PRAT 1 Cistanches Deserticola PhG-RE prostřednictvím inhibice mechanismu apoptózy ERS k ochraně apoptózy buněk myokardu před H2O2- indukovaným stresem endoplazmatického retikula

Pro více informací prosím kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

Oddělení farmacie, China-Japan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033, Čína

Korespondence by měla být adresována Qian Yu; yuqian@jlu.edu.cn

Přijato 9. června 2020; Revidováno 15. července 2020; Přijato 24. července 2020; Publikováno 25. září 2020

Akademický redaktor: Michel Mansur Machado

Copyright © 2020 Tianwei Lan a Qian Yu. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný pod licencí Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za předpokladu, že je původní dílo řádně citováno.

BylinaCistanchedeserticolamá určité ochranné účinky na myokard. Tato studie se pokusila vysvětlit mechanismus, kterým PhG-RE chrání buňky myokardu, a ověřit, zda k této ochraně dochází prostřednictvím regulace mechanismu apoptózy spojeného se stresem endoplazmatického retikula (ERS). Potkaní myokardiální buňky byly vystaveny 150 ug ml-1 PhG-RE po dobu 24 hodin a poté 100 μmol ml-1 H2O2 po dobu 18 hodin, aby se vyvolal ERS a vytvořil se model poškození buněk. K ověření přesnosti experimentu byly použity thapsigargin (TG), specifický aktivátor ERS, a kyselina 4-fenylmáselná (4-PBA), inhibitor ERS. Naše výsledky ukázaly, že PhG-RE významně zlepšila životaschopnost buněk, chránila buňky a snížila poškození buněk a apoptózu. PhG-RE hrál podobnou roli jako inhibitor ERS 4-PBA při ochraně buněk myokardu před apoptózou a poškozením vyvolaným stresem ER. Kromě toho PhG-RE významně zeslabila expresi mRNA apoptotických faktorů GRP78, CHOP a kaspázy spojených s ERS-12 a expresi proteinů apoptotických faktorů souvisejících s ERS GRP78, CHOP, kaspáza{21}}, a p-JNK. Celkově tato zjištění naznačují, že PhG-RE může účinně chránit buňky myokardu a snižovat apoptózu a poškození buněk, což může souviset s regulací apoptózy spojené s ERS.

1. Úvod

Cistanche deserticola(C. deserticola) je jedna z bylinných rostlin používaných v tradiční čínské medicíně, která roste v pouštním prostředí. Thefenylethanoidglykosid-bohatý extrakt (PhG-RE) je hlavní aktivní složkouC. deserticola. Výzkum zjistil, že PhG-RE může chránit myokard před ischemicko-reperfuzním (I/R) poškozením [1].

Když se ERS začne vyskytovat v buňkách myokardu, hladina glukózou regulovaného proteinu 78 (GRP78) se zvýší, aby antagonizovala poškození vyvolané ERS. Jak ERS postupuje, je zahájena apoptóza a exprese homologního proteinu CCAAT/enhancer-binding protein (CHOP), c-Jun N-terminální kinázy (JNK) a cysteinyl aspartát specifické proteinázy-12 (kaspáza{{8 }}) se zvyšuje. Například exprese GRP78, CHOP a štěpeného ATF6 (c-ATF6) v buňkách myokardu krys s HF je významně zvýšena a jsou aktivovány PERK (p-PERK), IRE1 (p-IRE1) a p-JNK. [2]. Navíc ERS indukovaná I/R poškozením zvyšuje expresi GRP78 a CHOP [3]. Hladiny fosforylace PERK a eIF2 jsou zvýšené [4]. Zvyšuje se exprese proapoptotických proteinů Bax a kaspázy-3, což způsobuje rupturu buněk a remodelaci myokardu [5], zvyšuje se oblast infarktu myokardu a enzymatická aktivita myokardu [3]. Během našeho předchozího výzkumu bylo zjištěno, že PhG-RE může chránit myokard před ischemicko-reperfuzním poškozením a může významně snížit oblast infarktu myokardu indukovaného I/R [1]. Není však jasné, zda PhG-RE může inhibovat apoptózu spojenou s ERS, a tím snížit ztrátu buněk myokardu a apoptózu. V této studii byly buňky předem ošetřeny PhG-RE, aby se zjistilo, zda PhG-RE může inhibovat H2O2-indukovaný ERS, a tedy snížit ztrátu buněk myokardu a apoptózu. Thapsigargin (TG), specifický aktivátor ERS, a kyselina 4-fenylmáselná (4-PBA), inhibitor ERS, byly použity k dalšímu ověření, zda zprostředkování ERS může účinně snížit buněčnou apoptózu a zda tento proces souvisí s hladinami exprese GRP78, CHOP, JNK a kaspázy{40}}, u kterých bylo prokázáno, že zprostředkovávají ERSapoptóza.

