czJazyk
Domů / Znalost / Obsah

Znalost

Plumbagin potlačuje melanogenezi indukovanou MSH v buňkách myšího melanomu B16F10 inhibicí aktivity tyrosinázy, část 2

May 09, 2023

3. Diskuse

Plumbagin je sekundární metabolit rostlinného původu a vykazuje několik biologických funkcí, včetně protizánětlivých, protirakovinných, antialergických a antibakteriálních aktivit [8,9]. Nebylo však známo, zda měl plumbagin inhibiční účinek na melanogenezi spojenou s hyperpigmentací a melanomem. V této studii jsme prokázali, že plumbagin silně potlačuje melanogenezi v melanomových buňkách B16F10, a tato práce by mohla poskytnout příležitost pro vývoj kosmetiky pro péči o pleť založené na protizánětlivých, antialergických, antibakteriálních a antimelanogenetických aktivitách plumbaginu.

Podle relevantních studií je cistanche běžnou bylinou, která je známá jako „zázračná bylina, která prodlužuje život“. Jeho hlavní složkou je cistanosid, který má různé účinky, jako je antioxidační, protizánětlivý a podpora imunitních funkcí. Mechanismus mezi cistanche a bělením kůže spočívá v antioxidačním účinku cistanchových glykosidů. Melanin v lidské kůži vzniká oxidací tyrosinu katalyzovanou tyrosinázou a oxidační reakce vyžaduje účast kyslíku, takže se volné radikály v těle stávají důležitým faktorem ovlivňujícím produkci melaninu. Cistanche obsahuje cistanosid, což je antioxidant a může snižovat tvorbu volných radikálů v těle, čímž inhibuje produkci melaninu.

cistanche nedir

Klikněte na Rou Cong Rong Výhody pro bělení

Další informace:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Protože upregulace melanogeneze je často pozorována u maligního melanomu s nadměrně exprimovanými hladinami tyrosinázy v krvi i v nádorových tkáních, je zřejmé, že melanogeneze je potenciálním cílem chemoterapie maligních melanomů [1]. V této studii jsme zjistili, že plumbagin přímo potlačuje aktivitu tyrosinázy nezávisle na transkripčním aparátu spojeném s melanogenezí (obrázek 6). Naše výsledky proto naznačují, že plumbagin může být potenciální složkou preventivní a terapeutické strategie pro léčbu maligního melanomu. Byly skutečně popsány antimelanomové, chemosenzibilizační a radiosenzibilizační účinky plumbaginu na terapii melanomu [17–21].

cistanche gnc

V předchozích studiích zabývajících se protirakovinnými a protizánětlivými účinky plumbaginu bylo v modelech in vitro použito přibližně 5–10 µM plumbaginu (vyšší než koncentrace použitá v této studii) [17,22 ,23]. Proto jsme zkoumali toxický účinek plumbaginu v proliferativních buňkách, včetně normálních keratinocytů (HaCaT) a čočkových epiteliálních buněk (B3), které mohou být poškozeny kosmetikou pro péči o pleť. Naše výsledky ukázaly, že nižší koncentrace, přibližně 0,5–1 µM plumbaginu, nejsou toxické pro normální keratinocyty a epiteliální buňky čočky, ale jsou dostatečně účinné ke snížení aktivity tyrosinázy a syntézy melaninu. Kromě toho jsme také zjistili, že plumbagin účinněji potlačuje melanogenezi než 1 mM arbutin nebo 0,2 mM kyselina kojová, což jsou dobře známá činidla pro bělení kůže. Tyto výsledky naznačují, že plumbagin je bezpečný pro použití jako složka pro vývoj kosmetiky pro bělení pokožky.

V této studii jsme studovali inhibiční účinky plumbaginu na tyrosinázovou enzymatickou reakci pomocí testů buněčné a bezbuněčné tyrosinázové aktivity založených na oxidaci L-DOPA. Přesto jsme nenavrhli přesný molekulární mechanismus, jak plumbagin inhibuje aktivitu tyrosinázy. Tento mechanismus by měl být dále prozkoumán, aby se zjistilo, zda plumbagin přímo interaguje s tyrosinázou a inhibuje její oxidázovou aktivitu, nebo zda má nepřímé účinky, které vedou ke snížení aktivity tyrosinázy.

