednictvím kalibrační křivky kyseliny gallové. Kalibrační křivka se pohybovala od 20 do 500 µg/mL (R2=0.9969) [57,58].

2.6. Buněčná kultura

Buňky lidské embryonální ledviny 293 (HEK-293) a buňky psí ledviny Madin–Darby (MDCK) byly kultivovány v DMEM doplněném GlutaMAX, 10 procent (v/v), fetálním hovězím sérem, 100 U/ml penicilinu a 100 ug /ml streptomycinu při 37 ◦C s 5 procenty CO2.

2.7. MTT test

5{{1{12}}}}}00 buněk/jamka MDCK a HEK-293 buňky byly nasazeny na 96jamkové destičky a ponechány přilnout po dobu 24 hodin. Pro studie životaschopnosti byly buňky inkubovány po dobu 24 hodin až 72 hodin s beta karotenem, kyselinou indol-3-}octovou, kyselinou kávovou (v DMSO) a těstovinovými extrakty samotnými nebo v přítomnosti monoperoxyftalátu hořečnatého (MMPP, Sigma-Aldrich Louis, MO, USA). Pro neošetřené vzorky byl použit DMSO v médiu ve stejných koncentracích, jaké byly použity pro testované sloučeniny. Testované koncentrace pro standardy byly v rozmezí od 2 pM do 10 uM, zatímco pro MMPP od 0,001 do 0,05 mg/ml. Životaschopnost buněk byla měřena 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Destičky byly inkubovány při 37 °C po dobu 1 hodiny a poté byl Formazan produkovaný redukcí MTT solubilizován v DMSO. Absorbance byla stanovena na čtečce mikrodestiček (Mithras LB 940-Berthold) při 570 nm. Procento buněčné životaschopnosti bylo vypočteno pomocí poměru AbsTEST/AbsCTRL.

2.8. Statistická analýza

Každý experiment byl proveden čtyřnásobně a opakován alespoň třikrát. Rozdíly v procentech životaschopnosti byly hodnoceny pomocí párového Studentova t-testu a dvoucestné ANOVA následované posthoc testem s Holmovou korekcí pro vícenásobné srovnání koncentrací metabolitů (p < 0,05).="" výsledky="" byly="" vyjádřeny="" jako="" průměr="" ±="" standardní="" chyba="" a="" analýza="" byla="" provedena="" prostředím="" r-studio="" [59]="" pro="" r="" verze="" 3.6.3="" [60]="" s="" použitím="" balíčku="" "tidyverse"="">

3. Výsledky a diskuse

3.1. Stanovení chemické kvality vzorků těstovin

Nutriční informace o potravinách umožňují informovaný výběr potravin a diet. Těstoviny se tradičně připravují z krupice, ale i s jinými obilovinami všechny obsahují jako hlavní složku škrob, po kterém následují bílkoviny, tuky, vitamíny, minerály a bioaktivní sloučeniny [62]. V tabulce S1 jsou uvedeny nutriční údaje.

Pro srovnání nutričních hodnot několika druhů těstovin obohacených o bioaktivní látky díky různým zdrojům obilovin nebo suplementaci specifických složek jsme analyzovali pohankové těstoviny, žitné těstoviny a vaječné těstoviny. Aby se získaly extrakty obohacené o různé podtřídy sloučenin přítomných ve vzorcích těstovin, byly provedeny a analyzovány jak hydroalkoholové, tak acetonové extrakce. Jednotlivé polyfenoly byly předběžně identifikovány pomocí dat z analýzy HPLC-DAD-MS porovnáním a kombinací jejich retenčních časů a hmotnostní spektrometrie a UV spekter (viz obrázky S1–S5 pro stejný příklad MS spekter) a porovnáním výsledků se standardy (kaempferol, kvercetin, rutin a kyselina ferulová) a předchozí bibliografické práce. Zejména v hydroalkoholových extraktech byly identifikovány flavonoidy, kávová kyselina a deriváty kyseliny indoloctové (tabulka 1): derivát kyseliny indoloctové je hlavní sloučeninou, jak bylo popsáno dříve, dokonce i pro krupici. [63]. S ohledem na relativní složení vykazovaly pohankové těstoviny vyšší hladiny flavonoidů, zejména deriváty kvercetinu jsou hlavními flavonoly, jak bylo dříve uvedeno u pohanky [64,65], a zanedbatelnou přítomnost derivátů kyseliny kávové; žitné těstoviny vykazovaly vyšší obsah derivátů kyseliny kávové, zejména kyseliny ferulové [66] a nízký obsah flavonoidů; vaječné těstoviny vykazovaly pouze nízkou koncentraci flavonoidů (derivát apigeninu [67]) a žádnou přítomnost derivátů kyseliny kávové.

