Extrakt ze semen Phoenix Dactylifera L. vykazuje antioxidační účinky a zmírňuje melanogenezi

Huey-Chun Huang1 , Shr-Shiuan Wang2, Tsang-Chi Tsai3, Wang-Ping Ko3 a Tsong-Min Chang2,*

Abstraktní:Pozadí: Způsob působení extraktu ze semen Phoenix dactylifera v péči o pleť nebyl nikdy prozkoumán. Metody: Semena P. dactylifera L. byla extrahována ultrazvukovou extrakcí. Antioxidační vlastnosti extraktu byly stanoveny pomocí 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylu (DPPH) a 2,2'-azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonové kyseliny) (ABTS plus ) testy a metody čištění. Byl také zkoumán celkový obsah fenolů, redukční kapacita, chelatační schopnost iontů železa (II) a kapacita pohlcování intracelulárních reaktivních forem kyslíku (ROS). Účinky extraktu ze semen P. dactylifera L. na melanogenezi byly hodnoceny spektrofotometricky pomocí testu aktivity tyrosinázy hub, stanovení aktivity intracelulární tyrosinázy a obsahu melaninu. Hladiny exprese proteinů souvisejících s melanogenezí byly analyzovány Western blotem. Výsledky: Výsledky ukázaly, že P.dactylifera L.extrakt ze semen vykazoval zjevnou antioxidační kapacitu a významně snížil intracelulární obsah ROS při koncentracích {{0}},245 a 0,49 (mg/ml). Extrakt dále snižoval expresi melanokortinového receptoru 1 (MC1R), mikroftalmie-asociovaného transkripčního faktoru (MITF), tyrosinázy, proteinu příbuzného tyrosináze-1 (TRP1) a proteinu příbuzného tyrosináze-2 ( TRP2) a inhibovala melanogenezi v buňkách B16F10. Závěry: Naše výsledky ukázaly, že extrakt ze semen P. dactylifera L. zeslabil melanogenezi v buňkách B16F10 snížením signálních drah proteinkinázy A (PKA). Extrakt by tedy mohl být použit jako typ činidla pro bělení pokožky v produktech péče o pleť.

Klíčová slova: Phoenix dactylifera;tyrosináza; melanin; ROS; PKA

cistanche pharma specialje druh činidla pro bělení kůže.

1. Úvod

Antioxidanty jsou široce používány k prevenci nebo léčbě poruch souvisejících s oxidačním stresem v kosmetických a dermatologických oborech. V posledních několika desetiletích se antioxidanty používají také v kosmetickém průmyslu k prevenci nebo oddálení stárnutí pokožky. Uvádí se, že volné radikály a reaktivní formy kyslíku (ROS) jsou spojeny s několika nemocemi, jako je stárnutí a nemoci související s věkem [1]. Je zajímavé, že poškození volnými radikály na kůži způsobené stresem z UV záření a ROS hrají důležitou roli v procesu fotostárnutí kůže [2,3]. Uvádí se, že antioxidanty interferují s oxidačním procesem vychytáváním volných radikálů a ROS nebo chelatací oxidačně-katalytických kovů [4]. Došlo tedy k dramatickému nárůstu počtu aplikací antioxidantů nebo antioxidačních výživových doplňků ke snížení oxidačního stresu nebo poškození způsobeného oxidativním stresem v těle [5,6]. Bylo však prokázáno, že některé chemické antioxidanty, včetně askorbátu sodného, ​​terc-butylhydroxyanisolu (BHA), erythorbátu sodného a terc-butylhydroxytoluenu (BHT), podporují karcinogenní účinky na lidské zdraví [7]. V posledních desetiletích proto došlo k rychlému nárůstu studií o přírodních antioxidantech rostlinného původu. Důležité je, že bylo zjištěno, že zvýšení hladiny ROS může urychlit pigmentaci kůže. Mezi ROS odvozenými z melanocytů a keratinocytů stimuluje oxid dusnatý, NO, syntézu melaninu zvýšením hladin proteinové exprese tyrosinázy a proteinu příbuzného tyrosináze 1 (TRP1) [8,9]. Účinek ROS na produkci melaninu byl studován pomocí různých antioxidantů, jako je N-acetylcystein, aby se odstranil účinek UVB-indukovaného hormonu stimulujícího melanocyty (-MSH) [10].

Melanin je produkován a vylučován melanocyty, které jsou distribuovány v bazální vrstvě kožní epidermis [11]. První dva kroky cesty melanogeneze u lidí jsou hydroxylace L-tyrosinu na 3-4-dihydroxyfenylalanin (L-DOPA) a oxidace L-DOPA na o-dopachinon. Tyrosináza (EC 1.14.18.1) je enzym omezující rychlost, který katalyzuje obě první dvě reakce během melanogeneze [12]. Melanin hraje důležitou roli při ochraně pokožky před poškozením slunečním zářením, ultrafialovým (UV) zářením a je také zodpovědný za barvení vlasů, kůže a očí. Bylo hlášeno, že různé dermatologické poruchy, jako jsou stařecké skvrny, melasma, pozánětlivá melanoderma, pihy a místa aktinického poškození, vyplývající z akumulace nadměrné hladiny epidermálního melaninu [13]. Inhibitory syntézy melaninu se stále častěji používají v produktech péče o pleť pro léčbu nebo prevenci hyperpigmentovaných poruch kůže [14,15]. Kromě toho se v léčbě hyperpigmentace používají antioxidanty, jako je arbutin nebo kyselina kojová [16]. V poslední době tvoří velký podíl kosmetických přípravků kosmetika na bělení pokožky. Tyto přípravky na bělení pokožky hojně využívají nejen ženy s tmavou pletí, ale i ty, které se snaží vyrovnat se s tmavými skvrnami na kůži, které vznikají v důsledku UV záření, těhotenství nebo zvýšeného věku.