Cistanche může zabránit buněčné apoptóze

2. Materiály a metody

2.1. Reagencie.

Část materiálů a metod by měla být vyčerpávající, aby bylo možné všechny postupy opakovat. Je-li popsáno několik metod, lze jej rozdělit do nadpisových podsekcí. Potkaní myokardiální buňky H9c2 byly získány z buněčné banky Čínské akademie věd (Shanghai, Čína).C. deserticolaCistanchedeserticolaPhG-RE byl získán od Changchun Medicinal Material Co. (Changchun, Čína), identifikovaný Dr. Zhong-ying Liu (Škola farmaceutických věd, Jilin University) a uložen v herbáři katedry farmacie, Jilin University (vzorek voucheru číslo: YQCD2014). Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM) bylo získáno od GIBCO (Grand Island, NY). Thapsigargin a 4-PBA byly získány od společnosti Sigma (St. Louis, MO). Souprava pro stanovení aktivity laktátdehydrogenázy (LDH) a souprava CCK-8 byly zakoupeny od společnosti Dojindo Molecular Technologies (Tokio, Japonsko). Fetální bovinní sérum (FBS) bylo zakoupeno od HyClone (Utah, USA). Sada pro stanovení apoptózy buněk Annexin V-FITC byla zakoupena od Beyotime Biotechnology (Shanghai, Čína). Trypsin byl zakoupen od společnosti Beijing Solarbio Life Sciences (Peking, Čína). Souprava ReverTra Ace qPCR RT byla zakoupena od TOYOBO (Tokio, Japonsko). FastStart Universal SYBR Green master mix (Rox) byl zakoupen od Roche (Basilej, Švýcarsko).

2.2. Protilátky.

Králičí polyklonální GADD153/CHOP a králičí polyklonální GRP78/HSPA5 Abs byly zakoupeny od Novus (Colorado, USA). Myší/krysí kaspázová-12 afinitně purifikovaná polyklonální Ab byla zakoupena od R&D Systems (Minnesota, USA). Králičí fosfo-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (81E11) a králičí mAb -aktin (13E5) byly zakoupeny od Cell Signaling Technology (Massachusetts, USA). Fluorescenční sekundární Abs byly zakoupeny od LI-COR Biosciences (Nebraska, USA).

2.3. Seskupení a léčba.

Buňky H9c2 v logaritmické růstové fázi byly vybrány a ošetřeny v následujících skupinách: (1) kontrolní skupina: H9c2 myokardiální buňky byly kultivovány v kompletním médiu; (2) PhG-RE skupina: buňky byly ošetřeny po dobu 24 hodin v médiu obsahujícím 150 ug ml-1 PhG-RE; (3) Modelová skupina poranění vyvolaného ERS (skupina H2O2): buňky byly ošetřeny po dobu 18 hodin v médiu obsahujícím 100 μmol ml-1 H2O2; (4) Skupina (PhG-RE) –H2O2: buňky byly ošetřeny po dobu 24 hodin v médiu obsahujícím 150 ug ml-1 PhG-RE a poté po dobu 18 hodin ve 100 μmol ml-1 H2O2; (5) (4-PBA)

skupina –H2O2: buňky byly ošetřeny po dobu 24 hodin v kultivačním médiu obsahujícím 5 mmol·mL−1 4-PBA a poté po dobu 18 hodin ve 100 μmol·mL−1 H2O2; (6) Skupina TG: buňky byly ošetřeny

18 h v médiu obsahujícím 50 nmol·mL-1 TG; a (7) (PhG-RE) -TG: buňky byly ošetřeny po dobu 24 hodin v médiu obsahujícím 150 ug·mL-1 PhG-RE a poté po dobu 18 hodin v 50 nmol·mL-1 TG.

2.4. Buněčná kultura.

Buňky myokardu H9c2 byly kultivovány v DMEM obsahujícím 10 procent FBS a 1 procento penicilin-streptomycin při 37 stupních v inkubátoru s 5 procenty CO2. Kompletní médium bylo vyměňováno každé 2 dny. Buňky byly pozorovány pod mikroskopem a rostly dobře ve vřetenovitém tvaru. Když hustota růstu dosáhla 70 až 85 procent, buňky byly subkultivovány v poměru 1:4.