Jako příklad jsou na obrázku 1 uvedeny chromatografické profily vzorků vařených těstovin zaznamenané při 350 nm. Obrázek ukazuje kvalitativní složení analyzovaných vzorků.

Lutein byl hlavním karotenoidem identifikovaným v acetonových extraktech s podobným relativním obsahem s ohledem na celkové druhy karotenoidů, jak je uvedeno v tabulce 2, v souladu s předchozími studiemi [68]. V žitných těstovinách nebyly karotenoidy zjištěny.

Ve vzorcích těstovin byla také hodnocena přítomnost antioxidačních sekundárních metabolitů (tabulka 3). Byla posouzena celková antioxidační kapacita biosložek, pravděpodobně díky aktivitě fenolu/polyfenolu a byl odvozen počet takových molekul.

3.2. Účinek kyseliny indol-3-octové,8-Karoten a kyselina kávová na životaschopnost buněk

Středomořská strava je uznávána jako zdroj antioxidačních molekul, které chrání organismus před oxidativním stresem a podporují zdravý stav [2]. Proto nás zajímalo, zda biomolekuly detekované v našich vzorcích těstovin mohou ovlivnit životaschopnost buněk a do jaké míry. Použili jsme buňky zdravých ledvin HEK-293 a MDCK ke stanovení aktivity standardních sloučenin kyseliny indoloctové, -karotenu a kyseliny kávové. Ledviny jsou zvláště citlivé na oxidační stres a akumulace volných radikálů vede k poškození ledvin [69]. Buňky byly inkubovány se skalární koncentrací standardních sloučenin a životaschopnost buněk byla měřena v různých časových bodech (obrázek 3 a obrázek S6).

Bylo zjištěno, že nevykazují žádný toxický účinek na buňky HEK{{0}}} pro všechny testované koncentrace v době inkubace. Pouze -karoten snižoval životaschopnost buněk ve tvaru U na buňkách HEK-293 a způsobem závislým na dávce u buněk MDCK (obrázek 3). Je pozoruhodné, že koncentrace pravděpodobně dosažené v těle po konzumaci standardního těstovinového jídla (obvykle 80 g) jsou v rozmezí nejnižších testovaných (2 × 10_5 –2 × 10_4 uM, [70 ,71]), což poskytlo slabé zvýšení životaschopnosti na obou buněčných liniích. Na druhé straně při vyšších koncentracích nad 0,2 uM, které lze získat pouze farmakologicky, kyselina kávová vykazovala výrazné zlepšení životaschopnosti buněk, zatímco kyselina indoloctová a -karoten vykazovaly srovnatelné účinky spolu se zvýšením koncentrace (2–20 uM ) v buňkách HEK{18}} v průběhu času.

3.3. Účinek indol-3-kyseliny octové, karotenu a kyseliny kávové na buňky ošetřené MMPP

Dále nás zajímalo, zda kyselina indoloctová, -karoten a kyselina kávová mohou působit proti stresu vyvolanému oxidačním činidlem MMPP. Nejprve jsme testovali účinek MMPP vystavením buněk HEK-293 a MDCK sériovým ředěním (0.005–0,05 mg/ml) léku a byla stanovena životaschopnost buněk. Po léčbě MMPP byl zaznamenán pokles závislý na dávce a IC50 byla srovnatelná ve dvou testovaných buněčných liniích. Po inkubaci s 20–25 µg/ml MMPP byla buněčná životaschopnost významně snížena na přibližně 50–60 procent (obrázek 4) a polovina maximální inhibiční koncentrace (IC50) byla vypočtena na 26 µg/ml pro HEK{{16} } a 22 ug/ml pro MDCK.