Melanogeneze je regulována mnoha faktory. Například tyrosinase-related protein-1 (TRP1), microphthalmia-associated transcription factor (MITF) a tyrosinase-related protein-2 (TRP2) regulují produkci melaninu [18–20 ]. Receptor melanokortinu 1 (MC1R) se také významně uplatňuje při syntéze melaninu indukované -MSH [21]. Na produkci melaninu se podílí několik signálních drah. Mezi různými signálními cestami regulujícími produkci melaninu hraje klíčovou roli v regulaci melanogeneze aktivace proteinkinázy A (PKA) zprostředkovaná cyklickým AMP (cAMP) [22]. V signální dráze cAM-PKA cAMP indukuje aktivaci PKA [23], po které následuje fosforylace cAMP response element-binding protein (CREB). CREB je intracelulární transkripční faktor, který stimuluje expresi genu pro mikroftalmický faktor (MITF), který je důležitý v melanogenezi. MITF je transkripční faktor, který se váže na promotorové oblasti melanogenních genů tyrosinázy, TRP1 a TRP2, čímž upreguluje jejich expresi [24,25]. Poté se intracelulární obsah melaninu zvyšuje [26]. Bylo publikováno, že -MSH zvyšuje hladiny cAMP a obvykle se používá k aktivaci fosforylace CREB a poté ke zvýšení hladin proteinu MITF [27].

Exprese MITF je regulována několika signálními cestami. N-terminální kináza c-Jun (JNK) a mitogenem aktivovaná proteinkináza p38 (MAPK) se podílejí na aktivaci exprese MITF a následné zvýšené expresi tyrosinázy. Aktivační signály extracelulární responzivní kinázy (ERK) také zvyšují fosforylaci CREB a následnou expresi MITF, která moduluje syntézu melaninu [28,29]. Bylo tedy popsáno, že několik činidel pro bělení kůže inhibuje transkripční aktivitu MITF snížením hladin proteinové exprese tyrosinázy, TRP1 a TRP2 prostřednictvím downregulace fosforylace MITF zprostředkované p38MAPK. Navíc bylo popsáno, že dráha ERK se účastní regulace MITF během melanogeneze [30,31]. Aktivace ERK fosforyluje MITF, což vede k degradaci MITF, což má za následek snížení obsahu melaninu [32,33].

Oxidační stres může být výsledkem buď nadprodukce ROS, nebo snížené antioxidační obrany [1]. Hledání a aplikace přírodních antioxidantů zůstávají v centru pozornosti mnoha výzkumných týmů po celém světě. V poslední době roste zájem o výzkum a vývoj fytochemikálií, jako jsou přírodní antioxidanty a fenolické sloučeniny z různých přírodních zdrojů, které by mohly být použity jako nutraceutika, kosmetika proti stárnutí a léčivé přípravky [34]. Phoenix dactylifera L. je jednou z hlavních ovocných plodin pěstovaných na Středním východě a v severní Africe [35,36]. Předchozí studie uvádějí, že plody P. dactylifera L. vykazují antioxidační, antimikrobiální a protizánětlivé účinky pohlcující volné radikály [37,38]. Funkční účinky P. dactylifera L. se neomezují pouze na samotné plody, ale také na jejich semena, která jsou jakýmsi vedlejším produktem plodů [39,40]. Extrakty ze semen P. dactylifera L. by díky svým antioxidačním vlastnostem mohly sloužit jako zdroj antioxidačních látek, které působí proti oxidativnímu stresu [41–43]. Bylo však provedeno jen málo studií o aplikacích semen P. dactylifera L. pro vývoj kosmeceutických produktů. Tato semena jsou obvykle vyhazována jako odpad, ale jejich význam jako funkční kosmetické přísady je zde zdůrazněn. Dosud nebyly zaznamenány žádné zprávy o mechanismu účinku extraktu ze semen P. dactylifera L. v oblasti kosmetiky pro péči o pleť nebo o účincích extraktu ze semen na produkci melaninu. Cílem této studie bylo určit potenciál extraktu ze semen P. dactylifera L. jako inhibitoru melanogeneze pro kosmetický průmysl.

Mechanismy, které jsou základem inhibičních účinků extraktu ze semen P. dactylifera L. na melanogenezi, nebyly dosud prozkoumány. Cílem této studie bylo prozkoumat antioxidační vlastnosti a potenciální mechanismy působení extraktu ze semen P. dactylifera L. na melanogenezi zkoumáním regulátorů transkripce MITF a fosforylace regulátorů signálních drah MAPK a PKA.

