Jak se používá inhibitor fosfoinozitid 3-kinázy Alpelisib u Loweova syndromu/Dentovy choroby?

Fosfoinositid 3-inhibitor kinázy alpelisib obnovuje organizaci aktinu a zlepšuje dysfunkci proximálních tubulů in vitro a na myším modelu Loweova syndromu a Dentovy choroby

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Marine Berquez^1,5, Jonathan R. Gadsby^2,5, Beatrice Paola Festa^1,5, Richard Butler³ , Stephen P. Jackson², Valeria Berno⁴, Alessandro Luciani1, Olivier Devuyst^1,6a Jennifer L. Gallop^2,6

KLÍČOVÁ SLOVA: cytoskelet; endocytóza; lipidy; proximální tubul; renální Fanconiho syndrom

Mutace se ztrátou funkce v genu OCRL, který kóduje fosfatidylinositol [PI] 4,5-bisfosfát [PI(4,5)P2] 5-fosfatázu OCRL, způsobují defektní endocytózu a dysfunkci proximálního tubulu vLoweův syndrom a Dentova nemoc2. Defekt je způsoben zvýšenými hladinami PI(4,5)P2 a aberantní polymerací aktinu, která blokuje endozomální přenos. PI 3-fosfát [PI(3)P] byl nedávno identifikován jako koaktivátor s PI(4,5)P2 v aktinové dráze. Zde jsme testovali hypotézu, žefosfoinositid 3-kinázaInhibitory (PI3K) mohou zachránit endocytární defekt způsobený ztrátou OCRL tím, že znovu vyváží fosfoinositidové signály do aktinového aparátu. Širokopásmový PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitor copanlisib a třída IA ​​p110a PI3K(fosfoinositid 3-kináza) inhibitor alpelisibsnížená aberantní polymerace aktinu v OCRL-deficientních lidských ledvinových buňkách in vitro. Hladiny PI 3,4, 5-trisfosfátu, PI(4,5) P2 a PI(3)P byly všechny sníženy léčbou alpelisibem a siRNA knockdown PI3K katalytické podjednotky p110a fenotypoval aktinový fenotyp. V humanizovaném myším modelu OcrlY/- alpelisib redukoval barvení endozomálního aktinu a zároveň obnovoval architekturu stresových vláken a hladiny megalinu na plazmatické membráně buněk proximálního tubulu, což se projevilo zlepšeným endocytickým vychytáváním nízkomolekulárních proteinů in vivo. Naše zjištění tedy podporují souvislost mezi fosfoinositidovými lipidy, polymerací aktinu a přenosem endocytů v proximálním tubulu a představují důkaz konceptu pro opětovné použití alpelisibu vLoweův syndrom/Dentova nemoc2.

Překladové prohlášení

Loweův syndrom a Dentova nemoc2, způsobené mutacemi ve fosfoinositid lipidové 5-fosfatáze OCRL, projevující se dysfunkcí proximálního tubulu a nízkomolekulární proteinurií s dostupnou pouze podpůrnou péčí. Naše zjištění ukazují, žefosfoinositid 3-kináza inhibitor alpelisib, který je v současné době schválen pro léčbu rakoviny, zmírňuje aberantní fosfoinositidovou rovnováhu a fenotyp aktinu související se ztrátou OCRL, což způsobuje podstatné zlepšení endocytárního aparátu a absorpční kapacity v buněčných systémech a humanizovaný myší model pro Loweův syndrom/Dentovu chorobu 2. Vzhledem ke svému zjevnému bezpečnostnímu profilu je alpelisib slibným kandidátem na přepracování léčivaLoweův syndrom a Dentova nemoc.

Epiteliální buňky vystýlající proximální tubuly (PT) ledviny mají účinnou endolysozomální dráhu zprostředkovanou receptory, která obnovuje a zpracovává základní látky, které jsou filtrovány přes glomerulus. Vrozené poruchy postihující endolysozomy způsobují dysfunkci PT (renální Fanconiho syndrom) se ztrátou solutů a nízkomolekulárních (LMW) proteinů močí, často komplikovanou metabolickými a růstovými komplikacemi a rozvojem chronického onemocnění ledvin.¹Inaktivující mutace v OCRL byla spojena s Dentovým onemocněním 2 (MIM #300555), poruchou charakterizovanou dysfunkcí PT, ledvinovými kameny a progresivním selháním ledvin a s okulocerebrorenálním syndromem Lowe (MIM #309000), který se navíc projevuje k dysfunkci PT a selhání ledvin, systémovým projevům, jako je vrozená katarakta, kognitivní porucha a hypotonie.^2-4Současná léčba Dentova onemocnění 2 a Loweova syndromu je pouze podpůrná.

Obrázek 1|PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitory uvolňují aberantní sestavení aktinu na endozomech v OCRL-deficientní lidské ledvině (HK2) buněčném modelu. (a) Kroky konverze fosfoinositidových lipidů relevantní pro tuto studii udávající konverze mezi PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2 a PI(3)P s nejrelevantnějšími enzymy tučně, nejrelevantnější převody plnými čarami a jiné přerušovanými čarami. PI(4,5)P2 je zvýšený u Loweova syndromu kvůli nedostatku 5-fosfatázové aktivity z OCRL a je tvořen fosforylací PI fosfatidylinositol 4-kinázami (PI4K) a PI(4) P 5-kináza (PIP5K). PI(4,5)P2 je fosforylován PI3K třídy I za vzniku PI(3,4,5)P3. PI(3,4,5)P3 může být defosforylován na PI(4,5)P2 pomocí PTEN nebo na PI(3,4)P2 pomocí SH-2 – polyfosfátů inositol 50 (SHIP) 1 a 2, synaptojanin 1 a 2, a také OCRL, ačkoli to je (pokračování)

Obrázek 1|(pokračování) považováno za vedlejší. PI(3,4)P2 je defosforylován na PI(3)P inositolpolyfosfát-4-fosfatázou typu IA (INPP4A) a B. PI(3)P se také vytváří v endozomech fosforylací PI třídou III PI3K(fosfoinositid 3-kináza), vakuolární třídící protein Vps34. (b) Western bloty ilustrující ztrátu exprese OCRL v buněčné linii HK2 OCRL CRISPR knockout (KO) ve srovnání s kontrolními buňkami HK2 divokého typu (WT) s tubulinem jako kontrolou nanášení. (c–e) Reprezentativní konfokální mikrofotografie Airyscan a kvantifikace překrytí časného endozomového antigenu 1 (EEA1) / aktinu (vyjádřeno jako procento z celkového počtu detekovaných vezikul EEA1þ) pro buňky HK2 WT nebo OCRL KO ošetřené buď dimethylsulfoxidem (DMSO) (d) nebo uvedeným inhibitorem a fixován pomocí fixačního prostředku 4% formaldehydu. Ve všech případech obrázky ilustrují jeden z-výřez z konfokální sady buněk zpracované Airyscanem imunoznačených pro EEA1 (žlutá), faloidin (aktin, purpurová) a 40,6-diamidino{ {14}}fenylindol (DAPI) (azurová). Tyče=5 mm. V kvantifikacích čáry označují průměr ± SEM a každý datový bod je jednotlivá buňka. Ve všech experimentech bylo ošetření aplikováno 16 hodin před fixací. Ve všech kvantifikacích byla statistická významnost hodnocena Kruskal-Wallisovou (KW) analýzou rozptylu s Dunnovým testem vícenásobného srovnání. (c) Buňky WT nebo KO ošetřené buď DMSO nebo 100 nM copanlisibu, což prokazuje záchranu aktin-endozomálního překryvu. KW test: ***P < 0.0{{50}}1,="" vícenásobné="" srovnání;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" copanlisib="" oba="" ***p="">< 0,001,="" wt="" copanlisib="" versus="" ko="" copanlisib="" p="0,44" (nevýznamné="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67="" a="" 63="" buněk="" pro="" wt="" dmso,="" wt="" copanlisib,="" ko="" dmso="" a="" ko="" copanlisib,="" v="" daném="" pořadí.="" (d)="" wt="" nebo="" ko="" buňky="" ošetřené="" buď="" dmso="" nebo="" 10="" mm="" alpelisibu,="" což="" prokazuje="" záchranu="" aktin-endozomálního="" překrytí.="" kw="" test:="" ***p="">< 0,001,="" vícenásobné="" srovnání;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" obě="" ***p="">< 0,001,="" wt="" alpelisib="" versus="" ko="" alpelisib.="" p=""> 0,99 (ns). N=31, 30, 43 a 41 buněk pro WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO a KO alpelisib, v daném pořadí. (e) Buňky WT nebo KO ošetřené buď DMSO, 10 mM GSK2636771 nebo 10 mM idelalisibu, což prokazuje, že žádná sloučenina není schopna významně snížit aktin-endosomální překryv. KW test: ***P < 0,001,="" vícenásobné="" srovnání;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" gsk,="" *p="0,04," ko="" dmso="" versus="" ko="" idelalisib,="" p=""> 0,99 (ns). N=159, 130, 203, 122, 131 a 145 buněk pro WT DMSO, WT GSK2636771, WT idelalisib, KO DMSO, KO GSK2636771, respektive KO idelalisib. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na www.kidney-international.org

Jak se inhibitor fosfoinositid 3-kinázy alpelisib používá u Loweova syndromu/Dentovy choroby?

