Pinocembrin zlepšuje poinfarktové srdeční selhání prostřednictvím aktivace signální dráhy Nrf2/HO-1, část 1

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Abstraktní

Pozadí:Oxidační stres je důležitým faktorem podílejícím se na progresi srdečního selhání. Současná studie byla provedena s cílem zjistit, zda je pinocembrin schopen zmírnit postinfarktové srdeční selhání (PIHF) a základní mechanismy.

Kliknutím sem se dozvíte více

Metody:U potkanů ​​byla provedena ligace levé přední sestupné tepny k vyvolání infarktu myokardu a následně chováni po dobu 6 týdnů k vyvolání chronického srdečního selhání. Poté byl podáván pinocembrin každý druhý den po dobu 2 týdnů. Účinky byly hodnoceny pomocí echokardiografie, western blotu, Massonova barvení, biochemických vyšetření, imunohistochemie a fluorescence. In vitro jsme také kultivovali H9c2 kardiomyocyty a srdeční myofibroblasty, abychom dále potvrdili mechanismy.

Výsledek:Zjistili jsme, že PIHF-indukovaná zhoršení srdečních funkcí byla významně zlepšena podáváním pinocembrinu. Kromě toho léčba pinocembrinem také zeslabila ukládání kolagenu a rozšířila receptor vaskulárního endoteliálního růstového faktoru 2 v hraniční zóně infarktu spolu s oslabenou apoptózou, která souvisela se zmírněním oxidačního stresu doloženého snížením reaktivních forem kyslíku (ROS) v srdeční tkáni a malondialdehydu (MDA) v séru a zvýšení superoxiddismutázy (SOD). To bylo doprovázeno upregulací dráhy jaderného faktoru erytroidního 2-faktoru 2 souvisejícího (Nrf2)/hemoxygenázy-1(HO-1). Experimenty in vitro jsme zjistili, že specifický inhibitor Nrf2 významně zvrátil účinky vyplývající z pinocembrinu včetně antioxidantů, antiapoptózy, antifibrózy a neovaskularizace, což dále ukázalo, že zlepšení PIHF pinocembrinem bylo v Nrf2/HO-1 způsobem závislým na cestě.

Cistanche může zlepšit imunitu

Závěr:Pinocembrin zlepšil srdeční funkce a remodelaci vyplývající z PIHF vychytáváním ROS a aktivací dráhy Nrf2/HO-1, což dále zeslabilo ukládání kolagenových vláken a apoptózu a usnadnilo angiogenezi.

klíčová slova:Pinocembrin, srdeční selhání, oxidační stres, Nrf2/HO-1

Úvod

Srdeční selhání (HF), charakterizované řadou terminálních klinických syndromů vyplývajících ze strukturálních a/nebo funkčních poruch srdce, zůstává globální zdravotní zátěží, přičemž hlavní příčinou je infarkt myokardu (MI) (Ziaeian a Fonarow 2016; Galli a Lombardi 2016; Rengo et al. 2013). Navzdory velkému pokroku, kterého bylo dosaženo v terapiích a kvalitě péče u srdečního selhání, existuje odhadovaná prevalence 37,7 milionu osob každý rok na celém světě spolu s 50% úmrtností po 5 letech od diagnózy srdečního selhání (Go et al. .2014). Současné dilema lze částečně připsat tomu, že postinfarktové HF (PIHF) sestává z široké škály patofyziologických mechanismů, na které se současné terapeutické metody nemohou zcela odkázat.

Hromadné studie ukázaly, že oxidativní stres (OS) se převážně podílí na patologické progresi PIHF (Dubois-Deruy et al. 2020; Ma et al. 2019; Bubb et al. 2017; Habtemariam 2019). OS, prezentované především nadměrná akumulace volných radikálů/reaktivních forem kyslíku (ROS) obsahujících hydroxylový radikál, superoxid, oxid dusnatý atd. (Dubois-Deruy et al. 2020; Habtemariam 2019), bylo prokázáno, že může vyvolat oxidativní modifikaci nebo poškození lipidů , proteiny a DNA, s poruchami organel, zánětem, apoptózou v myocytech a supervencí intersticiální fibrózy (Dubois-Deruy et al. 2020; Bubb et al. 2017; Hermida et al. 2018). Vzhledem k četným škodlivým účinkům ROS byly antioxidanty brány v úvahu při terapiích PIHF, jejichž mechanismy spočívají v přímém vychytávání ROS a/nebo stimulaci antioxidační obrany obsahující glutathion, superoxiddismutázu (SOD), katalázu atd.( Habtemar-iam 2019). Bylo však politováníhodné, že aplikace některých antioxidantů, ani vitaminu E (Lee et al. 2005) ani resveratrolu (Made et al. 2015; Olesen et al. 2014), nepřinesla spokojenost v terapii kardiovaskulárních chorob. svědčí o selhání ve zlepšování srdečních funkcí. Proto jsou v terapii PIHF vyžadovány účinnější antioxidanty.