čerstvé cistanche

2. Materiály a metody

2.1. Chemikálie a činidla

Chemická činidla použitá ve studii byla zakoupena od Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MS, USA). Protilátky byly od Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA) a ECL činidlo bylo od Millipore (Billerica, MA, USA).

2.2. Příprava a extrakce extraktu ze semen P. dactylifera

Sušené plody P. dactylifera L. byly sklizeny v 2019 z tradičních obchodů v Medina City v Saúdské Arábii. Semena P. dactylifera L. byla úplně omyta, vystavena slunečnímu záření, sušena na vzduchu po dobu jednoho dne a poté sušena při 80 °C po dobu 2 hodin v sušárně. Dehydrovaná semena byla rozdrcena na jemný prášek (# 50 mesh) pomocí odstředivého mlýnu (Retsch Ultra Centrifugal Mill and Sieving Machine, typ ZM1, Haan, Německo). Prášek byl shromážděn v uzavřené skleněné láhvi a skladován při 25 °C až do použití. Rozdrcený vysušený prášek semen P. dactylifera L. (2 g) byl umístěn do extrakční kádinky obsahující 10 ml destilované vody. Dále byla provedena ultrazvuková extrakce s modelem ULTRAsonikTM 57H (250 W, C a A Sales Industrial Supplies, Yucaipa, CA, USA). Pracovní frekvence byla 45 kHz po dobu 30 minut. Po extrakci byly vzorky centrifugovány při 4500 otáčkách za minutu po dobu 50 minut při 25 °C s Eppendorf Centrifuge 5810 R (Hamburg, Německo). Supernatanty byly shromážděny a zfiltrovány nylonovým filtrem (velikost pórů: 0,45 um) a filtrát byl zakoncentrován na 9,8 mg/ml.

2.3. Ultra-výkonná kapalinová chromatografie (UPLC) Analýza extraktu ze semen P. dactylifera a kyseliny ferulové

Extrakt semen P. dactylifera byl analyzován pomocí ACQUITY UPLC H třídy s detektorem fotodiodového pole (Waters, Milford, MA, USA). Kolona byla kolona ACQUITY UPLC BEH C18, 130 Á, 1,7 μm, 2,1 mm x 10 0 mm. Mobilní fáze A byla 0,5% kyselina octová a mobilní fáze B byl acetonitril. Pro časové body 0 a 5 min byl procentuální poměr A/B 95/5; po dobu 20 minut byl procentuální poměr A/B 5/95; pro časové body 21 a 25 min byl procentuální poměr A/B 95/5. Jako pozitivní standard byla použita kyselina ferulová (1 ppm).

2.4. DPPH Scavenging Activity Test

V tomto testu byly jako antioxidační standardy použity vitamin C ({{0}},5 mg/ml) a BHA (0,1 mg/ml). Extrakt ze semen P. dactylifera L. v různých koncentracích (0.0049, 0,0245 a 0,049 mg/ml) byl přidán do 2,9 ml roztoku DPPH (60 uM). Antioxidační složky v extraktu semen by mohly darovat vodík DPPH a přeměnit DPPH na redukovanou formu. Výsledný pokles absorbance při 517 nm byl zaznamenán pomocí UV-Vis spektrofotometru [44].

2.5. Test ABTS plus Scavenging Capacity

Schopnost ABTS plus vychytávání extraktu ze semen P. dactylifera L. byla porovnána s schopnostmi vitaminu C ({{0}},9 mg/ml) a BHA ({{10}}). 9 mg/ml). Pro tento test byl použit ABTS plus. Kation byl nejprve vyroben reakcí roztoku ABTS (7 mM) s persíranem draselným (2,45 mM) a směs byla ponechána stát ve tmě po dobu alespoň 6 hodin před použitím. Absorbance při 734 nm byla měřena 10 min po smíchání různých koncentrací extraktu semen (0,0098, 0,049 a 0,098 mg/ml) s 1 ml roztoku ABTS plus [45].

2.6. Stanovení celkového obsahu fenolů

Celkový obsah fenolů byl stanoven pomocí Folin–Ciocalteuova činidla [46] a jako pozitivní standard byla použita kyselina gallová (2 ug/ml). Různé koncentrace extraktu ze semen P. dactylifera L. (0.0196, 0.098 a 0,196 mg/ml) byly připraveny v 80% methanolu; 100 μl extraktu bylo převedeno do zkumavky a bylo přidáno 0,5 ml Folin-Ciocalteuova činidla (předem naředěného 10-krát deionizovanou vodou) a promícháno. Směs byla ponechána stát při teplotě místnosti po dobu 5 minut; Bylo přidáno 1,5 ml 20% uhličitanu sodného. Po stání při teplotě místnosti po dobu 2 hodin byla odečtena absorbance při 760 nm pomocí UV-Vis spektrofotometru.