LMW proteinurie je konzistentním rysem pozorovaným u Loweova syndromu/Dentovy choroby 2, což ukazuje, že OCRL ovlivňuje receptorem zprostředkovanou endocytózu.⁵OCRL kóduje fosfatidylinositol (PI) 4,5-bisfosfát [PI(4,5)P2] 5- fosfatázu OCRL,⁶který řídí identitu lipidů v endolysozomální dráze degradací PI(4,5)P2 (obrázek 1a). Nedostatečná degradace PI(4,5)P2 prostřednictvím OCRL se podílí na neschopnosti odkrýt vezikuly potažené klatrinem ve fibroblastech, doprovázené tvorbou „kometových“ struktur polymerizovaného vláknitého aktinu z výsledných aberantních organel podobných časným endozomům.^7-9U jiných typů buněk, zejména PT buněk ledvin, vede nedostatek OCRL ke strukturám "košíku" F-aktinu obklopujících aberantní endolysozomální organely.¹⁰Nadbytek F-aktinu blokuje membránový transport endocytární a endolysozomální cestou a předpokládá se, že snižuje recyklaci multiligandového receptorového megalinu do apikální membrány, čímž se zhoršuje defekt v endolysozomální dráze.¹¹V souladu s hlavní úlohou aberantního F-aktinu je defektní vychytávání endocytů způsobené mutacemi OCRL zmírněno zacílením na aktinový aparát latrunkulinem B nebo deplecí aktinových regulačních proteinů a také deplecí zprostředkovanou malou interferující RNA (siRNA). PI(4)P 5-kinázy pro úpravu syntézy PI(4,5)P2^7,10(Obrázek 1a).

Polymerizace aktinu je stále více chápána jako vznikající nejen z PI(4,5)P2, ale také z jiných fosfoinositidových lipidů. Například PI(3,4,5)P3 aktivuje GTPázu typu Rho Rac a PI(3)P působí ve spojení s PI(4,5)P2 ke stimulaci polymerace aktinu po směru jiné GTPázy Rho typu, Cdc42.^12-14Vzájemná konverze těchto fosfoinozitidů je spojena s pohybem lipidů endocytární a endozomální cestou. PI(4,5)P2 je fosforylován fosfatidylinositol- 30 -kinázou třídy I (PI3K) na PI(3,4,5)P3 na plazmatické membráně a postupně se defosforyluje na PI(3,4)P2 a PI (3)P nebo PI(4,5)P2.^14,15PI(3)P je obohacen na endozomech, kde je nezbytný pro jejich funkci, a je tvořen převážně přímou fosforylací PI třídou III PI3K(fosfoinositid 3-kináza), Vps34¹⁶(Obrázek 1a). V buněčné linii retinálního pigmentového epitelu (RPE) s deficitem OCRL jsou generované aktinové komety redukovány ošetřením PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitory wortmannin a Vps34-IN1, v souladu s biochemickými studiemi prokazujícími koregulaci aktinu prostřednictvím koincidence obou PI(3)P a PI(4,5)P2.¹⁴

Záchrana endocytózy pozorovaná při zacílení na aktinový aparát u pacientů s OCRL a knockout (KO) buněk,^7,10spolu s upstream regulací aktinu pomocí PI3K(fosfoinositid 3-kináza)aktivita¹⁴a vysoce propojená povaha konverze PI poskytuje zajímavou možnost, že třída I PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitory mohou být užitečné u Loweova syndromu. Takové inhibitory, vyvinuté pro terapii rakoviny, jsou schváleny pro klinické použití¹⁷a jsou tak potenciálně přístupné pro přeměnu léčiva. Ačkoli sloučeniny jako copanlisib¹⁸mají širokou specificitu a vedlejší účinky, nedávný úspěch byl prokázán u specifičtějších inhibitorů. idelalisib,¹⁹která cílí na PI3K(fosfoinositid 3-kináza)podjednotka p110d je schválena pro chronický lymfocytární lymfom a alpelisib, který se zaměřuje na p110a, je schválen pro použití u rakoviny prsu.^20,21Navíc alpelisib prokázal klinický přínos u dětí se syndromem PROS/CLOVES,²²vzácný syndrom přerůstání vyplývající z aktivace PIK3A.

Zde jsme testovali hypotézu, že třída I PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitory mohou zachránit endocytární defekt v důsledku ztráty OCRL za použití zavedených buněčných a myších modelů.^10,11,23Ukazujeme, že inhibice PI3K(fosfoinositid 3-kináza)aktivita prostřednictvím copanlisibu nebo alpelisibu nebo deplece cílové katalytické podjednotky p110a zprostředkovaná siRNA snižuje nadměrnou polymeraci aktinu v buňkách lidských ledvin (HK2) s deficitem OCRL. Zaměřujeme-li se na alpelisib jako nejspecifičtější sloučeninu pro klinické použití, ukazujeme, že snižuje polymeraci aktinu a zlepšuje vychytávání endolysozomální cestou v PT buňkách z humanizovaného Ocrl^Y/-myši in vitro. Kromě toho léčba alpelisibem in vivo zmírňuje proteinurii, snižuje dysfunkci PT a zachraňuje buněčné hladiny megalinu v humanizovaném Ocrl^Y/-myši. Tyto výsledky podporují alpelisib jako kandidáta na přepracování léčivaLoweův syndrom a Dentova nemoc 2.

Obrázek 2|Účinky Alpelisibu na aktin jsou závislé na dávce a jsou rekapitulovány siRNA z PI3K (fosfoinositid 3-kináza)p110a. (a) Reprezentativní konfokální mikrofotografie Airyscan (fixované pomocí 4% formaldehydové fixy a imunoznačené pro časný endozomový antigen 1 [EEA1], žlutá; aktin [faloidin], purpurová; a 4{{40}}, {{ 5}}diamidino-2-fenylindol [DAPI], azurová; sloupce=5 mm) a kvantifikace divokých (WT) nebo knockout (KO) buněk lidských ledvin (HK2) ošetřených dimethylsulfoxidem (DMSO) nebo indikované dávky alpelisibu po dobu 16 hodin, což prokazuje záchranu aktin-endozomálního překryvu v závislosti na dávce. Ve všech případech čáry označují průměr ± SEM a body označují jednotlivé buňky. N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 a 67 buněk pro kontrolu WT, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO a KO 2,5, 5, 10, 15, 25 a 50 mM alpelisibu, v daném pořadí. Statistická významnost hodnocená Kruskal-Wallisovým (KW) testem s Dunnovým testem vícenásobného srovnání: celkově ***P < 0,001,="" vícenásobná="" srovnání;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 5,="" 15,="" 25="" a="" 50="" mm="" alpelisib="" všechny="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" mm="" alpelisib="" *p="0,0131," ko="" 10dmso="" versus="" mm="" alpelisib="" **p="0,0043," wt="" dmso="" oproti="" wt="" 10="" a="" 50="" mm="" alpelisibu="" p=""> 0,9999 (nevýznamné [ns]). (b) Western blot pro p110a a nanášení kontrolního a-tubulinu WT nebo KO buněk ošetřených buď scramble (Scram.) nebo p110a siRNA. (c) Reprezentativní konfokální mikrofotografie Airyscan (fixované pomocí fixace 4% formaldehydem a imunoznačené pro EEA1, žlutá; aktin [faloidin], purpurová; a DAPI, azurová; sloupce=5 mm) a kvantifikace ošetřených buněk WT nebo KO buď se scramble (S) nebo p110a siRNA, což demonstruje snížení EEA{60}}aktinu překryvu při depleci p110a. KW test s Dunnovým testem vícenásobného porovnání: ***P < 0,001,="" vícenásobná="" srovnání;="" wt="" scramble="" versus="" ko="" scramble,="" ko="" scramble="" versus="" ko="" p110a="" sirna="" obě="" ***p="">< 0,001.="" n="79," 108,="" 93,="" respektive="" 131="" buněk.="" hk2,="" lidská="" ledvina;="" pi3k,="" fosfatidylinositol-30="" -kináza;="" sirna,="" malá,="" interferující="" rna.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">