Pinocembrin (Pino) ​​(chemická struktura je znázorněna na obr. 1A) je přírodní flavonoidová sloučenina, kterou lze extrahovat z medu, propolisu a několika dalších rostlin (Lan et al.2015; umělá syntéza (Costa a Leitao 2011), která má protizánětlivé, antibakteriální, protirakovinné a protirakovinné účinky (Rasul et al. 2013; Ye et al. 2019), spolu se zdůrazněným antioxidačním účinkem (Kim et al. 2020; Sangweni et al. .2020). Jak bylo ukázáno dříve, fenolická struktura Pino zodpovědná za přímou eliminaci ROS, stejně jako fenolické i nefenolické struktury, které zesilují antioxidační obranu (Habtemariam 2019), odpovídají za antioxidační účinek Pino, díky kterému byl Pino studován a aplikován v širokém měřítku. různých onemocnění, jako jsou neurodegenerativní onemocnění, ateroskleróza, doxorubicinem indukovaná kardiomyocytová toxicita (Sangweni et al. 2020; Sang et al. 2012; Liu et al. 2014). Avšak vzhledem k tomu, že několik antioxidantů pro infarkt myokardu a HF je neplatných nebo nedostačujících pro převedení na klinické použití, zůstává nedostatečně pochopeno, zda by antioxidační účinek Pino mohl být splněn v terapii PIHF. Tento výzkum byl tedy proveden s cílem zjistit, zda podávání Pino může mít blahodárné účinky na PIHE, slibuje, že bude novou, nebo ne-li dominantní, ale alespoň pomocnou léčbou.

Metody a materiály

Zvířecí model a protokol experimentu

56 samců krys Sprague-Dawley, zakoupených od centra pro pokusy na zvířatech China Three Gorges University,

byly chovány ve Wuhan č. 3 nemocniční správě zvířat. Všechny experimenty byly oficiálně povoleny a prováděny v Hubei Key Laboratory of Cardiology v souladu s Příručkou pro péči a používání laboratorních zvířat publikovanou americkým Národním institutem zdraví (publikace NIH č.{1}}, revidovaná v roce 1996).

Potkani nejprve podstoupili ligaci levé přední sestupné koronární arterie (LAD) nebo simulovanou operaci. Stručně řečeno, krysy byly anestetizovány 3% pentobarbitalem (2 ml/kg; Sigma-Aldridge, St. Louis, USA, intraperitoneálně), následovala tracheální intubace a podpora dýchání (dechový objem: 5-10 ml, rychlost: 70krát za minutu). Následná expozice srdce byla provedena a LAD byla podvázána 7-0 monofilamentními nylonovými stehy. Výskyt bledosti apexcordis nebo elevace ST segmentu na I svodu elektrokardiogramu indikoval indukci IM. Falešná operace podstoupila identické procedury kromě ligace LAD. Penicilin (200,{9}} IU) byl podáván intramuskulárně jednou denně po dobu jednoho týdne po operaci.

Afterward, the rats were carefully raised for 6 weeks to produce PIHF. Rats were then randomly split into 4 groups:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 mg/kg, purity>98 procent; Sigma-Aldridge) nebo stejný objem fyziologického roztoku byl injikován intravenózně do ocasní žíly každý druhý den po dobu 2 týdnů. Dávkování odkazovalo na předchozí studii (Lan et al.2017). Protokol byl znázorněn na obr. 1B.

Kontrolní pozitivní kontrolní krysy obsahovaly 3 skupiny: simulace plus fyziologický roztok (skupina simulace); ligace LAD plus fyziologický roztok (skupina HF); Ligace LAD plus enalapril (skupina HF plus ACEI). Krysy podstoupily odpovídající operace kromě toho, že krysy ze skupiny HF plus ACEI byly krmeny orálně 20 mg/kg enalaprilu.