2.7. Stanovení redukční kapacity

Vitamin C ({{0}}.008 mg/ml) nebo BHA (4,8 mg/ml) byly v tomto testu použity jako pozitivní standardy. Redukční kapacita extraktu semen byla stanovena podle metody popsané Oyaizu [47]. Různé koncentrace extraktu ze semen P. dactylifera L. (0.0073, 0,036, 0,073 mg/ml) byly smíchány s fosfátovým pufrem (2,5 ml, 0,2 M, pH 6,6 ) a ferrikyanid draselný [K3Fe (CN)6] (2,5 ml, 1 procento hmotn./obj.). Směs byla inkubována při 50 °C po dobu 20 minut. Ke směsi byla přidána kyselina trichloroctová (2,5 ml, 10 procent w/v) a směs byla poté centrifugována při 1000 x g po dobu 10 minut. Horní vrstva roztoku (2,5 ml) byla smíchána s destilovanou vodou (2,5 ml) a FeCl3 (0,5 ml, 0,1 procenta w/v) a byla měřena absorbance při 700 nm.

2.8. Měření iontové chelatační kapacity železa (II).

Pro měření Fe2 plus -iontové chelatační kapacity extraktu ze semen P. dactylifera L., EDTA (0.02, 0.04 a { {10}}.08 mg/ml) byl použit jako pozitivní standard. Různé koncentrace extraktu semen (0,0196, 0,098 a 0,196 mg/ml) byly přidány k roztoku FeCl2 (0,05 ml, 1 mM). Reakční směs se nechala reagovat s ferrozinem (0,1 ml, 1 mM), poté byla směs kvantifikována na 1 ml methanolem a inkubována při 25 °C po dobu 10 minut. Absorbance reakční směsi byla měřena při 562 nm [48].

2.9. Test buněčné životaschopnosti

Test viability buněk byl proveden metodou MTT [49]. Buňky byly vystaveny různým koncentracím extraktu ze semen P. dactylifera L. (0.049, 0.245 a 0,49 mg/ml) po dobu 24 hodin při 37 ◦C a 5 procent C02 ve zvlhčeném inkubátoru a do jamek byl přidán MTT roztok. Nerozpustný derivát MTT byl solubilizován směsí ethanol-DMSO (roztok směsi 1:1). Absorbance jamek při 570 nm byla měřena pomocí čtečky mikrodestiček. Buňky B16F10 (BCRC60031) byly získány z Bioresource Collection and Research Center (BCRC), město Hsinchu, Tchaj-wan. Buňky byly udržovány v DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA) doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra a 1 procentem antibiotik. Kromě toho byl také hodnocen účinek semen P. dactylifera L. na životaschopnost buněk B16F10 metodou vylučovacího testu trypanové modři. Po ošetření extraktem semen byly buňky trypsinizovány a odstředěny, aby se shromáždila peleta. Buněčná peleta byla resuspendována ve 300 ul DMEM buněčného kultivačního média. Malý alikvot buněčné suspenze (20 ul) byl jemně smíchán s 10 ul trypanové modři (4 procenta v PBS). Počet buněk byl spočítán (neživotaschopné buňky byly modré a životaschopné buňky nebarvené) pomocí hemocytometru pod mikroskopem.

2.10. Měření aktivity tyrosinázy hub

Roztok houbové tyrosinázy (10 μl, 200 jednotky) byl přidán do 96-jamkové mikrodestičky. Reakční směs obsahovala 5 mM L-DOPA rozpuštěného ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) (5 0 mM, pH 6,8) a extrakt ze semen P. dactylifera L. (0 0,049, 0,245 a 0,49 mg/ml), kyselina kojová (200 mM; 0,03 mg/ml) nebo arbutin (2 mM; 0,54 mg/ml). Testovací směs byla inkubována při 37 °C po dobu 30 minut a absorbance vytvořeného dopacromu byla měřena při 490 nm. Měření aktivity houbové tyrosinázy bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve [50].

2.11. Stanovení obsahu melaninu

Buňky B16F10 byly ošetřeny -MSH (100 nM) po dobu 24 hodin a poté ošetřeny buď extraktem ze semen P. dactylifera L. (0,0245–0,147 mg/ml) nebo arbutin (0,54 mg/ml) po dobu dalších 24 hodin. Po ošetření byly buněčné pelety solubilizovány v roztoku NaOH (1 N) při 60 °C po dobu 60 minut. Obsah melaninu byl detekován při 405 nm, jak dříve popsal Tsuboi [51].

Cistanche inhibuje produkci melaninu.

2.12. Měření intracelulární tyrosinázové aktivity

Intracelulární aktivita tyrosinázy byla stanovena, jak bylo popsáno dříve [52]. Buňky byly ošetřeny -MSH (100 nM) po dobu 24 hodin a poté extraktem ze semen P. dactylifera L. (0.0245–0,147 mg /ml) nebo arbutinu (0,54 mg/ml) po dobu 24 hodin. Po ošetření byly buněčné extrakty (100 μl) smíchány s čerstvě připraveným roztokem L-DOPA (0,1 procenta v PBS) a inkubovány při 37 °C a byla měřena absorbance při 490 nm.