Poté jsme testovali ochrannou aktivitu našich antioxidačních molekul na buňkách ošetřených MMPP doplněním buněčného média 2 × 10_5 nM kyseliny indoloctové, -karotenu nebo kávové. Mírně pozitivní účinek na životaschopnost buněk jak HEK{5}}, tak MDCK byl potvrzen použitím standardů jako takových v dávce pravděpodobně odvozené z porce těstovin (obrázek 5).

Jak se očekávalo, MMPP snížil životaschopnost buněk na 60–65 procent; léčba kyselinou indoloctovou nebo -karotenem působí proti účinku MMPP a zachránila životaschopnost buněk o 30 procenta (p < 0,001)="" a="" 27="" procent="" (p=""> 0,01) na buňkách HEK{10}}, zatímco kyselina kávová nevykazovala žádný významný účinek. V přítomnosti oxidačního činidla beta-karoten a kyselina indoloctová vykazovaly ochranný účinek na buňky v nízké koncentraci, zatímco kyselina kávová nepůsobila proti oxidačnímu stresu v koncentraci potřebné pro zvýšení životaschopnosti buněk. Tyto pozitivní účinky jsou pravděpodobně způsobeny antioxidačními vlastnostmi kyseliny indoloctové a karotenoidů, které mohou významně vyvážit cytotoxicitu zprostředkovanou MMPP v dávce použité v tomto experimentálním stavu. Nicméně na buňkách MDCK ošetřených MMPP nebyla pozorována žádná významná záchrana, což naznačuje, že i když samotné standardy vykazovaly významně pozitivní účinek na životaschopnost buněk, nejsou dostatečné k řešení oxidačního stresu vyvolaného MMPP. Embryonální buňky HEK 293 se zdají být pohotovější k uspořádání obranné linie proti stresu než dospělí MDCK, pravděpodobně kvůli dalším buněčným redoxním homeostázovým systémům.

3.4. Vliv frakce obohacené karotenoidem získaným z těstovin na cytotoxicitu indukovanou MMPP

Pro vyhodnocení účinků karotenoidů obohacených frakcí získaných z acetonové extrakce pohankových těstovin a vaječných těstovin na renální buňky v přítomnosti oxidačního stresu byly buňky HEK-293 inkubovány s různými koncentracemi extraktů v pořadí od 2 × { {3}} uM až 2 × 10_3 uM v přítomnosti MMPP po dobu 72 hodin (obrázek 6 a tabulka S2). Použitá koncentrace se vztahuje ke koncentraci -karotenu zjištěné v extraktu (tabulka2). Obsah luteinu se pohyboval od 1,5 × 10_6 uM do 1,5 × 10_3 uM v pohankových těstovinách a od 1,34 × 10_6 uM do 1,34 × 10_3 uM ve vaječných těstovinách.

V obou acetonových extraktech vykazovala přítomnost přírodních fytokomplexů různé účinky s ohledem na jediný standard, což vedlo k vyšší aktivitě při nižších koncentracích. Jak se koncentrace extraktů z vaječných těstovin zvyšuje, bylo pozorováno snížení životaschopnosti buněk. Nejnižší koncentrace karotenoidových extraktů (2 × 10−6 µM) vyvolala mírný pozitivní účinek samostatně nebo v přítomnosti MMPP na HEK-293 buňky. Extrakt z pohankových těstovin generoval zvýšení životaschopnosti buněk jako samotný extrakt, ale také v přítomnosti MPP v rozmezí od 32 ± 5 procent při nejnižší koncentraci do 21 ± 9 procent pro 2 × 10-4 uM.

Aktivita acetonových extraktů byla hodnocena také na buňkách MDCK v přítomnosti nebo nepřítomnosti MMPP a porovnána s aktivitou získanou v buňkách HEK-293 (obrázek 7 a tabulka S2).