2.5. CCK-8 Posouzení životaschopnosti buněk.

Buňky H9c2 byly mikroskopicky zkoumány a byly vybrány buňky v logaritmické růstové fázi. Buněčná suspenze byla získána štěpením trypsinem a centrifugována po dobu 5 minut v 5ml centrifugační zkumavce při 1000 ot./min. Po odstranění zbytkové kapaliny byly 3 ml kompletního média DMEM použity k resuspendování buněčných pelet ve 100 μl na jamku a

5.0 103 buněk bylo spočítáno pod mikroskopem. Buňky byly přeneseny na 96-jamkovou destičku a kultivovány v inkubátoru (37 stupňů, 5 procent CO2) po dobu 24 hodin, aby se získaly zcela adherentní buňky. Optická hustota (OD) byla měřena při vlnové délce 450 nm.

Životaschopnost buněk ( procenta ) (experimentální skupina OD – slepá skupina OD)/(kontrolní skupina OD – slepá skupina OD) × 100 procent.

2.6. Spektrofotometrické měření poškození buněk.

Laktátdehydrogenáza (LDH) je enzym v cytoplazmě, který se uvolňuje po poškození buňky, která pak stabilně existuje v kultivačním médiu. Stupeň poškození buněk lze určit měřením aktivity LDH v médiu. Tento experiment byl proveden podle pokynů pro sadu. OD byla měřena při vlnové délce 490 nm. V každé skupině byly tři jamky.

2.7. Detekce apoptózy s barvením annexinem V-FITC/PI.

Supernatant byl odstraněn a přenesen do zkumavky s průtokovou cytometrií. Byla připravena buněčná suspenze s adherentními buňkami na dně nádoby na štěpení trypsinem. Poté, co byla suspenze centrifugována po dobu 6 minut při 1,{2}} r min-1, byl supernatant odstraněn a buněčné pelety byly třikrát promyty PBS. Tento experiment byl proveden podle instrukcí pro soupravu pro apoptózu buněk Annexin V-FITC. Poté, co byly buňky kultivovány po dobu 15 minut při teplotě místnosti ve tmě, byly buňky analyzovány průtokovým cytometrem.

2.8. RT-qPCR měření relativní mRNA exprese GRP78, CHOP, JNK a kaspázy-12.

Celková buněčná RNA byla extrahována činidlem TRIzol. Dva mikrolitry celkové RNA byly separovány gelovou elektroforézou pro hodnocení integrity extrakce. K měření a výpočtu hodnoty OD (260)/OD (280) byl použit spektrofotometr. Celková RNA byla reverzně transkribována, aby vznikla cDNA podle pokynů pro soupravu TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT. Tabulka 1 ukazuje seznam primerů. Podle pokynů pro hlavní směs Roche FastStart Universal SYBR Green (Rox) byly reakční podmínky následující: počáteční denaturace při 95 stupních po dobu 10 minut, 95 stupních 10 s, 58 stupních 30 s a 72 stupních 30 s celkem 45 cyklů.

2.9. Western blot analýza proteinové exprese GRP78, CHOP, JNK, p-JNK a kaspázy-12.

Proteinový lyzát (50 ug) byl separován elektroforézou na 10% separačním gelu s následným přenesením na PVDF membránu. PVDF membrána byla blokována v TBS-Resolution obsahujícím 5 procent odstředěného mléka při pokojové teplotě po dobu 90 minut. Blokovaná PVDF membrána byla inkubována přes noc s protilátkami 1, 2, 3 a 4 při 4 stupních a poté po dobu 90 minut s kozím anti-králičím IgG (1:1000) při teplotě místnosti. Nakonec byla membrána vyvinuta pomocí dvoubarevného infračerveného laserového zobrazovacího systému.

2.10. Statistické a analytické metody.

Data v této studii byla zpracována pomocí softwaru SPSS 24.0 a výsledky jsou uvedeny jako průměr ± SD. Data z více skupin byla porovnána s ANOVA, zatímco data ze dvou skupin byla porovnána s t-testy. Hodnota P < 0,05="" byla="" považována="" za="" statisticky="" významnou.="" ke="" kvantitativní="" analýze="" hodnot="" ve="" stupních="" šedi="" proteinových="" pásů="" byl="" použit="" software="">

fenylethanoidGlykosidyvcistanche

3. Výsledky

3.1. Vliv PhG-RE na životaschopnost buněk.

Jak je znázorněno na obrázku 1, ve srovnání s kontrolní skupinou se životaschopnost buněk H9c2 ve skupině PhG-RE významně nezměnila (P > 0.05), ale životaschopnost buněk buňky ve skupinách H2O2 i TG významně poklesly. Ve srovnání se skupinou H2O2 se významně zvýšila životaschopnost buněk jak ve skupinách (PhG-RE)-H2O2, tak (4-PBA)-H2O2. Ve srovnání se skupinou TG se životaschopnost buněk ve skupině (PhG-RE)-TG významně zvýšila. Všechny výsledky byly statisticky významné (P <>