Obrázek 3|Hladiny fosfatidylinositolu (PI) 4,5-bisfosfátu [PI(4,5)P2] se zvyšují s knockoutem OCRL (KO) a PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 a PI(3)P jsou potlačeny léčbou alpelisibem. Ve všech experimentech byla uvedená ošetření aplikována 16 hodin před fixací. V kvantifikacích čáry označují průměr ± SEM a každý datový bod je výsledkem individuální buňky. Ve všech kvantifikacích byla statistická významnost hodnocena Kruskal-Wallisovou (KW) analýzou rozptylu s Dunnovým testem vícenásobného srovnání. Pruhy=20mm na všech obrázcích. a) Reprezentativní širokoúhlé mikrofotografie divokého typu (WT) nebo KO buněk lidských ledvin (HK2) ošetřených dimethylsulfoxidem (DMSO) nebo 10 mM alpelisibu a poté fixovány fixací plazmatické membrány a imunoznačeny na PI(3,4,5 )P3 (červená) a 40,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (azurová), s kvantifikací průměrné intenzity buněčného značení PI(3,4,5)P3, ukazující účinnost alpelisibu ošetření syntézou PI(3,4,5)P3. N=96, 128 a 109 buněk pro WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO a KO alpelisib, v daném pořadí. KW (pokračování)

Obrázek 3|(pokračování) test: celkově ***P < 0.001,="" vícenásobné="" srovnání;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib="" a="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" všechny="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (b)="" reprezentativní="" konfokální="" mikrofotografie="" buněk="" wt="" nebo="" ko="" hk2="" ošetřených="" buď="" dmso,="" 10="" mm-="" nebo="" 50-mm="" alpelisibu="" po="" dobu="" 16="" hodin="" a="" poté="" fixovány="" golgiho="" fixem="" a="" označeny="" pomocí="" m="" ch="" {{10}}xfyve="" pi(3)p="" sonda="" (purpurová)="" a="" dapi="" (azurová),="" s="" kvantifikací="" počtu="" pi(3)p-pozitivních="" punkt="" detekovaných="" v="" buňkách="" ošetřených="" řadou="" koncentrací="" alpelisibu="" ,="" jak="" je="" uvedeno,="" ukazující,="" že="" pi(3)p-pozitivní="" bodky="" jsou="" redukovány="" způsobem="" závislým="" na="" dávce.="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" a="" 215="" buněk="" pro="" kontrolu="" wt,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" a="" ko="" 2,5,="" 5,="" 10,="" 25="" a="" 50="" mm="" alpelisibu,="" v="" daném="" pořadí.="" kw="" test:="" celkově="" ***p="">< 0,001,="" vícenásobné="" srovnání;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" versus="" wt="" 10="" a="" 50="" mm="" alpelisib,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 50="" mm="" alpelisib="" všechny="" ***p="">< 0,001;="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" a="" 5="" mm="" alpelisib="" obě="" p=""> 0,9999 (nevýznamné [ns]); KO DMSO versus KO 10 mM alpelisib **P=0,0049; KO DMSO versus KO 25 mM alpelisib ***P=0.0002. (c) Reprezentativní širokoúhlé mikrofotografie buněk WT nebo KO HK2 ošetřených DMSO nebo 10 mM alpelisibu a poté fixovány fixací plazmatické membrány a imunoznačeny pro PI(4,5)P2 (žlutá) a DAPI (azurová), s kvantifikací průměrná intenzita značení buněčného PI(4,5)P2, vykazující zvýšenou plazmatickou membránu PI(4,5)P2 v KO buňkách, která je snížena léčbou alpelisibem, konkrétně v KO buňkách. N=126, 112, 85 a 116 buněk pro WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO a KO alpelisib, v daném pořadí. KW test: celkově ***P < 0,001,="" vícenásobné="" srovnání;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso="" a="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" oba="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib="" p="0.4752" (ns).="" (d)="" reprezentativní="" širokoúhlé="" mikrofotografie="" buněk="" wt="" nebo="" ko="" hk2="" ošetřených="" dmso="" nebo="" 10="" mm="" alpelisibu="" a="" poté="" fixovány="" 4%="" formaldehydovou="" fixací="" a="" imunoznačeny="" pro="" pi(4,5)p2="" (žlutá)="" a="" dapi="" (azurová),="" s="" kvantifikací="" počtu="" pi(4,5)p2-pozitivních="" punkt,="" vykazujících="" zvýšený="" pi(4,5)p2="" punkta="" v="" ko="" buňkách,="" který="" je="" redukován="" léčbou="" alpelisibem,="" konkrétně="" v="" ko="" buňkách.="" n="75," 65,="" 52="" a="" 69="" buněk="" pro="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisib,="" ko="" dmso="" a="" ko="" alpelisib,="" v="" daném="" pořadí.="" kw="" test:="" celkově="" ***p="">< 0,001,="" vícenásobné="" srovnání;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso="" a="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" oba="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib="" p=""> 0,99 (ns). au, libovolné jednotky. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na www.kidney-international.org.

Jak se inhibitor fosfoinositid 3-kinázy alpelisib používá u Loweova syndromu/Dentovy choroby?

1. VÝSLEDKY

1.1 Inhibitory PI3K třídy I snižují agregaci aktinu v buňkách OCRL-KO HK2

Použili jsme úpravu genu CRISPR-Cas9 k knockoutu (KO) OCRL v buněčné linii HK2, abychom umožnili testování třídy I PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitory charakteristické agregace aktinu v endolysozomálních kompartmentech.^7,9,10,14Western blot ověřil 98,7% snížení exprese OCRL v lyzátech z buněk KO HK2 (obrázek 1b). OCRL KO rekapituloval fenotyp aktinového koše v buňkách HK2, jak je indikováno zvýšeným překrýváním mezi F-aktinem a raným endozomovým antigenem 1 (EEA1), kvantifikovaným na z-stacích konfokální mikroskopie Airyscan (obrázek 1c–e). Toto zvýšené překrytí pozorované u buněk OCRL KO bylo zvráceno léčbou copanlisibem (C), širokospektrálním PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitor, který se zaměřuje na p110a a d a v menší míře na izoformy p110b a g (obrázek 1c). Western blotováním celobuněčných extraktů HK2 jsme zjistili, že PI3K(fosfoinositid 3-kináza)Regulační podjednotky p110 a, b a d byly všechny dobře exprimovány v buňkách divokého typu (WT) i KO, přičemž byly přítomny pouze stopové hladiny izoformy p110g (doplňkový obrázek S1A).

Rozlišovali jsme PI3K(fosfoinositid 3-kináza)specificita inhibice F-aktinu pomocí alpelisibu (A), selektivního inhibitoru p110a, a GSK2636771 (G) a idelalisibu (I), selektivních inhibitorů p110b a p110d, v daném pořadí (doplňkový obrázek S1A). Ačkoli léčba alpelisibem poskytla podobné snížení polymerace endozomálního aktinu ve srovnání s copanlisibem (obrázek 1d), GSK2636771 a idelalisib měly malý účinek na akumulaci aktinu (obrázek 1e). Třída I PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitory neměly žádnou zvýšenou toxicitu na OCRL KO ve srovnání s nemodifikovanými buňkami na základě testu MTT (doplňkový obrázek S1B).

1.2 Alpelisib a knockdown p110a zachraňují aktinový fenotyp v buňkách HK2

Pro naše následné studie jsme se zaměřili na alpelisib, protože je to nejselektivnější a nejméně toxický PI3K(fosfoinositid 3-kináza)dosud vyvinutý inhibitor, který se v současnosti používá k léčbě mozaikové nadměrné aktivace PI3K třídy Ia u dětí se syndromem PROS/CLOVES.²²Alpelisib redukoval aktinové koše v buňkách OCRL KO HK2 způsobem závislým na dávce (obrázek 2a). Účinky byly pozorovány při dávce 10 mM již 4 hodiny po ošetření, bez zjevné toxicity (doplňkový obrázek S2). Chcete-li otestovat, zda PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibice alpelisibem byla zdrojem sníženého barvení aktinu, specificky jsme redukovali jeho cíl, podjednotku p110a, pomocí siRNA (obrázek 2b). Ve srovnání s ošetřením kontrolní (sekvenčně zakódovanou) siRNA poskytla siRNA proti p110a 78,3±4,8 procenta a 68,9±7,7 procenta deplece proteinu p110a v buňkách WT a OCRL KO HK2, což se odráží ve významném snížení aktinových košů ( Obrázek 2c).