2.13. Experiment Western blotting

Buňky byly ošetřeny extraktem ze semen P. dactylifera L. ({{0}}.0245, 0.0368, 0.{101} {14}}49 a 0,147 mg/ml) nebo arbutin (0,54 mg/ml) a poté lyžovány v PBS obsahujícím nedietní P-40 (1 procento), deoxycholát sodný (0,5 procenta), dodecyl sodný sulfát (SDS, 0,1 procenta), aprotinin (5 ug/ml), fenylmethylsulfonylfluorid (100 ug/ml), pepstatin A (1 ug/ml) a EDTA (1 mM) při 4 °C po dobu 20 minut. Celkové lyzáty byly kvantifikovány pomocí mikro BCA soupravy (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Proteiny (30 ug) byly rozděleny elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a elektroforeticky přeneseny na polyvinylidenfluoridovou membránu. Membrána byla blokována v 5% odtučněném mléce v PBST (PBS s 0,05% Tween-20) a inkubována při 4 ◦C přes noc s následujícími primárními protilátkami naředěnými v PBST: MITF Ab (1:1000), TRP1 Ab (1:6000), TRP2 Ab (1:1000), MC1R Ab (1:500), GAPDH Ab (1:1500), tyrosináza Ab (1:2000), p-p38 Ab (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500) a CERB Ab (1:200), všechny od Santa Cruz Biotech (Dallas, TX, USA)). Navázané protilátky byly detekovány sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (Amersham Corp.) následovanou detekčním systémem ECL (Amersham) podle pokynů výrobce.

2.14. Test inhibitoru PKA

Buňky byly ošetřeny -MSH (100 nM) po dobu 24 hodin, poté následovalo 1 hodinové přidání 10 uM regulátoru PKA H89. Po ošetření se k buňkám přidal extrakt ze semen P. dactylifera L. (0,147 mg/ml) a H89 a inkubovaly se dalších 23 hodin. Obsah melaninu byl stanoven tak, jak je popsáno výše.

2.15. Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí Tukeyho post hoc testu, který byl použit pro srovnání naměřených dat, pomocí Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) verze 22.0 statistický software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). * p < 0.05="" bylo="" považováno="" za="" významné,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p=""><>

3. Výsledky

3.1. UPLC analýza extraktu ze semen P. dactylifera L.

Výsledky UPLC analýzy jsou uvedeny na obrázku 1A, B. Obrázek 1A znázorňuje překrývající se pík extraktu semen P. dactylifera L. a kyseliny ferulové při 330 nm. Obrázek 1B ukazuje podobná skenovací spektra mezi 220 a 500 nm pro extrakt ze semen P. dactylifera L. a kyselinu ferulovou.

3.2. Antioxidační vlastnosti extraktu ze semen P. dactylifera L

Antioxidační aktivita extraktu ze semen P. dactylifera L. in vitro odhalila přítomnost antioxidačního potenciálu. V testu DPPH vitamin C ({{0}}.05 mM; 0,53 mg/ml) a terc-butylhydroxyanisol (BHA) (0 0,1 mg/ml) byly použity jako pozitivní antioxidační standardy. Kapacita vychytávání DPPH extraktu byla 49,97 ± 2,9 procenta, 81,36 ± 0,56 procenta a 78,53 ± 3,83 procenta kontroly pro koncentrace extraktu 0.0{{{{101} 31}}49, 0,0245 a 0,049 (mg/ml), v daném pořadí. Pro srovnání, vychytávací kapacity vitaminu C a BHA byly 90,12 ± 0,31 procenta a 90,44 ± 0,49 procent, v daném pořadí (obrázek 2A).

Tento radikálový kation ABTS má modrou barvu a je reaktivní vůči většině antioxidantů. Během této reakce se modrý radikálový kation ABTS přemění zpět na svou bezbarvou neutrální formu. Reakce byla sledována spektrofotometricky. Kapacita ABTS plus vychytávání extraktu byla 5,69 ± 1,36 procenta, 18,81 ± 0,68 procenta a 66,82 ± 8,51 procenta kontroly při koncentracích 0.0{{16 }}98, 0.{{20}}49, respektive 0,098 mg/ml. Naproti tomu ABTS plus vychytávací kapacity vitaminu C (0,9 mg/ml) a BHA (0,9 mg/ml) byly 95,52 ± 0,12 procenta a 40,3 ± 0,83 procenta, v tomto pořadí. Výsledky na obrázku 2B ukazují, že extrakt semen zachycuje významné množství ABTS plus radikálu.

Pro stanovení celkového obsahu fenolů v extraktu semen P. dactylifera L. byla jako pozitivní standard použita kyselina gallová (2 ug/ml). Výsledky na obrázku 2C ukazují, že celkový obsah fenolů v 0.0196, 0.{{20}}98 a 0. 196 (mg/ml) extraktu bylo 33,43 ± 2,33 procenta, 117,22 ± 7,81 procenta a 195,4 ± 1 0,91 procenta, v tomto pořadí. Ekvivalenty kyseliny gallové (GAE) výše uvedených koncentrací extraktů semen byly 0.068 ± 0,01, 0,365 ± 0,01 a 0,642 ± 0,03, v tomto pořadí (obrázek 2C).