Extrakty obohacené o karotenoidy poskytly celkový efekt pro životaschopnost ve všech testovaných koncentracích pro oba typy těstovin. S ohledem na pohanku HEK-293 poskytl těstovinový extrakt lepší záchranu při léčbě MMPP pro všechny dávky v rozmezí od 50 ± 7 procent do 82 ± 5 procent ve srovnání s buňkami HEK-239; extrakty z vaječných těstovin měly malou záchranu pouze při nejnižší koncentraci karotenoidů 2 × 10_6 uM v přítomnosti MMPP, což naznačuje, že specifické složení extraktů hraje klíčovou roli v odpovědi. Pohankové těstoviny tedy vykazovaly větší záchrannou kapacitu na životaschopnost buněk ve srovnání s vaječnými těstovinami, a protože experimenty byly provedeny se stejným množstvím -karotenu, rozdíl mohl být způsoben přítomností minoritních sloučenin, jako jsou sloučeniny flavonoidů, vyšší v bývalém.

Druhy karotenoidů se účastní různých chemických reakcí, které mají dvojí povahu oxidantu a antioxidantu v závislosti na biologickém kontextu a jejich koncentracích: tato vysoká reaktivita je způsobena přítomností konjugovaných dvojných vazeb [72]. Jejich antioxidační role byla spojena se schopností delokalizovat elektrony dané oxidativními druhy a radikály [73,74]. V přítomnosti vysokých oxidačních podmínek může být jejich aktivita převedena na prooxidační [75]. V našich případech bylo toto zjištění pozorováno u vaječných těstovin pro HEK-293 (jak samostatně, tak v přítomnosti MMPP) a MDCK buněk v přítomnosti MMPP, kde různé dávky acetonového extraktu vyvolaly opačné účinky.

3.5. Vliv hydroalkoholového extraktu na MMPP-indukovanou cytotoxicitu

Poté jsme hodnotili účinky hydroalkoholových extraktů z pohankových těstovin, žitných těstovin a vaječných těstovin na ledvinové buňky testováním různých koncentrací v rozmezí od 5 × 10_5 uM do 5 × 10_1 uM s MMPP nebo bez MMPP (Obrázek 8 a tabulka S3). Použitá koncentrace se týká koncentrace celkového obsahu fenolů zjištěného v extraktu (tabulka 3). Podle obsahu vzorků těstovin uvedených v tabulce 1 byla u pohankových těstovin koncentrace kyseliny indoloctové seřazena od 1,85 × 10_5 uM do 1,85 × 10_1 uM, u derivátů kyseliny kávové od 3,5 × 10_6 uM až 3,5 × 10_2 uM a pro obsah flavonoidů bylo hodnocení od 2,8 × 10_5 uM do 2,8 × 10_1 uM; u žitných těstovin byla koncentrace kyseliny indoloctové v rozmezí od 2,2 × 10_5 uM do 2,2 × 10_1 uM, u derivátů kyseliny kávové od 1,95 × 10_5 uM do 1,95 × {{37} } uM a pro druhy flavonoidů od 8,5 × 10_6 uM do 8,5 × 10_2 uM; u vaječných těstovin byla koncentrace kyseliny indoloctové v rozmezí od 4,25 × 10_5 uM do 4,25 × 10_1 uM, u druhů flavonoidů od 7,5 × 10_6 uM do 1,85 × 10_2 uM, zatímco nebyly přítomny žádné deriváty kyseliny kávové.

Hydroalkoholový extrakt z vaječných těstovin nevykazoval žádný významný vliv na životaschopnost HEK- 293 nezávisle na přítomnosti oxidačního stresu. Extrakt z pohankových těstovin vykázal zvýšení životaschopnosti buněk po ošetření MMPP pouze při nejvyšší koncentraci (28 ± 6 procent). Samotný extrakt z žitných těstovin vykázal obecné zvýšení životaschopnosti buněk pro všechny dávky v rozmezí od 14 ± 7 procent do 18 ± 1 procenta a také v přítomnosti MMPP z 27 ± 3 procent na 13 ± 3 procenta. Fytokomplex přítomný v extraktech se ukázal být aktivnější než jednotlivé standardy a měl vliv na životaschopnost buněk při nižších koncentracích ve srovnání s posledně jmenovanými. Tyto výsledky naznačují, že v hydroalkoholových extraktech lze hlavní roli při záchraně připsat přítomnosti derivátů kyseliny kávové, přičemž pozorujeme vyšší záchranu u žitných těstovin a nižší/zanedbatelný účinek u vaječné pasty, ve které nejsou zjistitelné.