Echokardiografická měření

Srdeční funkce byly hodnoceny transtorakální echokardiografií s použitím ultrazvukového zobrazovacího systému (Vevo 2100, Visual Sonics Inc., Toronto, Kanada), jak bylo dříve uvedeno v naší skupině (Fo et al. 2020). Vnitřní rozměr levé komory v koncovém diastolickém stadiu (LVIDd) a koncovém systolickém stadiu (LVID), koncový systolický a enddiastolický objem levé komory (LVESV a LVEDV) byly zaznamenány pomocí dvourozměrných echokardiogramů v M-módu po dobu nejméně 3 po sobě jdoucích cyklů pro každou krysu. Následně byly vypočteny ejekční frakce levé komory (LVEF) a frakční zkrácení (FS), které odrážely systolickou funkci.

příprava vzorků

Po podání Pino a echokardiografických testů byly krysy znovu anestetizovány. Více než 2 ml žilní krve bylo zachyceno z ocasní žíly do vakuových zkumavek pro odběr krve obsahujících kyselinu ethylendiamintetraoctovou (EDTA) s postupným odstřeďováním při rychlosti 3000 ot./min po dobu 15 minut a při teplotě 4 °C s následnou izolací sérový supernatant a konzervace při -80 "C. Poté byla srdce rychle odebrána. Část infarktové hraniční zóny každého srdce byla odříznuta a zmražena v kapalném dusíku pro analýzu western blot, přičemž ostatní srdeční tkáň byla fixována ve 4 procent paraformaldehydu po dobu delší než 24 hodin.

Massonovo barvení

Provedli jsme Massonovo barvení, abychom detekovali ukládání kolagenu v hraniční zóně infarktu. Komory fixované paraformaldehydem byly zality parafinem a poté rozřezány na 5-μm řezy. Řezy byly následně obarveny Massonovým trichromem, kde byl kolagen obarven modře, myokard růžově a jádro černě. Podíl depozice kolagenu byl vypočten pomocí softwaru Image J (NIH, Bethesda, MD) při x 200 zvětšení.

Imunohistochemická analýza

Imunohistochemická analýza byla provedena za účelem vyhodnocení hustoty receptoru vaskulárního endoteliálního růstového faktoru 2 (VEGFR2), jehož upregulace podporovala angiogenezi, která byla prospěšná a důležitá pro zmírnění remodelace (Rengo et al. 2013). Komorové řezy byly vyrobeny jako ty, které byly provedeny v Massonově barvení, poté byly odstraněny parafiny a rehydratovány. Poté byly řezy získány teplem zprostředkovaným získáváním antigenu a byly ošetřeny 3 procenty H,O, aby se blokovala endogenní peroxidáza, s inkubací 1 ug/ml protilátky VEGFR2 (Abcam, ab9530) po dobu 12 hodin při 4 stupních splněno. Poté byly řezy inkubovány sekundární protilátkou značenou křenovou peroxidázou (HRP) (1:200, Service, G1213) po dobu 50 minut při 37 stupních. Kromě toho byl k vytvoření pozitivního zbarvení použit 3,3'-diaminobenzidin. zobrazeno žlutohnědě. Nakonec byla analyzována a vypočtena průměrná optická hustota VEGFR2 pomocí softwaru Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA).

Test značení terminální deoxynukleotidyl transferázou zprostředkované nick-end (TUNEL).

Apoptóza byla následně detekována testem TUNEL. Dříve vyrobené parafínové hmoty, které obsahují komorovou tkáň, byly nakrájeny na jiné řezy pro test TUNEL, poté následovalo barvení TUNEL podle pokynů výrobce komerční testovací soupravy (Roche, Švýcarsko; 11684817910). Stručně řečeno, komorové řezy byly vystaveny činidlu TUNEL, kde byly TdT a dUTP smíchány v poměru 1:9, po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, po inkubaci proteinázy K a prasknutí buněčné membrány. Nakonec byly fluorescenční obrazy pozorovány při vlnové délce 530 nm, která byla spuštěna emisní vlnovou délkou 450 nm (zvětšení x 400). Apoptotická rychlost ventrikulárních tkání v každé skupině byla analyzována a vypočtena pomocí Image Software.

Western blot

Implementujeme western blot, abychom objasnili základní mechanismy, kterými Pino zlepšil PIHF. Postupy extrakce a přípravy proteinových vzorků se podobaly těm, které byly dříve popsány v naší studii (Chen et al.2020a). Membrány byly sondovány protilátkami proti jadernému faktoru erytroidnímu 2-příbuznému faktoru 2 (Nrf2), hemoxygenáze{{ 4}}(HO-1;1:2000, Abcam, ab189491),p53(1:1000,technologie buněčné signalizace,2524S), BCL-2 (1:1000, technologie buněčné signalizace,2870P) ,bax (1:1000, Abcam, ab32503), štěpená kaspáza-3(1:1000, technologie buněčné signalizace, 9664 T), kolagen I (1:1000, Affinity, AF7001), glyceraldehyd-3- fosfátdehydrogenáza (GAPDH, Service, GB12002), s následnou vizualizací pomocí sekundárních protilátek značených HRP (Service, G1213 a G1214) a chemiluminiscenčních detekčních činidel. Obrazy blotu byly nakonec analyzovány a kvantifikovány softwarem Image J.