3.3. Inhibiční účinky extraktu ze semen P. dactylifera L. na melanogenezi

Výsledky uvedené na obrázku 4A ukazují, že 0,049 mg/ml extraktu ze semen P. dactylifera L.nevykazoval inhibiční účinek na aktivitu houbové tyrosinázy. Na druhé straně procenta inhibice enzymu byla 8,34 ± 2,67 procenta a 33 ± 2,36 procenta kontroly pro 0.245 a 0,49 mg/mlošetření extraktem ze semen P. dactylifera L., resp. Kromě toho procenta inhibice tyrosinázy kyseliny kojové (200 μM; 0.03 mg/ml) a arbutinu (2 mM; 0,54 mg/ml ) bylo 56,26 ± 5,06 procenta a 64,56 ± 2,88 procenta kontroly, v daném pořadí (obrázek 4A). Vyšší koncentrace extraktu ze semen P. dactylifera L. (0,245 a 0,49 mg/ml) by tedy mohly představovat inhibiční hladiny houbové tyrosinázy.

Na obrázku 4B výsledky ukázaly, že pouze 0,147 mg/ml extraktu ze semen P. dactylifera L. může významně snížit obsah melaninu v buňkách melanomu B16F10. Po ošetření byl obsah melaninu v buňkách B16F10 80,66 ± 5,43 procenta obsahu kontroly. Pro pozitivní standard, arbutin (0,54 mg/ml), zbývající intracelulární obsah melaninu byl 61,19 ± 8,17 procent obsahu kontroly. Výsledky ukázaly, že 0,147 mg/ml extraktu ze semen P. dactylifera L. vykazovalo menší účinky než arbutin. Zbývající hodnoty intracelulární tyrosinázové aktivity byly 85,1 ± 8,1 procent a 73,7 ± 11,9 procent pro 0,098 a 0,147 mg/ml extraktu semen P. dactylifera L., v daném pořadí. Zbývající intracelulární tyrosinázová aktivita byla 64,3 ± 14,9 procent kontroly poté, co byly buňky ošetřeny arbutinem (obrázek 4C). Výsledky ukázaly, že vyšší koncentrace extraktu ze semen P. dactylifera L. stále vykazovaly menší inhibiční účinek na aktivitu tyrosinázy indukované -MSH v buňkách B16F10 než arbutin.

3.4. Extrakt ze semen P. dactylifera L. inhibuje hladiny exprese proteinů podílejících se na melaninogenezi

Western bloty byly použity ke zkoumání hladin exprese proteinů souvisejících s melanogenezí v B16F10 buňkách (obrázek 5A). Výsledky ukazují, že ošetření různými koncentracemi extraktu ze semen P. dactylifera L. vedlo ke snížení hladin MC1R, MITF, tyrosinázy, TRP1 a TRP2. Inhibiční účinky extraktu na expresi proteinu byly zřejmé při koncentraci {{10}},147 mg/ml. Násobná změna hladiny exprese proteinu pro MC1R byla 0,74 ± 0.02; pro MITF to bylo {{20}}.51 ± 0.03; pro tyrosinázu to bylo 0,54 ± 0,26; pro TRP-1 to bylo 0,57 ± 0,15; a pro TRP-2 to bylo 0,49 ± 0,1 (obrázek 5B).

Hladiny exprese signálních proteinů souvisejících s melanogenezí byly zkoumány pomocí Western blotů (obrázek 5C). Výsledky ukazují, že ošetření 0,147 mg/ml extraktu ze semen P. dactylifera L. zjevně vedlo ke snížení hladin p-p38, p-JNK, p-ERK a p-CREB. Násobná změna hladiny proteinové exprese pro p-p38 byla 0,88 ± 0,15; pro p-JNK to bylo 0,68 ± 0,39; pro p-ERK to bylo 0,65 ± 0,23; a pro p-CREB to bylo 0,44 ± 0,07 (obrázek 5D).

3.5. Extrakt ze semen P. dactylifera L. neovlivňuje genovou expresi tyrosinázy, TRP1, TRP2 nebo MITF

Hladiny genové exprese proteinů souvisejících s melanogenezí, jako je tyrosináza, TRP1, TRP2 a MITF, byly zkoumány pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce v reálném čase (RT-PCR). Relativní normalizované hladiny exprese tyrosinázy/GAPDH pro 0.0367, 0.049 a 0,147 mg/ml P. ošetření extraktem ze semen dactylifera L. bylo 3,51 ± 0,52, 2,38 ± 0,24, respektive 1,64 ± 0,55. Pro TRP-1/GAPDH, relativní normalizované úrovně výrazu pro 0.0367, 0.049 a {{4{{43} }}}.147 mg/ml ošetření extraktem ze semen P. dactylifera L. bylo 1,64 ± 0,2, 1,15 ± 0.02 a 0. 89 ± 0.07. Relativní normalizované hladiny exprese TRP-2/GAPDH pro 0.0367, 0.049 a 0,147 mg /ml extraktu ze semen P. dactylifera L. byly 1.08 ± 0,13, 0,85 ± 0,01, respektive 0,7 ± 0,05. Pro MITF/GAPDH byly relativní normalizované hladiny exprese pro 0,0367, 0,049 a 0,147 mg/ml extraktu ze semen P. dactylifera L. 1,48 ± 0,19, 1,03 ± 0,02 a 0,74 ± 0,65 ± 0,05, v tomto pořadí).