1.3 Snížené hladiny PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 a PI(3)P v buňkách HK2 ošetřených alpelisib

Abychom prozkoumali, jak jsou fosfoinositidové lipidy ovlivněny léčbou OCRL KO a alpelisibem, obarvili jsme buňky HK2 protilátkami nebo proteinovými doménami proti PI(3,4,5)P3, PI(3)P a PI(4,5)P2 pomocí optimalizované fixační podmínky pro plazmatickou membránu nebo intracelulární barvení.^24,25PI(3,4,5)P3 má difúzní lokalizaci na plazmatické membráně a léčba alpelisibem (10 mM) vyvolala výrazné snížení barvení na PI(3,4,5)P3 v buňkách WT i OCRL KO, jak očekává se od jeho mechanismu účinku a specificity pro třídu IA PI3K(fosfoinositid 3-kináza)p110a (obrázek 3a). Očekává se, že PI(3,4,5)P3 bude defosforylován progresivně, jak jsou membrány endocytovány a transportovány do endozomů.^14,26,27Fixací buněk tak, aby byl zachován intracelulární PI(3)P,²⁵zjistili jsme, že PI(3)P punctae byly také redukovány léčbou alpelisibem (způsobem závislým na dávce patrným z koncentrací tak nízkých, jako je 10 mm po 16-hodinové ošetření) u buněk WT i OCRL KO (obrázek 3b a doplňkový obrázek S2C). Jak se očekávalo, KO OCRL v buňkách HK2 vyvolalo výrazné zvýšení hladin PI(4,5)P2 jak na plazmatické membráně (obrázek 3c), tak intracelulárně (obrázek 3d), ve srovnání s buňkami WT.^10,28Léčba alpelisibem výrazně snížila zvýšení PI(4,5)P2 generovaného OCRL KO v obou kompartmentech, zatímco u WT buněk neměla žádný účinek (obrázek 3c a d). Alpelisib inhibuje PI 4-kinázu b s 50procentní inhibiční koncentrací 0,5 mM,¹⁹což je možný zdroj snížení PI(4,5)P2. Souhrnně naše data naznačovala, že alpelisib inhibuje sestavení aktinu na endozomech OCRL KO prostřednictvím bispecifického účinku na hladiny PI(4,5)P2 a PI(3)P.

Obrázek 4|Alpelisib zmírňuje defekty aktinu Oral u kultivovaných humanizovaných Ocrl^Y/-myší PTC (m PTC). (a) Reprezentativní snímky z konfokálního mikrosnímku s maximální intenzitou Z-projekce OcrlY/þ nebo Ocrl^Y/-m PTC ošetřené dimethylsulfoxidem (DMSO) nebo 10 mM alpelisibu po dobu 16 hodin a poté fixovány 4% formaldehydovou fixací a imunoznačeny na aktin (faloidin) (bílý) a 40,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (modrá), s kvantifikací stupně, ve kterém jsou stresová vlákna přítomna v každém stavu, což ukazuje, že stresová vlákna se ztratila v Ocrl^Y/-m PTC jsou zachráněny léčbou alpelisibem. Čáry označují průměr ± SEM a datové body označují každou zobrazovací oblast: N=5 zobrazovacích oblastí na stav (každá obsahuje přibližně 15–20 buněk). Významnost byla hodnocena běžnou 1-analýzou rozptylu (ANOVA) s Holm-Sidakovým testem vícenásobného srovnání, **P=0.001, vícenásobná srovnání; Ocrl Y/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO **

P=0.002, Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/- alpelisib P=0.50 (nevýznamné [ns]). Pruhy=20mm. (b) Reprezentativní 3D povrchové vykreslování Ocrl m PTC s vysokým zvětšením ošetřené DMSO nebo 10 mM alpelisibu po dobu 16 hodin a poté fixované 4% formaldehydovou fixou a imunoznačené pro časný endozomový antigen 1 (EEA1) (fialový), aktin ( phalloidin, žlutá) a DAPI (modrá) a kvantifikace ilustrující záchranu aktin-endozomálního překrytí alpelisibem. Pohledy s menším zvětšením označující přehledy (pokračování)

Obrázek 4|(pokračování) tyto oblasti jsou zobrazeny na doplňkovém obrázku S4B a doplňkových filmech S1–S3. Čáry označují průměr ± SEM. N=42, 47 a 45 náhodně vybraných polí pro OcrlY/þ þ DMSO, Ocrl^Y/-þ DMSO a Ocrl^Y/-þ stavy alpelisibu, v tomto pořadí, v každém případě shromážděné ze 4 myších ledvin na stav. Významnost byla testována pomocí Kruskal-Wallis (KW) ANOVA s Dunnovým vícenásobným srovnávacím testem: celkově ***P < 0,001,="" vícenásobná="" srovnání;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-alpelisib P > 0,99 (ns). Pruhy=1 mm. (c) Reprezentativní konfokální mikrofotografie OcrlY/þ nebo Ocrl^Y/-m PTC ošetřené DMSO nebo 10-mM alpelisibem a poté fixované Golgiho fixem a označené pomocí m Ch-2xFYVE PI(3)P sondy (purpurová) a DAPI (azurová), s kvantifikací počet PI(3)P-pozitivních punkt detekovaných v buňkách. N=188, 177, 246 a 206 buněk z OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO a Ocrl^Y/-þ alpelisib, v tomto pořadí; buňky byly shromážděny ze 3 orálních ledvin na skupinu. KW test: celkově ***P < 0.001,="" vícenásobné="" srovnání;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib a Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib, všechny ***P < 0.001.="" pruhy="20" mm.="" (d)="" reprezentativní="" konfokální="" mikrofotografie="" ocrly/þ="" nebo="">^Y/-m PTC ošetřené DMSO nebo 10 mM alpelisibu po dobu 16 hodin, poté fixovány 4% formaldehydovou fixací a imunoznačeny na fosfatidylinositol (PI) 4, 5-bisfosfát [PI(4,5) P2] (žlutý) a DAPI (azurová), s kvantifikací počtu PI(4,5)P2-pozitivních punkt, vykazujících zvýšený PI(4,5)P2 punkta v Ocrl^Y/-buněk, který je redukován léčbou alpelisibem. N=477, 444, 423 a 494 z OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO a Ocrl^Y/-þ alpelisib, v tomto pořadí; buňky byly shromážděny ze 3 orálních ledvin na skupinu. KW test: celkově ***P < 0.001,="" vícenásobné="" srovnání;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib a Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib, všechny ***P < 0.001.="" pruhy="20" mm.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">

1.4 Alpelisib snižuje intracelulární fosfoinositidy a zmírňuje cytoskeletální defekty u Ocrl^Y/-m PTC

Dále jsme testovali, zda měl alpelisib stejné účinky v primárních buňkách jako PT buňky odvozené z humanizovaného modelu Ocrldefificient myší (Ocrl^Y/-), který rekapituluje abnormální polymeraci aktinu a endocytický defekt pozorovaný v buňkách odvozených od pacienta.^10,11Myší PTC (m PTC) exprimované podobně jako třída I PI3K(fosfoinositid 3-kináza) regulační podjednotky k buňkám HK2 ve WT i Ocrl^Y/-myši a vykazovaly podobný profil toxicity vůči alpelisibu, když byly hodnoceny testy MTT (doplňkový obrázek S3). Zobrazování konfokální mikroskopií odhalilo nápadné narušení normální architektury stresového vlákna F-aktinu v m PTC z Ocrl^Y/-ve srovnání s myší OcrlY/þ, pravděpodobně v důsledku přemístění aktinových regulačních proteinů z jejich normálních buněčných lokalizací do endozomů, protože velká shromáždění aktinu obklopují tyto organely a předpokládá se, že jsou původem defektu obchodování.^10,29Léčba Ocrl^Y/- m PTC s alpelisibem (10 mM) obnovilo architekturu stresového vlákna (obrázek 4a).

Jak se inhibitor fosfoinositid 3-kinázy alpelisib používá u Loweova syndromu/Dentovy choroby?

Jako hlavní problém vLoweův syndrom a Dentova nemoc2 je snížený endozomální transport a následná degradace megalinu, snažili jsme se odlišit endozomální aktin od stresových vláken. Shromáždili jsme laserové skenování konfokálních z-stacků v buňkách, rekonstruovali vzor barvení ve vykreslování 3D povrchu a použili tvar / parametry velikosti k identifikaci tečkovaných aktinových struktur a míry, do jaké se překrývají s endozomálními strukturami (doplňkový obrázek S4 a filmy S1 -S3). Tato analýza odhalila, že léčba alpelisibem snížila aberantní polymeraci F-aktinu v endozomech obarvených EEA1, odlišnou od architektury stresového vlákna (obrázek 4b). m PTC odvozené z Ocrl^Y/-myši vykazovaly významné změny v intracelulárním barvení pro PI(3)P (snížení) a PI(4,5)P2 (zvýšené), ve srovnání s m PTC z myší WT OcrlY/þ (obrázek 4c a d). Léčba m PTC z Ocrl^Y/- myši s alpelisibem vedly k významnému snížení intracelulárního barvení PI(3)P a PI(4,5)P2 (obrázek 4c a d).