Kultivace a likvidace kardiomyocytů H9c2 in vitro Kardiomyocyty H9c2 získané z krysího srdce, které byly zakoupeny od American Type Culture Collection (CRL-1446), byly kultivovány, aby se dále ověřily účinky, které Pino uplatňuje in vitro. Kardiomyocyty H9c2 byly kultivovány v e Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM)/F12 médiu, které obsahovalo 10 procent fetálního bovinního séra (Sijiqing, Hangzhou, Čína) při teplotě 37 stupňů a atmosféře 95 procent vzduchu a 5 procent CO. Buňky byly naočkovány do 6-jamkových destiček po růstu na 90 procent, kromě toho bylo sérové ​​médium obsahující 25 uM isoprenalin (ISO) následně nahrazeno normálním médiem ve 3 jamkách, aby se buňky inkubovaly po dobu 48 hodin, aby se napodobil stav HF od roku HF je také charakterizována nadměrnou aktivací sympatického tonu a stimulací -adrenergního receptoru generujícího ROS (Velusamy et al. 2020). Poté byly buňky rozděleny do 6 skupin: (i) kontrolní skupina; (ii) kontrolní médium s přidáním 25 uM Pino po dobu 4 hodin (kontrolní plus Pino skupina); (i) kontrolní médium společně inkubované s 25 uM Pino a 5 uM ML385 po dobu 4 hodin (inhibitor Nrf2; MCE, New Jersey, USA) (kontrola plus skupina Pino plus ML385); (iv) skupina ISO; v. ISO médium s 4-h inkubací 25 μM Pino （ISO plus Pino skupina）; vi. ISO plus 25 μM Pino plus 5 μM ML385 skupina. Koncentrace a inkubační doba léků odkazovala na předchozí studie nebo pokyny (Jin et al. 2015; Oliveira et al. 2017).

Kultivace a proliferace srdečních myofibroblastů novorozených potkanů

Srdeční myofibroblasty (CMF) novorozených potkanů ​​byly kultivovány, aby se prozkoumaly účinky Pino na sekreci kolagenu. CMF byly odděleny pomocí neonatálních krys ve věku 3 dnů, s odkazem na dříve demonstrované metody (Cui et al. 2021). Izolovaná a rozemletá srdce byla natrávena 0,125% trypsinem a následně koktejlem obsahujícím 0,25% trypsinu a 0,08% kolagenázy několikrát, s následnou centrifugací a transplantací do Petriho misky, aby se shromáždily buňky ze supernatantu. Poté bylo médium nahrazeno sérovým médiem podobným tomu, které se používá pro kultivaci kardiomyocytů H9c2 po adhezi 90 minut. CMF obdržely stejné dispozice jako ty na H9c2 kardiomyocytech. Implementovali jsme také test na počítání buněk-8(CCK{14}}) (Dojindo, Japonsko) k detekci proliferace CMF při dosažení hustoty 1,5 × 10 stupňů v každé jamce pomocí čtečky mikrodestiček při vlnová délka 450 nm, kde vyšší hodnota indikovala zvýšenou proliferační aktivitu.

Detekce ROS

Schopnost Pino vychytávat ROS byla měřena fluorescenční sondou dihydroethidium (DHE; Beyotime, Shanghai, Čína). DHL, který byl rozpuštěn v DMSO, byl zředěn na 5 μM pro zmrazené řezy nebo přidán do sérového média, které mělo být zředěno na stejnou koncentraci v souladu s pokyny. Srdce fixovaná paraformaldehydem byla zmražena a následně rozřezána na řezy až do 4-μm. Řezy nebo H9c2 kardiomyocyty byly společně inkubovány s roztokem DHE po dobu 30 minut při teplotě 37 stupňů, následně zobrazeny inverzním fluorescenčním mikroskopem (IX70; Olympus, Tokio, Japonsko). Stručně řečeno, jádro, které bylo naplněno DNA a RNA, bylo obarveno výrazně červeně kvůli afinitě mezi nukleovou kyselinou a DHE. Navíc silnější intenzita fluorescence indikovala větší akumulaci ROS.

Biochemická vyšetření

Byla provedena biochemická vyšetření za účelem sondování změn sérového BNP, SOD a malondialdehydu (MDA) v séru a buněčném supernatantu, které indikovaly fenotyp HF a obranyschopnost vůči oxidantům. Koncentrace byla měřena pomocí odpovídajících biochemických testovacích souprav podle pokynů výrobce (Jiancheng, Nanjing, Čína).

Tento článek je převzat z Chen et al. Mol Med (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7