4. Diskuze

Bylo popsáno, že melanogeneze zvyšuje buněčný oxidační stres. Kromě toho několik antioxidantů, lapačů ROS, lapačů inhibitorů a inhibitorů může inhibovat syntézu melaninu zprostředkovanou UV zářením [54]. Antioxidanty, scavengery ROS a inhibitory melanogeneze se proto stále častěji používají v kosmetice pro bělení kůže pro prevenci nežádoucí hyperpigmentace kůže [14]. Bylo také zjištěno, že stimulace metalothioneinu, endogenního antioxidantu, může potlačit melanogenezi v melanocytech [55]. Lidská kůže je často vystavena environmentálním oxidujícím polutantům nebo UV záření a je poškozována vnějšími faktory prostředí. Zejména bylo popsáno, že UV záření indukuje tvorbu ROS v kůži a podporuje peroxidaci lipidů buněčné membrány [56]. K potlačení oxidačního stresu je kůže vybavena speciálními antioxidačními systémy [57].

K objasnění antioxidační aktivity extraktu ze semen P. dactylifera L. byly stanoveny DPPH a ABTS plus aktivita pohlcující radikály, celkový obsah fenolů, redukční kapacita a schopnost extraktu chelatovat kovové ionty, jak bylo popsáno dříve [47,48]. Extrakt ze semen P. dactylifera L. vykazoval značné antioxidační aktivity ve všech výše uvedených analytických studiích. Výsledky ukázaly antioxidační potenciál extraktu ze semen P. dactylifera L. v různých rozmezích s odlišnou účinností. Aktivita vychytávání DPPH extraktu ze semen byla ukázána na obrázku 2A a byla odlišná od aktivity ABTS plus zobrazené na obrázku 2B, což mohlo vyplývat z různých mechanismů interakcí antioxidant-radikál. Kromě toho se může lišit stechiometrie reakcí mezi antioxidačními složkami v extraktu semen, což má za následek rozdíl v kapacitě vychytávání volných radikálů [58]. Potenciální antioxidanty v extraktu semen P. dactylifera L. by mohly převést komplex Fe3 plus/ferikyanid na železnatou formu a redukční kapacita sloužila jako indikátor antioxidační aktivity extraktu ze semen znázorněného na obrázku 2D. Bylo zjištěno, že kyselina kojová [59] působí jako inhibitor tyrosinázy, protože kyselina kojová působí jako chelátor kovů, který chelatuje ionty mědi a inhibuje tyto ionty vstupující do aktivního místa tyrosinázy. Antioxidanty v extraktu semen tedy mohou tvořit nerozpustné kovové komplexy s železnatými ionty a pak inhibovat interakci mezi kovovými ionty a lipidy. Vyšší schopnost chelatovat kovové ionty extraktu semen indikovala jeho potenciální antioxidační aktivitu a možné inhibiční účinky na aktivitu tyrosinázy (obrázek 2E).

Princip stanovení intracelulárního ROS spočívá v tom, že DCFH-DA difunduje buněčnou membránou a je enzymaticky hydrolyzován na DCFH esterázou; poté DCFH reaguje s ROS (jako je H202) za vzniku DCF. Rychlé zvýšení DCF indikovalo oxidaci DCFH intracelulárními radikály [60]. Myšlenka hledání nových antioxidantů pro bělení pokožky spočívá v hypotéze, že oxidační stres vyplývající z UV záření může přispívat ke stimulaci syntézy melaninu. Uvádí se, že UV záření produkuje ROS v kožních tkáních, které mohou indukovat produkci melaninu aktivací tyrosinázy [61]. Kromě toho bylo publikováno, že několik činidel pro bělení kůže může inhibovat melanogenezi interakcí s ionty mědi na aktivním místě tyrosinázy nebo s o-chinony, aby blokovaly polymeraci meziproduktů v syntetické cestě melaninu [62]. Kromě toho může vitamin C nebo vitamin E snížit oxidaci již existujících částic melaninu. Proto byly tyto vitamíny široce používány v přípravcích na bělení kůže [63]. Je zajímavé, že naše výsledky prokázaly antioxidační vlastnosti extraktu ze semen P. dactylifera L., což naznačuje, že extrakt ze semen P. dactylifera L. by mohl působit jako složka pro bělení pokožky v kosmetice.

MTT test je dobře známý kolorimetrický test, který měří aktivitu buněčných NADH/NADPH-dependentních oxidoreduktázových enzymů, které redukují MTT na fialově zbarvená formazanová barviva. Tento test by mohl být použit ke zkoumání potenciální cytotoxicity léčivých látek a toxických materiálů, protože tato činidla zvyšují nebo inhibují životaschopnost buněk. Výsledky uvedené na obrázku 3A byly v souladu s výsledky testu vylučování trypanové modři na obrázku 3B, což ukazuje, že extrakt ze semen P. dactylifera L. neměl žádný cytotoxický účinek na životaschopnost melanomových buněk B16F10.