1,5 Alpelisib zlepšuje endocytární vychytávání u Ocrl^Y/-m PTC

Dále jsme hodnotili, zda účinek alpelisibu na cytoskeletální a vezikulární defekty pozorované u m PTC vedl ke změnám v kapacitě vychytávání endocytů. Aby se odlišil účinek alpelisibu na vazbu a/nebo internalizaci ligandu, byly m PTC nejprve inkubovány se značeným bovinním sérovým albuminem (BSA), aby se indukovala vazba sondy na endocytární receptory, a poté inkubovány s růstovým médiem, aby sledujte internalizaci albuminu (obrázek 5a). The Ocrl^Y/-buňky vykazovaly nižší vazbu na plazmatickou membránu Alexa 488-bovinního sérového albuminu spolu se zhoršenou internalizací albuminu ve srovnání s buňkami OcrlY/þ. Léčba alpelisibem zachránila vazbu i vychytávání albuminu v Ocrl^Y/-buňky, s 50% celkovou záchranou endocytární absorpce (obrázek 5b a c). Tato data byla podpořena měřením celkové absorpce albuminu (doplňkové obrázky S5a a b). Zaznamenali jsme, že poměr internalizovaného/vázaného Alexa 488-bovinního sérového albuminu zůstal podobný mezi různými stavy (obrázek 5d), což naznačuje, že snížené vychytávání albuminu je způsobeno především zhoršenou vazbou spíše než přetrváváním defektního procesu internalizace.

1.6 Alpelisib zlepšuje dysfunkci PT a receptorem zprostředkovanou endocytózu u Ocrl^Y/- myši

Testovali jsme potenciální terapeutický účinek alpelisibu na dysfunkci PT in vivo. Orálním myším bylo podáváno buď vehikulum nebo alpelisib (50 mg/kg tělesné hmotnosti za den) orální sondou po dobu 6 týdnů (obrázek 6a). Tento režim byl zvolen podle předchozích studií in vivo prokazujících účinnost a bezpečnost.^22,30V souladu s tím, že podávání alpelisibu způsobuje inzulínovou rezistenci a hyperglykémii,²²Léčba alpelisibem vedla k významnému zvýšení glykosurie jak u Ocrl Y/þ, tak u perorálních^Y/-myši, které by mohly být považovány za biomarker pro dávkování léku (doplňková tabulka S1). Po 6 týdnech léčby alpelisibem se Ocrl^Y/-myši vykazovaly významné snížení vylučování LMW proteinů CC16 (-34 procent) a albuminu (-38 procent) močí ve srovnání s kontrolami ošetřenými vehikulem (obrázek 6b a c), zatímco objem moč a další parametry nebyly ovlivněny (doplňková tabulka S1). Myši obou genotypů léčené Alpelisibem vykazovaly podobné snížení rychlosti růstu ve srovnání s kontrolními myšmi, jak bylo popsáno dříve.²²Nicméně myši s vehikulem i léčené myši získaly tělesnou hmotnost, což naznačuje, že lék vážně neovlivňuje postnatální vývoj (obrázek 6d a doplňková tabulka S1).

Abychom otestovali, zda účinek alpelisibu na proteinurii LMW odráží obnovu receptorem zprostředkované endocytózy v PT buňkách, sledovali jsme in vivo absorpci b-laktoglobulinu značeného Cy5- v myších ledvinách. Alpelisib léčený Ocrl^Y/-myši vykazovaly významnou záchranu vychytávání b-laktoglobulinu značeného Cy5-, blízko rozsahu internalizace pozorované u myší OcrlY/þ léčených vehikulem (obrázek 6e). To se odrazilo ve významné záchraně exprese endocytárního receptorového megalinu v PT buňkách, jak bylo pozorováno imunoznačením a westernovým přenosem ledvinových lyzátů Ocrl léčených alpelisibem^Y/-myši; všimněte si, že nedošlo k žádné změně v expresi PT markeru AQP1 (obrázek 6f a g a doplňkový obrázek S5C a D). Tato data ukazují, že PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitor alpelisibindukuje podstatné zlepšení endocytárního aparátu PT a snižuje proteinurii LMW v humanizovaném myším modelu Loweova syndromu.

Obrázek 5|Alpelisib zlepšuje endocytární vychytávání humanizovaného Ocrl^Y/-myší PTC (m PTC). (a) Schéma ilustrující experiment pulzní chase použitý ke zkoumání vazby a internalizace Alexa 488-bovinního sérového albuminu (BSA) do m PTC. Buňky byly vystaveny Alexa 488-BSA (0,2 mg/ml) po dobu 1 hodiny při 4 stupních, aby se BSA navázalo na receptory buněčného povrchu (puls) a poté zahřáté na 37 stupňů v buněčném médiu po dobu 20 minut před fixací, aby se umožnila internalizace ligandu (chase). (b) Reprezentativní konfokální mikrofotografie OcrlY/þ nebo Ocrl^Y/-m PTC ošetřené dimethylsulfoxidem (DMSO) nebo 10 mM alpelisibu po dobu 16 hodin a podrobeny experimentu Alexa 488-BSA (zelený) pulse-chase, než byly fixovány a označeny na 40,6-diamidino{ {6}}fenylindol (DAPI) (modrý). Pulzní fáze experimentu je zobrazena na horním panelu pro každou podmínku, s chase níže. Pruhy=20 mm. (c) Kvantifikace buněčného povrchu Alexa 488-BSA (i) a internalizovaného Alexa 488-BSA (ii), hodnocené jako průměrné intenzity fluorescence FL na buňku. Alpelisib zachraňuje zachráněnou vazbu BSA a internalizaci pozorovanou u Ocrl^Y/-buňky. N=209, 228, 186 a 196 buněk pro OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/ DMSO a Ocrl^Y/-podmínky alpelisibu, respektive v (i) a N=203, 183, 199 a 233 buněk pro OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-stavy alpelisibu, respektive v (ii), v každém případě shromážděné ze 2 myších ledvin na stav; každý datový bod představuje průměrnou intenzitu fluorescence FL v jednotlivé buňce. Významnost byla testována Kruskal-Wallisovou (KW) analýzou rozptylu (ANOVA) s Dunnovým vícenásobným srovnávacím testem: pro (i) BSA buněčného povrchu, celkově ***P < 0,001,="" vícenásobná="" srovnání:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < {{0}}.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0,60" (nevýznamné="" [ns]);="" pro="" (ii)="" internalizovaný="" bsa,="" celkově="" ***p="">< 0,001,="" vícenásobná="" srovnání:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0,66" (ns).="" (d)="" kvantifikace="" poměru="" mezi="" buněčným="" povrchem="" alexa="" 488-="" bsa="" a="" internalizovanými="" intenzitami="" fluorescence="" alexa="" 488–bsa="" fl,="" nevykazující="" žádné="" významné="" rozdíly="" v="" poměrech="" mezi="" jednotlivými="" stavy.="" každý="" bod="" představuje="" průměr="" poměru="" v="" poli="" obsahujícím="" přibližně="" 15–20="" buněk="" (n="13," 13,="" 10="" a="" 11="" náhodně="" vybraných="" polí="" pro="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="">^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-stavy alpelisibu, v každém případě shromážděné ze 2 myších ledvin na stav). Významnost byla testována pomocí KW ANOVA s Dunnovými vícenásobnými srovnávacími testy: celková P=0.46 (ns), vícenásobná srovnání: OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib P > 0,99 (ns); OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib P=0,84 (ns). Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na www.kidney-international.org.

Obrázek 6|Alpelisib zlepšuje funkci proximálního tubulu (PT) myší OcrlY/L, obnovuje vychytávání ligandu a expresi megalinu. (a) Experimentální uspořádání. Orální myši byly léčeny po dobu 6 týdnů denní perorální dávkou buď karboxymethylcelulózy 1 procento (vehikulum) nebo alpelisibu (50 mg/kg tělesné hmotnosti). Poslední den léčby byl myším injikován b-laktoglobulin značený Cy5- (N=6 Ocrl^Y/-, nebo 8 Ocrl^Y/-myši na skupinu). (b–d) Uvedené hodnoty D ukazují průměrnou změnu z BL na D42 pro stav ± SEM. (b) Clara buněčný protein 16 (CC16), (c) močový výdej albuminu (obojí během 15 hodin) a (d) tělesná hmotnost byla měřena u myší OcrlY/- léčených buď vehikulem nebo alpelisibem v uvedeném časovém bodě. Každá tečka představuje 1 myš. Významnost byla hodnocena 2-tailovým párovým Studentovým t-testem; v (b) CC16 (pokračování)