Hydroalkoholový extrakt byl poté testován na MDCK buňkách za stejných podmínek jako dříve a byla hodnocena životaschopnost buněk (obrázek 9 a tabulka S4).

Hydroalkoholový extrakt z pohanky a vaječných těstovin vykazoval kontrastní účinky na životaschopnost buněk: první ji zvyšuje, zatímco druhý ji snižuje; u obou nebyl zjištěn žádný účinek na léčbu MMPP. Samotný extrakt z žitných těstovin nevykazoval žádný významný účinek na životaschopnost buněk, ale odhaluje silný ochranný účinek proti oxidačnímu stresu zprostředkovanému MMPP ve všech koncentracích v rozmezí od 50 ± 7 procent do 61 ± 21 procent. Ve standardních podmínkách.

V nepřítomnosti MMPP se zdá, že vysoký obsah kyseliny indoloctové v extraktu z vaječných těstovin má toxický účinek na životaschopnost buněk. Porovnáním dvou buněčných modelů jsme pozorovali odlišné chování s ohledem na pohankové a žitné těstoviny v nepřítomnosti MMPP. Konkrétně HEK-293 vykázala zvýšení životaschopnosti s druhým, zatímco MDCK s prvním. Rozdíly souvisí s působením fotokomplexů, které se u pohankových těstovin vyznačují vyšším obsahem flavonoidů. Záchrana životaschopnosti buněk mezi vzorky, jak byla pozorována u obou buněčných linií, odpovídá zvýšenému obsahu derivátů kyseliny kávové v žitných těstovinách.

Studium interakce mezi polyfenoly obsahujícími fytokomplexy a renálními buňkami by mohlo pomoci prozkoumat známé důležité účinky těchto sloučenin na renální fyziologii [76] se zaměřením na jedno z možných vehikul, těstoviny, typicky spojené se zdravou ledvinovou dietou. Obecně platí, že metabolity polyfenolů mají plazmatický poločas několik hodin a jsou rychle eliminovány ledvinami a játry: močí a žlučí. Celkové množství polyfenolových metabolitů vyloučených močí koreluje nejen s jejich maximální plazmatickou koncentrací, ale také s jejich schopností vylučovat se spíše žlučovými než močovými cestami. Například vylučování kvercetinu a jeho glykosidů močí tvoří 0,3–1,4 procenta požité dávky [77]; kyselina kávová a ferulová představují 5,9 procenta a 27 procent. Polyfenoly získané z těstovin proto mohou mít pozitivní dopad na renální buňky v závislosti na jejich složení

množství a metabolismus. K lepší definici jejich přínosu pro zdraví ledvin jsou zapotřebí další studie.