4. Materiály a metody

4.1. Reagencie a protilátky

Plumbagin, -MSH (M4135), arbutin (A4256), kyselina kojová (K3125), L-DOPA (333786) a tyrosináza (T3824) purifikované z hub byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Protilátky proti MITF (# 12590), p-AKTS473 (# 4060), p-AKTT308 (# 13038), p-CREB (# 9198), p-ERK1/2 (# 4370), ERK1/2 (# 9102), H2AX (č. 9718), PARP (č. 5625) a kaspáza-3 (č. 9665) byly zakoupeny od společnosti Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Tyrosináza (sc-7833) a -tubulin (sc-9104) byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA).

cistanche norge

4.2. Buněčná kultura a zkouška buněčné životaschopnosti

Buňky B16F10 (buňky myšího melanomu), B3 (buňky epitelu lidské čočky) a HaCaT (lidské keratinocyty) byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) doplněném 10 procenty fetálního hovězího séra a 25 mM glukózy. Buňky byly inkubovány ve zvlhčené atmosféře 95 procent vzduchu a 5 procent CO2 při 37 ◦C. Pro měření životaschopnosti byly buňky inkubovány s různými koncentracemi plumbaginu rozpuštěného v dimethylsulfoxidu (DMSO) po dobu 48 nebo 72 hodin. Po inkubaci byly kultivované buňky promyty PBS a poté inkubovány s 0,5% roztokem pro barvení krystalovou violetí po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Pro měření optické hustoty byly obarvené buňky inkubovány s 1% roztokem dodecylsulfátu sodného (SDS) po dobu 15 minut při teplotě místnosti a optická hustota každé jamky byla poté měřena při 570 nm (OD570) pomocí čtečky absorbance (BioTek, Winooski, VT, USA).

4.3. Imunoblotting

Kultivované buňky byly lyžovány s použitím 1 procenta IGEPAL (oktylfenoxypolyethoxyethanol), 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM NaF a koktejlu inhibitoru proteázy v lyzačním pufru. Vzorky proteinů byly separovány pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) a separované proteiny byly poté přeneseny na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu (Millipore, Billerica, MA, USA). Membrány byly inkubovány přes noc s primárními protilátkami (1:1{15}}) při 4 °C a poté inkubovány s HRP-konjugovanými sekundárními protilátkami (1:10 000) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Proteiny byly vizualizovány pomocí soupravy ECL Prime (GE Healthcare Pittsburgh, PA, USA).

4.4. Měření intracelulárního a extracelulárního obsahu melaninu

Obsah melaninu byl stanoven a kvantifikován pomocí dříve popsané metody s mírnou modifikací [2,24]. Pro analýzu obsahu melaninu byly buňky B16F10 kultivovány v DMEM bez fenolové červeně obsahujícím 10 procent fetálního hovězího séra. Buňky B16F10 byly kultivovány s ošetřením -MSH v nepřítomnosti nebo přítomnosti plumbaginu po dobu 3 nebo 4 dnů. Kultivované buňky nebo média byly sklizeny a pelety byly rozpuštěny v 1N NaOH obsahujícím 10 procent DMSO při 80 °C po dobu 1 hodiny. Obsah melaninu byl měřen pomocí snímače absorbance při 475 nm (OD475) a obsah melaninu byl poté normalizován na koncentraci buněčného proteinu.

does cistanche work

4.5. Izolace RNA a kvantitativní RT-PCR

Celková RNA byla extrahována z buněk B16F10 pomocí TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA) a 2 ug celkové RNA byly použity pro syntézu cDNA s použitím vysokokapacitní cDNA reverzní transkripční soupravy (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Kvantitativní PCR byla provedena pomocí SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Sekvence PCR primerů (50-30 ) byly následující: TCAAGTTTCCAGAGACGGGT a CATCATCAGCCTGGAATCAA pro MITF; ATAGGTGCATTGGCTTCTGG a TCTTCACCATGCTTTTGTGG pro TYR; CATTTCCAG CTGGGTTTCTC a TGGTCTGTGAATCCTTGGAA pro TYRP1.