Obrázek 6|(pokračování) změna výstupu vzhledem k základní linii; þ vozidlo, P=0.9802 (nevýznamné [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334; in (c) změna produkce albuminu vzhledem k výchozí hodnotě; þ vozidlo, P=0.0502 (ns), þ alpelisib, ***P ¼ 0,0006; in (d) změna tělesné hmotnosti vzhledem k výchozí hodnotě; þ vozidlo, ***P < 0,0001,="" þ="" alpelisib,="" **p="0,0083." (e)="" reprezentativní="" konfokální="" mikrofotografie="" ukazující="" cy5-značený="" b-laktoglobulin="" (purpurový)="" 15="" minut="" po="" injekci="" do="" ocasní="" žíly="" a="" označený="" pro="" 40,6-diamidino-2-fenylindol="" (dapi)="" (azurová),="" plus="" kvantifikace="" odpovídajících="" fluorescenčních="" signálů="" fl="" z="" ledvin="" myší="" ocrl="" (n="412," 500,="" respektive="" 588="" tubulů="" pro="" ocrly/þþ="" vehikulum,="">^Y/-þ vozidlo a Ocrl^Y/-+ alpelisib) pro 3 myši na léčebnou skupinu. Vychytávání b-laktoglobulinu je zachráněno léčbou alpelisibem. Tyče ¼ 20 mm. V kvantifikaci každá tečka představuje intenzitu fluorescence FL normalizovanou plochou tubulu; vynesená data ukazují průměr ± SEM. Významnost byla hodnocena Kruskal-Wallisovým (KW) testem následovaným Dunnovým vícenásobným srovnávacím testem; ***P < 0,001,="" vícenásobná="" srovnání;="" ocrly/þþ="" vozidlo="" versus="">^Y/-þ vozidlo a Ocrl^Y/-þ vozidlo versus Ocrl^Y/-þ alpelisib, oba ***P < 0.001.="" (f)="" western="" blot="" a="" denzitometrická="" analýza="" hladin="" megalinu="" v="" celých="" ledvinových="" lyzátech="" z="" orálních="" myší.="" a-tubulin="" byl="" použit="" jako="" kontrola="" plnění.="" snížená="" exprese="" megalinu="" v="">^Y/-je zachráněn alpelisibem. Při kvantifikaci denzitometrické analýzy každá tečka představuje 1 myš (N=4 OcrlY/þþ vehikulum a Ocrl^Y/-þ vozidlo a N=3 Ocrl^Y/-þ myši alpelisib); čáry označují průměr ± SEM. Významnost byla hodnocena 2-ocasovými nepárovými Studentovými t-testy: OcrlY/þþ vehikulum versus Ocrl^Y/-þ vozidlo; **P ¼ 0.0057, Ocrl^Y/-þ vozidlo versus Ocrl^Y/- þ alpelisib, *P=0.0246. (g) Reprezentativní konfokální mikrofotografie s vysoce zvětšenými vložkami a kvantifikací intenzity megalinu (žlutá) v AQP1þ PT (purpurová) z orálních ledvin byly také označeny pro DAPI (azurová), což ilustruje záchranu hladin megalinu po léčbě alpelisibem. Pruhy=20 mm. V kvantifikaci každá tečka představuje intenzitu fluorescence FL normalizovanou plochou tubulu; vynesená data ukazují průměr ± SEM; N=142, 191 a 266 tubulů pro vozidlo OcrlY/þþ, Ocrl^Y/-þ vozidlo a Ocrl^Y/-þ alpelisib pro 3 myši na léčebnou skupinu. Významnost byla hodnocena KW analýzou rozptylu následovanou Dunnovým vícenásobným srovnávacím testem; celkově ***P < 0.001,="" vícenásobná="" srovnání;="" ocrly/þþ="" vozidlo="" versus="">^Y/-þ vozidlo a Ocrl^Y/-þ vozidlo versus Ocrl^Y/-þ alpelisib, oba ***P < 0.001.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">

Jak se inhibitor fosfoinositid 3-kinázy alpelisib používá u Loweova syndromu/Dentovy choroby?

2. DISKUZE

V současné době neexistuje žádná léčba, která by zmírnila defektní endocytózu způsobující dysfunkci PTLoweův syndrom a Dentova nemoc2. Naše zjištění ukazují, že alpelisib zmírňuje aberantní aktinový fenotyp snížením hladin PI(4,5)P2 a PI(3)P, což způsobuje podstatné zlepšení endocytárního aparátu a absorpční kapacity v buněčných systémech a humanizovaný myší model pro Loweův syndrom/Dentova nemoc 2. Tyto výsledky podporují vazbu mezi fosfoinositidovými lipidy, polymerizací aktinu a transportem endocytů, s bezprostředním významem pro vysoce aktivní epiteliální buňky zapojené do klíčových homeostatických procesů (obrázek 7). Vzhledem k nedostatku účinných terapií a zjevné bezpečnosti této třídy PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitory, alpelisib je slibným kandidátem na přeměnu léčivaLoweův syndrom a Dentova nemoc.

LMW proteinurie je nejkonzistentnějším znakem, se kterým se setkáváme u pacientů sLoweův syndrom a Dentova nemoc2 v důsledku inaktivačních mutací v OCRL.⁴Tyto LMW proteiny lze snadno detekovat a kvantifikovat, což nabízí věrný biomarker endocytózy zprostředkované defektními receptory v PT buňkách.1 LMW proteinurie je zvláště důležitá, protože je detekována konzistentněji a často dříve než jiné rozpuštěné látky (např. glukóza, fosfát, aminokyselin), které jsou součástí klasického „renálního Fanconiho syndromu“ – alespoň u vrozených poruch endolysozomální dráhy.¹Zde ukazujeme, že alpelisib zachraňuje apikální endocytickou absorpční kapacitu PT buněk in vitro a in vivo díky obnoveným hladinám megalinového receptoru na plazmatické membráně. Tento účinek se odráží ve významném snížení ztráty LMW proteinů (CC16 a albuminu) močí u Ocrl^Y/-myši léčené alpelisibem po dobu 6 týdnů. Tyto účinky alpelisibu byly pozorovány u m PTC, které si zachovávají svou apikální diferenciaci a jsou zvláště vhodné pro zkoumání receptorem zprostředkované endocytózy ve fyziologii a onemocnění.⁹ Konkrétně jsme získali m PTC z humanizovaného myšího modelu exprimujícího lidský INPP5B v Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/-pozadí, což nám umožňuje prozkoumat konkrétní důsledky ztráty aktivity OCRL.^11,23

Záchrana endocytózy alpelisibem je vysvětlena jeho účinkem na aktinový aparát, jasně prokázaný v buňkách OCRL KO HK2 a m PTC. Naše pozorování tak potvrzují a rozšiřují předchozí studie ukazující souvislost mezi kontrolou fosfoinositidové rovnováhy a F-aktinem v časné endozomální dráze u pacientů s OCRL a KO buňkách.^7,10Funkční ztráta aktivity OCRL zhoršuje degradaci PI(4,5)P2, což zase vede k selhání odkrytí vezikul potažených klatrinem, což má za následek aberantní endosomální organely v různých typech buněk včetně PT buněk.^7-10Nedávno jsme ukázali, že nadbytek F-aktinu snižuje recyklaci megalinu multiligandového receptoru do apikální membrány PT buněk, což způsobuje defektní endocytózu a proteinurii LMW.¹¹

Naše data naznačují, že mechanismus účinku alpelisibu na endozomální aktin vychází z bispecifického účinku inhibice alpelisibu: zaprvé na produkci PI(3,4,5)P3 a jeho konverzi na PI(3)P a zadruhé na produkce PI(4,5)P2. Snížení hladin PI(4,5)P2 přímo působí proti nedostatku OCRL a je v souladu s předchozí prací, která zmírňuje nadbytek aktinu a zvyšuje endocytární eflux snížením hladin fosfatidylinositol 4-fosfát 5-kinázy enzym, který vytváří PI(4,5)P2.¹⁰Alpelisib má 0,5 mM 50procentní inhibiční koncentraci na PI(4,5)P2 generující kinázu PI4Kb, která může být zodpovědná, nebo by mohla být výsledkem obecnějších účinků na rovnováhu fosfoinozitidů vyplývajících z kombinace OCRL Léčba KO a alpelisibem. Identifikovali jsme třídu IA PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibice alpelisibem je relevantní pro inhibici aktinu, protože deplece p110a zprostředkovaná siRNA inhibuje akumulaci aktinu podobně jako léčba alpelisibem a kopanlisibem (o kterém se neuvádí, že inhibuje PI4K). V buňkách RPE jsme dříve pozorovali, že siRNA z INPP4A, která konvertuje PI(3,4)P2 na PI(3)P, inhibuje sestavení aktinu v buňkách OCRL KO, čímž poskytuje cestu z inhibice PI(3,4,5) produkce P3 ke snížení endozomálního PI(3)P. Ukázali jsme, že určité množství PI(3)P zůstává, pravděpodobně zásoba produkovaná na časném endozomu třídou III PI3K, Vps34, protože jsme zjistili, že endozomální přenos je léčbou alpelisibem spíše posílen než potlačován. Komplexní koregulace metabolismu PI a její význam pro inaktivaci OCRL byl také zdůrazněn v nedávné studii, kde nekatalytické funkce fosfoinositid 3- fosfatázy PTEN aktivují degradaci PI(4,5)P2 prostřednictvím PLCXD, zmírňují buněčné fenotypy a absorpci ligandy v modelu zebrafish.³¹