Doplňkové materiály:Následující jsou k dispozici online na https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/nu13041131/s1, Tabulka S1: Nutriční tabulka. Tab MDCK) hodiny. * p < {{20}}.5,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< {{30}}.001="" .="" tabulka="" s3="" –="" detekce="" variace="" buněčné="" životaschopnosti="" hek-293="" inkubované="" se="" zvyšujícím="" se="" množstvím="" hydroalkoholového="" extraktu="" z="" pohankových="" těstovin,="" žitných="" těstovin="" a="" vaječných="" těstovin="" na="" médiu="" a="" mmpp="" po="" dobu="" 72="" hodin.="" *="" p="">< 0,5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001.="" tabulka="" s4="" –="" detekce="" variace="" buněčné="" životaschopnosti="" mdck="" inkubovaného="" se="" zvyšujícím="" se="" množstvím="" hydroalkoholového="" extraktu="" z="" pohankových="" těstovin,="" žitných="" těstovin="" a="" vaječných="" těstovin="" na="" médiu="" a="" mmpp="" po="" dobu="" 24="" hodin.="" *="" p="">< 0,5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001.="" obrázek="" s1:="" ms="" spektra="" kaempferolu="" v="" hydroalkoholovém="" extraktu="" z="" vařených="" těstovin="" z="" pohanky.="" obrázek="" s2:="" ms="" spektra="" kvercetinu="" v="" hydroalkoholovém="" extraktu="" z="" vařených="" těstovin="" z="" pohanky.="" obrázek="" s3:="" ms="" spektra="" rutinu="" v="" hydroalkoholovém="" extraktu="" vařených="" těstovin.="" obrázek="" s4:="" ms="" spektra="" kyseliny="" ferulové="" jedna="" v="" hydroalkoholovém="" extraktu="" z="" vařených="" těstovin="" z="" žita.="" obrázek="" s5:="" ms="" spektra="" apigeninových="" glykosidů="" v="" hydroalkoholovém="" extraktu="" těstovin="" uvařených="" ve="" vejcích.="" obrázek="" s6:="" životaschopnost="" detekční="" buňky="" hek-293="" inkubované="" se="" zvyšujícím="" se="" množstvím="" kyseliny="" indoloctové,="" -karotenu="" a="" kyseliny="" kávové="" po="" dobu="" 24="" (a)="" a="" 48="" (b)="" hodin="" uváděné="" hodnoty="" odpovídají="" průměru="" buněčné="" životaschopnosti="" se="" standardní="" chybou="" ve="" třech="" biologických="" replikacích.="" procento="" buněčné="" životaschopnosti="" bylo="" vypočteno="" pomocí="" poměru="">

References

1. Lacatus,u, CM; Grigorescu, ED; Floria, M.; Onofriescu, A.; Mihai, BM Středomořská strava: Od kultury stravování založené na životním prostředí po nově vznikající lékařský předpis. Int. J. Environ. Res. Veřejné zdravotnictví 2019, 16, 942.

2. Jacobs, DR; Gross, MUDr. Tapsell, LC Food synergy: Operační koncept pro pochopení výživy. Dopoledne. J. Clin. Nutr.2009, 89, 1543S.

3. De Lorgeril, M.; Salen, P.; Martin, J.-L.; Monjaud, I.; Delaye, J.; Mamelle, N. Středomořská strava, Tradiční rizikové faktory a míra kardiovaskulárních komplikací po infarktu myokardu. Náklad 1999, 99, 779–785.

4. Psaltopoulou, T.; Naska, A.; Orfanos, P.; Trichopoulos, D.; Mountokalakis, T.; Trichopoulou, A. Olivový olej, středomořská strava a arteriální krevní tlak: Studie The Greek European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC). Dopoledne. J. Clin. Nutr. 2004, 80, 1012–1018.

5. Estruch, R.; Ros, E.; Salas-Salvad6, J.; Covas, M.-I.; Corella, D.; Ar6s, F.; G6mez-Gracia, E.; Ruiz-Gutierrez, V.; Fiol, M.; Lapetra, J.; a kol. Primární prevence kardiovaskulárních onemocnění pomocí středomořské stravy. Z. Gefassmedizin 2013, 10, 28.

6. Uusitupa, M.; Khan, TA; Viguiliouk, E.; Kahleová, H.; Rivellese, AA; Hermansen, K.; Pfeiffer, A.; Thanopoulou, A.; Salas-Salvad6, J.; Schwab, U.; a kol. Prevence diabetu 2. typu změnou životního stylu: Systematický přehled a metaanalýza. Živiny 2019, 11, 2611.

7. Jannasch, F.; Kröger, J.; Schulze, MB Dietní vzorce a diabetes typu 2: Systematický přehled literatury a metaanalýza prospektivních studií. J. Nutr. 2017, 147, 1174–1182.

8. Esposito, K.; Chiodini, P.; Maiorino, MI; Bellastella, G.; Panagiotakos, D.; Giugliano, D. Jaká dieta pro prevenci diabetu 2. typu? Metaanalýza prospektivních studií. Endokrinní 2014, 47, 107–116.