4.6. Test buněčné tyrosinázové aktivity

Aktivita buněčné tyrosinázy byla stanovena pomocí dříve popsané metody s modifikací [25,26]. Kultivované buňky B16F10 byly inkubovány s -MSH v nepřítomnosti nebo přítomnosti plumbaginu a buňky byly poté promyty a lyžovány PBS obsahujícím 1 procento deoxycholátu sodného a 0,5 procenta Triton X{{8} }. Poté, co byla stanovena koncentrace proteinu, bylo 50 ug proteinu inkubováno s 2,0 mM L-DOPA a 0,1 M PBS (pH 6,8) po dobu 1 hodiny při 37 °C. Oxidace L-DOPA byla měřena při 475 nm (OD475) za použití snímače absorbance. Aktivita byla měřena pomocí následujícího vzorce: aktivita tyrosinázy (procenta)=(OD475 vzorku/OD475 kontroly) x 100.

4.7. Test aktivity bezbuněčné tyrosinázy

Pro stanovení inhibičního účinku plumbaginu na aktivitu tyrosinázy byla vyčištěná houbová tyrosináza inkubována po dobu 2 hodin s reakční směsí obsahující 0,1 M PBS (pH 6,8) a 2 mM L-DOPA v nepřítomnosti nebo přítomnosti plumbaginu. . Oxidace L-DOPA na dopacrom byla měřena při 475 nm (OD475) pomocí snímače absorbance. Aktivita byla měřena pomocí následujícího vzorce: aktivita tyrosinázy (procenta)=(OD475 vzorku/OD475 kontroly) x 100.

4.8. Test aktivity DPPH zachycující radikály

Ke stanovení aktivity plumbaginu pohlcující radikály byl připraven a použit roztok {{0}},2 mM DPPH v methanolu. Každý vzorek byl zředěn destilovanou vodou na konečné koncentrace 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2 a 5 mg/ml (plumbagin) nebo { {13}}.005, 0.01, 0,05, 0,1, 0,2 a 0,5 mg/ml (vitamín C). Po reakci byla měřena optická hustota (OD) při 517 nm (OD517) pomocí absorbančního snímače. Aktivita vychytávání volných radikálů byla vypočtena pomocí následujícího vzorce: Aktivita vychytávání radikálů DPPH ( procenta )=10 − ((ODs/ODc) × 100), kde ODs představuje absorbanci vzorků a ODc představuje absorbanci ovládání vozidla.

4.9. Statistická analýza

Všechna data byla analyzována pomocí nepárového Studentova t-testu pro dvě experimentální srovnání a jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA) s Tukeyho post hoc testem pro vícenásobná srovnání pomocí Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Data jsou prezentována jako průměr ± standardní odchylka (SD). Rozdíly mezi průměrnými hodnotami byly považovány za statisticky významné, když byla související p-hodnota menší než 0,05.

5. Závěry 

Hlavní zjištění této studie jsou, že plumbagin (i) potlačuje -MSH-indukovanou syntézu melaninu inhibicí tyrosinázové aktivity; (ii) neovlivňuje transkripční aparát spojený s MITF a kaskády přenosu signálu včetně aktivace AKT a ERK1/2 spojené s melanogenezí; a (iii) nezpůsobuje toxicitu v normálních keratinocytech (HaCaT) a čočkových epiteliálních (B3) buňkách, když jeho koncentrace byla nižší než 5 uM. Celkově vzato, plumbagin ruší -MSH-indukovanou syntézu melaninu inhibicí aktivity tyrosinázy nezávisle na transkripční ose CREB-MITF. Tyto výsledky tedy naznačují slibný a bezpečný přírodní produkt plumbagin pro snížení hyperpigmentace jeho použitím při vývoji kosmetiky pro bělení pokožky.

cistanche and tongkat ali reddit

Poděkování:Tato práce byla podpořena Konkuk University v roce 2016.
Příspěvky autora:Ji-Hong Lim vymyslel a navrhl experimenty; Experimenty provedli Taek-In Oh, Jeong-Mi Yun, Eun-Ji Park a Young-Seon Kim; Ji-Hong Lim, Taek-In Oh a Yoon-Mi Lee analyzovali data; Ji-Hong Lim a Yoon-Mi Lee napsali rukopis.
Střet zájmů:Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Zkratky