Zmírnění aktinového fenotypu sníženými hladinami PI(4,5)P2 a PI(3)P léčbou alpelisibem souhlasí se synergickým působením PI(4,5)P2 a PI(3)P při získávání SNX9 k aktivaci aktinový aparát na endozomech Ocrl,¹⁴což naznačuje velmi účinnou shodu alpelisibové specificity pro manipulaci s molekulární regulací aktivace aktinu na endozomech. Na druhé straně, jak bylo ukázáno dříve, snížené sestavení endozomálního aktinu zase vede ke zlepšení endocytózy PT u buněk s deficitem OCRL.¹⁰K lepšímu pochopení, zda je regulace aktinu prostřednictvím metabolismu fosfoinositidu skutečným zdrojem terapeutického účinku, který pozorujeme u alpelisibu v Ocrl, bude zapotřebí další charakterizace.^Y/-model myši. Protože třída I PI3K(fosfoinositid 3-kináza)regulují dráhy, které řídí buněčný růst, proliferaci, přežití, metabolismus a autofagii,³²nemůžeme vyloučit, že endocytická záchrana je způsobena účinky přímo na PI(3,4,5)P3 a kombinovaným účinkem na další dráhy modulované PI3K třídy I. Více práce je také zapotřebí k testování, zda PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitory mohou také zmírnit neurologické a jiné klinické projevy pacientů s mutacemi OCRL.⁴

Nedávné zkušenosti s alpelisibem u pediatrických pacientů se syndromem PROS/CLOVES naznačují, že lék má potenciál být dobře tolerován. Alpelisib se užívá perorálně, selektivně se zaměřuje na izoformu PI3K(fosfoinositid 3-kináza)třídy I a vykazuje menší profil toxicity ve srovnání s inhibitory pan-PI3K. Protože alpelisib zcela neblokuje PI3K (fosfoinositid 3-kináza)aktivity, a tím zachování funkcí signální dráhy, může být zvláště vhodný pro dlouhodobé užívání. Zajímavé je, že hyperglykémie vyplývající z užívání alpelisibu může být zvládnutelná dietními změnami.²²Protože dysfunkce PT je prvním projevem onemocnění ledvin pozorovaným u malých kojenců s Dentovým onemocněním 2 a Loweovým syndromem, včasná léčba takové dysfunkce PT, která vede ke zlepšení metabolického profilu a růstu, může zpomalit progresi do chronického onemocnění ledvin, a proto může mít významný dopad na životnost a kvalitu života.³³Přestože jsou projevy onemocnění OCRL mutace obzvláště široké, nedávné studie založené na velkých kohortách genotypovaných pacientů s Loweovým syndromem Dentovy choroby 2 neprokázaly významný vliv typu mutace nebo lokalizace mutace na přežití ledvin.³⁴Souhrnně naše údaje zdůrazňují potenciál pro opětovné využití alpelisibu pro léčbu dysfunkce PT u Loweova syndromu/Dentovy choroby 2, čímž poskytují základ pro rychlé a nákladově efektivní nasazení v klinických studiích na lidech.

3. METODY

3.1 Úplné podrobnosti lze nalézt v Doplňkových metodách.

HK2 buňky byly ošetřeny copanlisibem, alpelisibem, GSK2636771 nebo idelalisibem v uvedených koncentracích po dobu 16 hodin, pokud není uvedeno jinak. Proteiny byly extrahovány standardními metodami z buněk nebo ledvinových tkání a western blotting byl proveden za použití publikovaných nebo komerčně dostupných protilátek. Knockdown siRNA byl proveden pomocí 2 transfekcí 72 a 24 hodin před analýzou. Použili jsme OcrlY/þ podle věku a pohlaví; Inpp5b^{- /-}; a Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/- myší sourozenci nesoucí expresi BAC-INPP5B. Primární kultury m PTC byly vytvořeny z ledvin odebraných z 8 týdnů starých myší Ocrl a endocytická kapacita orálních m PTC byla hodnocena měřením absorpce albuminu. Léčba Alpelisibem byla 10 mM po dobu 16 hodin, pokud není uvedeno jinak. Absorpce albuminu v m PTC byla hodnocena pomocí protokolu "pulse-chase" pro hodnocení apikální vazby a výsledné absorpce. m PTC byly obarveny přes noc vhodnou primární protilátkou a po dobu 45 minut vhodnými sekundárními protilátkami konjugovanými s FL fluoroforem a/nebo Alexa-488 faloidinem. Barvení PI(3)P na m PTC bylo provedeno pomocí sondy domény FYVE. Analýza obrazu byla provedena pomocí CellProfifiler, s použitím uživatelských potrubí pro měření překrytí aktinu/EEA1 a počtu bodů a pomocí ImageJ pro měření intenzity imunofluorescence a detekovaných hran pro výpočet skóre stresových vláken. Kvantitativní data byla vyjádřena jako průměr ± standardní chyba průměru. Pro experimenty in vivo byly myši ve věku 6 týdnů léčeny vehikulem nebo alpelisibem 50 mg/kg tělesné hmotnosti. Moč byla odebírána každých 14 dní a zvířata byla usmrcena po 42 dnech léčby, přičemž byla odebrána krev a ledviny. PT endocytická kapacita orálních myší byla zkoumána měřením absorpce b-laktoglobulinu.

4. ZVEŘEJNĚNÍ

JLG má finanční prostředky od společnosti AstraZeneca na studium v ​​její laboratoři. SPJ je v poradních orgánech a vlastní kapitál společností Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics a Adrestia Therapeutics a je vědeckým partnerem společnosti Ahren Innovation Capital. Všichni ostatní autoři deklarovali žádné konkurenční zájmy.

5. PODĚKOVÁNÍ

Tato práce byla podpořena grantem Evropské výzkumné rady 281971, Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, Wellcome Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/Z, Isaac 18 Trust Research Grant (j) JLG a Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z SPJ a uznáváme financování Gurdon Institute od Wellcome Trust (092096) a CRUK (C6946/A14492). Jsme vděčni Cystinosis Research Foundation (Irvine, CA), Švýcarské národní vědecké nadaci (projektový grant 310030_189044), programu priorit klinického výzkumu (KFSP) RADIZ (Iniciativa pro vzácná onemocnění Zurich) UZH, švýcarský

National Center of Competence in Research (NCCR) Kidney Control of Homeostasis (Kidney.CH) za podporu a NIDDK/NIH a Lowe Syndrome Trust/UK za podporu vývoje orálních myší. Děkujeme Robertu L. Nussbaumovi (Invitae Corporation a UCSF, San Francisco, CA) a Marii Antonietttě De Matteis (Telethon Institute of Genetics and Medicine, University Federico II Neapol, Neapol, Itálie) za poskytnutí zakladatelů kolonie orálních myší;

a Eric Olinger (UZH, Curych) za plodné diskuse. Děkujeme Nadine Näegele a Daniele Nieri za poskytnutí technické pomoci během odběru a analýzy moči; Guillaume Canaudovi (Hôpital Necker-Enfants Malades, Paříž) za sdílení podrobného protokolu pro přípravu Alpelisibu pro léčbu in vivo; a Renatě Kozyraki a Pierru Verroustovi za poskytnutí činidel. Děkujeme také Centru pro mikroskopii a analýzu obrazu Univerzity v Curychu (Curych, Švýcarsko) a zařízení pro integrační fyziologii hlodavců v Curychu (ZIRP) za poskytnutí vybavení pro získávání zobrazení a technickou podporu během experimentů in vivo.

Jak se inhibitor fosfoinositid 3-kinázy alpelisib používá u Loweova syndromu/Dentovy choroby?

6. DOPLŇKOVÝ MATERIÁL

Doplňkový soubor (PDF)

Doplňkové metody a odkazy.

Tabulka S1. Tělesná hmotnost, parametry moči a krve v průběhu času u perorálně podávaných myší léčených alpelisibem nebo vehikulem.

Obrázek S1. Exprese izoformy p110 a testy cytotoxicity reakce na dávku léku v buňkách HK2.

Obrázek 2. PI3Kinhibitor alpelisibobnovuje aktin-endozomální překryv a snižuje hladiny PI(3)P způsobem závislým na dávce 4 hodiny po léčbě léčivem v buňkách HK2.

Obrázek S3. Exprese izoformy p110 a toxicita alpelisibu v Ocrl mPTC.

Obrázek S4. Pracovní postup analýzy překrytí EEA1/aktin v Ocrl mPTC.

Obrázek S5. Alpelisib obnovuje vychytávání albuminu v Ocrl^Y/-mPTC. Exprese Aqp1 není ovlivněna. Doplňkový soubor (filmy)

Film S1. Imaris 3D vykreslování překrytí EEA1/aktin v OcrlY/þ mPTC ošetřených DMSO. Reprezentativní 3D povrchové vykreslování konfokální sady OcrlY/þ mPTC ošetřených DMSO po dobu 16 hodin, poté fixováno 4% formaldehydovou fixací a imunoznačeno pro EEA1 (fialová), aktin (faloidin; žlutá) a DAPI (modrá), což ilustruje málo aktin/endozomální asociace. Pruh=5 mm.