3.2. Vliv poškození buněk PhG-REon.

Jak je znázorněno na obrázku 2, ačkoli buňky ve skupině PhG-RE byly poškozeny ve srovnání s buňkami v kontrolní skupině, toto poškození nedosáhlo statistické významnosti (P ​​> 0.05). Poškození buněk ve skupinách H2O2 a TG se významně zvýšilo. Ve srovnání se skupinou H2O2 se poškození buněk ve skupinách (PhG-RE)-H2O2 a (4-PBA)-H2O2 významně snížilo (P < 0,01).="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" tg="" se="" poškození="" buněk="" ve="" skupině="" (phg-re)-tg="" významně="" snížilo="" (p=""><>

3.3. Vliv PhG-RE na buněčnou apoptózu.

Jak je znázorněno na obrázku 3, ve srovnání s kontrolní skupinou se buněčná apoptóza ve skupině PhG-RE významně nezměnila (P > 0.05), zatímco apoptóza u H2O2 a TG skupiny se významně zvýšily (P < 0,01).="" ve="" srovnání="" s="" apoptózou="" skupiny="" h2o2,="" buněčná="" apoptóza="" v="" (phg-re)-h2o2="" a="">

skupiny se výrazně snížily (P < {{0}}.01).="" ve="" srovnání="" s="" apoptózou="" ve="" skupině="" tg="" se="" apoptóza="" buněk="" ve="" skupině="" (phg-re)-tg="" významně="" snížila="" (p=""><>

3.4. Vliv PhG-RE na expresi mRNA GRP78, CHOP, JNK a kaspázy-12.

Relativní exprese mRNA v každé experimentální skupině byla kvantitativně měřena pomocí RT-qPCR. Jak ukazuje obrázek 4, ve srovnání s kontrolní skupinou se relativní mRNA exprese GRP78, CHOP a kaspázy-12 významně zvýšila (P < 0.01)="" v="" h2o2="" a="" relativní="" mrna="" exprese="" jnk="" se="" také="" zvýšila="" (p="">< 0.05).="" ve="" skupině="" tg="" se="" relativní="" exprese="" mrna="" grp78,="" chop,="" jnk="" a="" kaspázy-12="" významně="" zvýšila="" (p="">< 0.01).="" ve="" srovnání="" s="" expresí="" h2o2="" se="" relativní="" mrna="" exprese="" grp78,="" chop="" a="" kaspázy-12="" ve="" skupinách="" (phg-re)-h2o2="" a="" (4-pba)-h2o2="" významně="" snížila="" (p="">< 0.01),="" zatímco="" relativní="" mrna="" exprese="" jnk="" se="" signifikantně="" nezměnila="" (p=""> 0,05). Ve srovnání se skupinou TG se relativní exprese mRNA GRP78, JNK a kaspázy-12 ve skupině (PhG-RE)-TG snížila (P < 0,01)="" a="" relativní="" exprese="" mrna="" chop="" se="" nezměnila.="" se="" výrazně="" změní="" (p=""> 0,05).

3.5. Vliv PhG-RE na proteinovou expresi GRP78, CHOP a kaspázy-12.

Obrázek 5 ukazuje hladiny proteinové exprese GRP78, CHOP a kaspázy-12. Ve srovnání s kontrolní skupinou se exprese těchto tří proteinů ve skupinách H2O2 a TG po ošetření buněk významně zvýšila (P < 0.01).="" ve="" srovnání="" s="" expresí="" skupiny="" h2o2="" se="" exprese="" grp78,="" chop="" a="" kaspázy-12="" významně="" snížila="" ve="" skupinách="" (phg-re)-h2o2="" a="" (4-pba)-h2o2="" (p="">< 0,01)="" .="" ve="" srovnání="" s="" tg="" skupinou="" se="" exprese="" grp78,="" chop="" a="" kaspázy-12="" ve="" skupině="" (phg-re)-tg="" významně="">

3.6. Vliv PhG-RE na JNK a p-JNK.

Jak je znázorněno na obrázku 6, ve srovnání s kontrolní skupinou se exprese p-JNK ve skupinách H2O2 a TG významně zvýšila (P < 0.01).="" ve="" srovnání="" s="" expresí="" skupiny="" h2o2="" se="" exprese="" p-jnk="" ve="" skupinách="" (phg-re)-h2o2="" a="" (4-="" pba)-h2o2="" významně="" snížila="" (p="">< 0).{24}="" }1).="" ve="" srovnání="" s="" tg="" skupinou="" se="" exprese="" p-jnk="" ve="" skupině="" (phg-re)-tg="" významně="" snížila="" (p="">< 0,01).="" co="" se="" týče="" exprese="" jnk,="" nebyly="" žádné="" významné="" změny="" v="" žádné="" z="" experimentálních="" skupin="" (p=""> 0,05).

Cistanchemůže zabránitbuňkaapoptóza