-MSH hormon stimulující alfa-melanocyty
TYR tyrosináza
L-DOPA L-3,4-dihydroxyfenylalanin
MITF transkripční faktor spojený s mikroftalmií
TYRP1 protein související s tyrosinázou 1
CREB cAMP protein vázající prvek odpovědi
PKA protein kináza A
ERK1/2 extracelulárním signálem regulovaná kináza 1/2

Reference

1. Riley, PA Melanogeneze a melanom. Pigment Cell Res. 2003, 16, 548–552. [CrossRef] [PubMed]

2. Bae, JS; Han, M.; Yao, C.; Chung, JH Chaetocin inhibuje IBMX-indukovanou melanogenezi v B16F10 myších melanomových buňkách prostřednictvím aktivace ERK. Chem. Biol. Komunikujte. 2016, 245, 66–71. [CrossRef] [PubMed]

3. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Signální dráhy v melanogenezi. Int. J. Mol. Sci. 2016. [CrossRef] [PubMed]

4. Kim, HJ; Yonezawa, T.; Teruya, T.; Woo, JT; Cha, BY Nobiletin, polyethoxyflavonoid, redukovaný endotelin-1 plus SCF-indukovaná pigmentace v lidských melanocytech. Photochem. Photobiol. 2015, 91, 379–386. [CrossRef] [PubMed]

5. Kang, SJ; Choi, BR; Lee, EK; Kim, SH; Yi, HY; Park, HR; Song, CH; Lee, YJ; Ku, SK Inhibiční účinek sušeného koncentračního prášku z granátového jablka na melanogenezi v buňkách melanomu B16F10; zapojení signálních drah p38 a PKA. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 24219–24242. [CrossRef] [PubMed]

6. Kim, JW; Kim, HI; Kim, JH; Kwon, OC; Syn, ES; Lee, CS; Park, YJ Účinky ganodermanondiolu, nového inhibitoru melanogeneze z léčivé houby Ganoderma lucidum. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1798. [CrossRef] [PubMed]

7. Tsao, YT; Huang, YF; Kuo, CY; Lin, YC; Chiang, WC; Wang, WK; Hsu, CW; Lee, CH Hinokitiol inhibuje melanogenezi prostřednictvím signalizace AKT/mTOR v buňkách myšího melanomu B16F10. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 248. [CrossRef] [PubMed]

8. Padhye, S.; Dandawate, P.; Yusufifi, M.; Ahmad, A.; Sarkar, FH Pohledy na léčivé vlastnosti plumbaginu a jeho analogů. Med. Res. Rev. 2012, 32, 1131–1158. [CrossRef] [PubMed]

9. Gupta, SC; Kim, JH; Prasad, S.; Aggarwal, BB Regulace přežití, proliferace, invaze, angiogeneze a metastázování nádorových buněk prostřednictvím modulace zánětlivých drah pomocí nutraceutik. Rakovinové metastázy Rev. 2010, 29, 405–434. [CrossRef] [PubMed]

10. Jackson, JK; Higo, T.; Hunter, WL; Burt, HM inhibitory topoizomerázy jako antiartritická činidla. Inflflamm. Res. 2008, 57, 126–134. [CrossRef] [PubMed]

11. Ahmad, A.; Banerjee, S.; Wang, Z.; Kong, D.; Sarkar, FH Plumbaginem indukovaná apoptóza lidských buněk rakoviny prsu je zprostředkována inaktivací NF-κB a Bcl-2. J. Cell. Biochem. 2008, 105, 1461–1471. [CrossRef] [PubMed]

12. Aziz, MH; Dreckschmidt, NE; Verma, AK Plumbagin, naftochinon získaný z léčivých rostlin, je novým inhibitorem růstu a invaze hormonorezistentní rakoviny prostaty. Cancer Res. 2008, 68, 9024–9032. [CrossRef] [PubMed]

13. Thasni, KA; Rakesh, S.; Rojini, G.; Ratheeshkumar, T.; Srinivas, G.; Priya, S. Estrogen-dependentní buněčná signalizace a apoptóza v BRCA1-blokovaných buňkách rakoviny vaječníků BG1 v reakci na plumbagin a další chemoterapeutika. Ann. Oncol. 2008, 19, 696–705. [CrossRef] [PubMed]

14. Gomathinayagam, R.; Sowmyalakshmi, S.; Mardhatillah, F.; Kumar, R.; Akbarsha, MA; Damodaran, C. Protirakovinný mechanismus plumbaginu, přírodní sloučeniny, na buňky nemalobuněčného karcinomu plic. Anticancer Res. 2008, 28, 785–792. [PubMed]