Film S2. Imaris 3D vykreslování překrytí EEA1/aktin v Ocrl^Y/-mPTC ošetřené DMSO. Reprezentativní 3D povrchové vykreslení konfokální sady OcrlY/– mPTC ošetřené DMSO po dobu 16 hodin, poté fixované 4% formaldehydovou fixací a imunoznačené pro EEA1 (fialová), aktin (faloidin; žlutá) a DAPI (modrá), ilustrující tečkovité aktin sdružující blízké endozomální struktury. Pruh=5mm.

Film S3. Imaris 3D vykreslování překrytí EEA1/aktin v Ocrl^Y/- mPTC léčené alpelisibem. Reprezentativní 3D povrchové vykreslení konfokální sady OcrlY/– mPTC ošetřených 10 mM alpelisibu po dobu 16 hodin, poté fixováno 4% formaldehydovou fixou a imunoznačeno pro EEA1 (fialová), aktin (faloidin; žlutá) a DAPI (modrá) , ilustrující záchranu aktinových tečkovaných struktur kolem endozomů. Pruh=5 mm.

REFERENCE

1. van der Wijst J, Belge H, Bindels RJM, Devuyst O. Fyziologie učení z dědičných poruch ledvin. Physiol Rev. 2019;99:1575–1653.

2. Loi M. Loweův syndrom. Orphanet J Vzácný Dis. 2006;1:16.

3. Lewis RA, Nussbaum RL, Brewer ED. Loweův syndrom. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., eds. GeneReviews® [internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2020. Dostupné na: HTTPS:// www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/. Publikováno 24. července 2001; Aktualizováno 18. dubna 2019. Zpřístupněno 8. srpna 2019.

4. De Matteis MA, Staiano L, Emma F, Devuyst O. 5-fosfatáza OCRL vLoweův syndrom a Dentova nemoc2. Nat Rev Nephrol. 2017;13: 455–470.

5. Devuyst O, Luciani A. Chloridové transportéry a receptorem zprostředkovaná endocytóza v renálním proximálním tubulu. J Physiol. 2015;593:4151–4164.

6. Zhang X, Jefferson AB, Auethavekiat V, Majerus PW. Proteinem s deficitem Loweova syndromu je fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát 5- fosfatáza. Proč Natl Acad Sci US A. 1995;92:4853–4856.

7. Nández R, Balkin DM, Messa M, et al. Studie buněk Loweova syndromu odhalila roli OCRL v dynamice a uncoating potažených klatrinem. eLife. 2014;3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. Buněčné a fyziologické funkce proteinu Loweova syndromu OCRL1. Provoz. 2014;15:471–487.

9. De Leo MG, Staiano L, Vicinanza M, et al. Fúze autofagozom-lysozom spouští lysozomální odpověď zprostředkovanou TLR9 a řízenou OCRL. Nat Cell Biol. 2016;18:839–850.

10. Vicinanza M, Di Campli A, Polishchuk E, et al. OCRL řídí transport přes časné endozomy prostřednictvím PtdIns4,5P(2)-dependentní regulace endozomálního aktinu. EMBO J. 2011;30:4970–4985.

11. Festa BP, Borquez M, Gassama A, et al. Deficit OCRL narušuje endolysozomální funkci v humanizovaném myším modelu proLoweův syndrom a Dentova nemoc. Hum Mol Genet. 2019;28:1931–1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, Ellson CD, et al. P-Rex1, PtdIns(3,4,5)P3- a Gbetagamma-regulovaný guanin-nukleotidový výměnný faktor pro Rac. Buňka. 2002;108:809–821.

13. Cval JL, Walrant A, Cantley LC, Kirschner MW. Fosfoinozitidy a zakřivení membrány mění způsob polymerace aktinu prostřednictvím selektivního získávání Toca{1}} a Snx9. Proč Natl Acad Sci USA A. 2013;110:7193–7198.

14. Daste F, Warrant A, Holst MR, et al. Řízení polymerace aktinu prostřednictvím koincidence fosfoinozitidů a vysokého zakřivení membrány. J Cell Biol. 2017;216:3745–3765.

15. Malek M, Kielkowska A, Chessa T, et al. PTEN reguluje signalizaci PI(3,4)P2 po proudu třídy I PI3K(fosfoinositid 3-kináza). Mol Cell. 2017;68:566–580.e510.

16. Gillooly DJ, Morrow IC, Lindsay M a kol. Lokalizace fosfatidylinositol 3-fosfátu v buňkách kvasinek a savců. EMBO J. 2000;19:4577–4588.

17. Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD, a kol. PI3K(fosfoinositid 3-kináza)cesta v lidské nemoci. Buňka. 2017;170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Bull CO, a kol. BAY 80-6946 je vysoce selektivní intravenózní PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibitor se silnými aktivitami p110alfa a p110delta v nádorových buněčných liniích a xenograftových modelech. Mol Cancer Ther. 2013;12:2319–2330.

19. Fritsch C, Huang A, Chatenay-Rivauday C, et al. Charakterizace nového a specifického PI3K(fosfoinositid 3-kináza)alfa inhibitor NVP-BYL719 a vývoj strategie stratifikace pacientů pro klinické studie. Mol Cancer Ther. 2014;13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA a kol. Objev NVP-BYL719, silného a selektivního inhibitoru fosfatidylinositol-3 kinázy alfa vybraného pro klinické hodnocení. Bioorg Med Chem Lett. 2013;23:3741–3748.

21. Andre F, Ciruelos E, Rubovszky G, et al. Alpelisib pro PIK3CA-mutovaný, hormonální receptor-pozitivní pokročilý karcinom prsu. N Engl J Med. 2019;380:1929–1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH a kol. Cílená léčba u pacientů se syndromem přerůstání souvisejícím s PIK3CA. Příroda. 2018;558:540–546.

23. Bothwell SP, Chan E, Bernardini IM, et al. Myší model pro Loweův syndrom/Dent Disease 2 renální tubulopatii. J Am Soc Nephrol. 2011;22: 443–448.

24. Chen R, Kang VH, Chen J, et al. Monoklonální protilátka pro vizualizaci PtdIns(3,4,5)P(3) v buňkách. J Histochem Cytochem. 2002;50:697–708.

25. Hammond GR, Schiavo G, Irvine RF. Imunocytochemické techniky odhalují mnohočetné odlišné buněčné pooly PtdIns4P a PtdIns(4,5)P(2). Biochem J. 2009;422:23–35.

26. He K, Marsland R III, Upadhyayula S, et al. Dynamika fosfoinositidové konverze v endocytickém přenosu zprostředkovaném klatrinem. Příroda. 2017;552:410–414.

27. Bilanges B, Chudák Y, Vanhaesebroeck B. PI3K(fosfoinositid 3-kináza)izoformy v buněčné signalizaci a obchodování s vezikulami. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:515–534.

28. Montjean R, Aoidi R, Desbois P a kol. OCRL-mutované fibroblasty od pacientů s Dent-2 nemocí vykazují INPP5B nezávislou fenotypovou variabilitu relativně k buňkám Loweova syndromu. Hum Mol Genet. 2015;24: 994–1006.

29. Suchý SF, Nussbaum RL. Nedostatek PIP2 5-fosfatázy u Loweova syndromu ovlivňuje polymeraci aktinu. Am J Hum Genet. 2002;71:1420–1427.

30. Mizrachi A, Shamay Y, Shah J, et al. Nádorově specifický PI3K(fosfoinositid 3-kináza)inhibice prostřednictvím doručení cíleného na nanočástice u spinocelulárního karcinomu hlavy a krku. Nat Commun. 2017;8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C, et al. PTEN redukuje endozomální PtdIns(4,5)P2 způsobem nezávislým na fosfatáze prostřednictvím PLC dráhy. J Cell Biol. 2019;218:2198–2214.

32. Jean S, Kiger AA. Koordinace mezi regulací a funkcemi RAB GTPázy a fosfoinositidu. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13: 463–470. 33. Devuyst O, Knoers NV, Remuzzi G, a kol. Vzácná dědičná onemocnění ledvin: výzvy, příležitosti a perspektivy. Lanceta. 2014;383: 1844–1859. 34. Zanies M, Bokenkamp A, Kolb M, et al. Dlouhodobý renální výsledek u dětí s OCRL mutacemi: retrospektivní analýza velké mezinárodní kohorty. Transplantace nefrolového číselníku. 2018;33:85–94.

Z: Kidney International (2020) 98, 883–896; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.040

Copyright ª 2020, International Society of Nephrology. Vydalo Elsevier Inc. Toto je článek s otevřeným přístupem pod licencí CC BY (HTTP:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Institute, University of Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QN, Spojené království. E-mail: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; nebo Olivier Devuyst, Ústav fyziologie, Univerzita v Curychu, Curych, Švýcarsko. E-mail: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Tito autoři se na této práci podíleli stejnou měrou.⁶Tito autoři se na studii podíleli. Přijato 8. srpna 2019; revidováno 1. května 2020; přijato 15. května 2020; zveřejněno online 9. září 2020