9. Huo, R.; Du, T.; Xu, Y.; Xu, W.; Chen, X.; Sun, K.; Yu, X. Účinky stravy středomořského stylu na kontrolu glykémie, úbytek hmotnosti a kardiovaskulární rizikové faktory u jedinců s diabetem 2. typu: metaanalýza. Eur. J. Clin. Nutr. 2015, 69, 1200–1208.

10. Martin-Peldez, S.; Fito, M.; Castaner, O. Účinky středomořské stravy na prevenci diabetu 2. typu, progresi onemocnění a související mechanismy. Přezkoumání. Živiny 2020, 12, 2236.

11. Milajerdi, A.; Namazi, N.; Larijani, B.; Azadbacht, L. Asociace ukazatelů kvality stravy a úmrtnosti na rakovinu: Systematický přehled a metaanalýza kohortových studií. Nutr. Rak 2018, 70, 1091–1105.

12. Schwingshackl, L.; Schwedhelm, C.; Gilbert, C.; Hoffmann, G. Dodržování středomořské stravy a riziko rakoviny: Aktualizovaný systematický přehled a metaanalýza. Živiny 2017, 9, 1063.

13. Say6n-Orea, C.; Razquin, C.; Bull6, M.; Corella, D.; Fit6, M.; Romaguera, D.; Vioque, J.; Alonso-G6mez, AM; Wärnberg, J.; Martinez, JA; a kol. Vliv nutriční a behaviorální intervence na dodržování středomořské diety se sníženou energií u pacientů s metabolickým syndromem: Průběžná analýza randomizované klinické studie PREDIMED-Plus. JAMA J. Am. Med. Doc. 2019, 322, 1486–1499.

14. Bajerská, J.; Chmurzynska, A.; Muzsik, A.; Krzyz˙ anowska, P.; Ma˛dry, E.; Malinowska, AM; Walkowiak, J. Hubnutí a metabolické účinky na zdraví z energeticky omezené středomořské a středoevropské stravy u žen po menopauze: Randomizovaná kontrolovaná studie. Sci. Rep. 2018, 8, 11170.

15. Estruch, R.; Martinez-Gonzalez, MA; Corella, D.; Salas-Salvad6, J.; Fit6, M.; Chiva-Blanch, G.; Fiol, M.; G6mez-Gracia, E.; Ar6s, F.; Lapetra, J.; a kol. Vliv středomořské stravy s vysokým obsahem tuků na tělesnou hmotnost a obvod pasu: Předem specifikovaná sekundární analýza výsledků randomizované kontrolované studie PREDIMED. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019, 7, e6–e17.

16. Molendijk, M.; Molero, P.; Ortuño Sdnchez-Pedreño, F.; Van der Does, W.; Angel Martinez-Gonzalez, M. Kvalita stravy a riziko deprese: Systematický přehled a metaanalýza závislosti odpovědi na dávce prospektivních studií. J. Afekt. Porucha. 2018, 226, 346–354.

17. Wu, L.; Sun, D. Dodržování středomořské stravy a riziko rozvoje kognitivních poruch: Aktualizovaný systematický přehled a metaanalýza prospektivních kohortových studií. Sci. rep. 2017, 7, 1–9.

18. Loughrey, DG; Lavecchia, S.; Brennan, S.; Lawlor, BA; Kelly, ME Vliv středomořské stravy na kognitivní fungování zdravých starších dospělých: Systematický přehled a metaanalýza. Adv. Nutr. 2017, 8, 571–586.

19. Arnold, SE; Arvanitakis, Z.; Macauley-Rambach, SL; Koenig, AM; Wang, HY; Ahima, RS; Řemesla.; Gandy, S.; Buettner, C.; Stoeckel, LE; et a Mozková inzulínová rezistence u diabetu 2. typu a Alzheimerovy choroby: Pojmy a hádanky. Nat. Neurol. 2018, 14, 168–181.

20. Trichopoulou, A.; Vasilopoulou, E. Středomořská strava a dlouhověkost. Br. J. Nutr. 2020, 84, S205–S209.