15. Wang, CC; Chiang, YM; Sung, SC; Hsu, YL; Chang, JK; Kuo, PL Plumbagin indukuje zástavu buněčného cyklu a apoptózu prostřednictvím reaktivních forem kyslíku/c-Jun N-terminálních kinázových drah v buňkách lidského melanomu A375.S2. Cancer Lett. 2008, 259, 82–98. [CrossRef] [PubMed]

16. Shih, YW; Lee, YC; Wu, PF; Lee, YB; Chiang, TA Plumbagin inhibuje invazi a migraci buněk HepG2 rakoviny jater snížením produkce matrix metaloproteinázy-2 a aktivátoru urokinázy-plasminogenu. Hepatol. Res. 2009, 39, 998–1009. [CrossRef] [PubMed]

17. Anuf, AR; Ramachandran, R.; Krishnasamy, R.; Gándhí, PS; Periyasamy, S. Antiproliferativní účinky Plumbago rosea a jeho purifikované složky plumbaginu na melanomové buněčné linie SK-MEL 28. Pharmacogn. Res. 2014, 6, 312–319.

18. Gowda, R.; Sharma, A.; Robertson, GP Synergické inhibiční účinky celekoxibu a plumbaginu na růst melanomového nádoru. Cancer Lett. 2017, 385, 243–250. [CrossRef] [PubMed]

19. Li, J.; Shen, Q.; Peng, R.; Chen, R.; Jiang, P.; Li, Y.; Zhang, L.; Lu, J. Plumbagin zvyšuje apoptózu zprostředkovanou TRAIL prostřednictvím up-regulace receptoru smrti v buňkách lidského melanomu A375. J. Huazhong Univ. Sci. Technol. Med. Sci. 2010, 30, 458–463. [CrossRef] [PubMed]

20. Nair, S.; Nair, RR; Srinivas, P.; Srinivas, G.; Pillai, MR Radiosenzibilizační účinky plumbaginu v buňkách rakoviny děložního čípku jsou prostřednictvím modulace apoptotické dráhy. Mol. Carcinog. 2008, 47, 22–33. [CrossRef] [PubMed]

21. Prasad, VS; Devi, PU; Rao, BS; Kamath, R. Radiosenzibilizační účinek plumbaginu na buňky myšího melanomu pěstované in vitro. Indian J. Exp. Biol. 1996, 34, 857-858. [PubMed]

22. Li, YC; On, SM; On, ZX; Li, M.; Yang, Y.; Pang, JX; Zhang, X.; Chow, K.; Zhou, Q.; Duan, W.; a kol. Plumbagin indukuje apoptotickou a autofagickou buněčnou smrt prostřednictvím inhibice dráhy PI3K/Akt/mTOR v lidských buňkách nemalobuněčného karcinomu plic. Cancer Lett. 2014, 344, 239–259. [CrossRef] [PubMed]

23. Checker, R.; Sharma, D.; Sandur, SK; Khanam, S.; Poduval, TB Protizánětlivé účinky plumbaginu jsou zprostředkovány inhibicí aktivace NF-κB v lymfocytech. Int. Immunopharmacol. 2009, 9, 949–958. [CrossRef] [PubMed]

24. Kim, B.; Lee, SH; Choi, KY; Kim, HS N-Nicotinoyl tyramin, nový derivát niacinamidu, inhibuje melanogenezi potlačením genové exprese MITF. Eur. J. Pharmacol. 2015, 764, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

25. Lee, HY; Jang, EJ; Bae, SY; Jeon, JE; Park, HJ; Shin, J.; Lee, SK Antimelanogenní aktivita Gauguinu D, vysoce okysličeného diterpenoidu z mořské houby Phorbas sp., prostřednictvím modulace exprese a degradace tyrosinázy. Mar. Drugs 2016, 14, 212. [CrossRef] [PubMed]

26. Winder, AJ; Harris, H. Nové testy pro tyrosinhydroxylázové a DOPA oxidázové aktivity tyrosinázy. Eur. J. Biochem. 1991, 198, 317–326. [CrossRef] [PubMed]

Další informace: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Mohlo by se Vám také líbit