Tyrosináza z hub se běžně používá jako cílový enzym pro screening potenciálních inhibitorů melanogeneze. Nejprve bylo zjištěno, že rozsah dávkování ({{0}}}.{20}}49–0,49 mg/ml) extraktu ze semen P. dactylifera L. může inhibovat aktivitu houbové tyrosinázy. Výsledky uvedené na obrázku 4A ukazují, že extrakt ze semen vykazoval nižší inhibiční dopady na aktivitu houbové tyrosinázy než kyselina kojová. Tyrosináza hraje hlavní roli v prvních dvou krocích dráhy melanogeneze. Pro objasnění skutečného inhibičního účinku extraktu ze semen P. dactylifera L. na produkci melaninu byl stanoven obsah melaninu B16F10 a aktivita intracelulární tyrosinázy. Výsledky uvedené na obrázku 4B ukazují, že vyšší koncentrace extraktu ze semen P. dactylifera L. má zjevný inhibiční účinek na tvorbu melaninu. Data ukázala, že extrakt ze semen P. dactylifera L. skutečně blokuje melanogenezi v melanomových buňkách. S tím byly výsledky uvedené na obrázku 4C v souladu s výsledky uvedenými na obrázku 4B. Ve výše uvedených buněčných experimentech byl -MSH použit jako induktor ke stimulaci syntézy melaninu. Bylo popsáno, že -MSH váže receptor melanokortinu 1 (MC1R) a aktivuje intracelulární adenylátcyklázu, která zase katalyzuje ATP na cAMP a aktivuje PKA závislou na cAMP. Výsledky na obrázku 5A odhalily, že extrakt semen P. dactylifera L. inhiboval expresi MC1R, čímž blokoval produkci melaninu indukovanou intracelulární upregulací cAMP zprostředkovanou -MSH. Dále byla inaktivována cAMP-zprostředkovaná PKA signální dráha a inhibována melanogeneze. Abychom potvrdili závěr, provedli jsme experimenty s inhibitory PKA a data uvedená na obrázku 4D ukázala, že inhibiční účinek extraktu ze semen P. dactylifera L. (0,147 mg/ml) na melanogenezi v buňkách B16F10 byl potlačen H{{ 24}}léčba. H89 (N-[2-p-bromcinnamylamino-ethyl]-5-isochinolinsulfonamid) je selektivní a silný inhibitor PKA. Výsledky ukazují, že signalizace PKA zprostředkovaná cAMP byla ovlivněna extraktem ze semen P. dactylifera L..

Tyrosináza, TRP1 a TRP2 jsou tři hlavní enzymy, které regulují syntézu melaninu v savčích buňkách [64]. MITF je navíc hlavním transkripčním regulátorem tyrosinázy, TRP1 a TRP2 a nejdůležitějším regulátorem pigmentace melanocytů [65]. Výsledky na obrázku 5A ukazují, že extrakt semen P. dactylifera L. snížil hladiny proteinové exprese těchto proteinů souvisejících s melanogenezí, inhiboval aktivitu tyrosinázy a snížil obsah melaninu v buňkách B16F10.

V této studii extrakt ze semen P. dactylifera L. potlačil fosforylaci CREB a aktivaci PKA. Tato data naznačují, že dráha cAMP-PKA může být zodpovědná za antimelanogenezi vyvolanou extraktem semen P. dactylifera L. (obrázek 5C).

Bylo popsáno, že MAPK modulují melanogenezi [66]. Rodina MAPK zahrnuje tři typy proteinkináz, včetně extracelulárně responzivní kinázy (ERK), c-Jun N-terminální kinázy (JNK) a p38 MAPK. p38 MAPK může aktivovat protein vázající prvek odpovědi na cAMP (CREB a CREB aktivuje expresi MITF, která pozitivně přispívá k syntéze melaninu [67]. Výsledky na obrázku 5C poskytují důkaz, že extrakt ze semen P. dactylifera L. by mohl inaktivovat CREB, JNK a p38 zase inhibují expresi MITF (obrázek 5A). Tyto výsledky naznačují, že antimelanogenní účinek vyvolaný extraktem ze semen dactylifera L. může být zprostředkován downregulací drah PKA. Navíc bylo hlášeno, že hraje roli ozařování se významně podílí na iniciaci několika kožních poruch, včetně šupinatění, vrásek a hyperpigmentace [68] Výsledky naznačují, že extrakt ze semen P. dactylifera L. snižuje produkci melaninu, což lze přičíst depleci intracelulárního ROS.

Pro posouzení účinku extraktu ze semen P. dactylifera L. na buněčnou produkci melaninu jsme stanovili hladiny mRNA v buňkách B16F10 ošetřených -MSH a extraktem ze semen P. dactylifera L.. Buňky ošetřené -MSH vykazovaly podle očekávání zvýšené hladiny MITF, tyrosinázy, TRP-1 a TRP-2. Je zajímavé, že buňky ošetřené extraktem semen P. dactylifera L. vykazovaly snížení exprese mRNA těchto genů souvisejících s melanogenezí. Mezi sloupci však neexistoval žádný statisticky významný rozdíl, což naznačovalo, že extrakt ze semen P. dactylifera L. neovlivňuje hladiny genové exprese MITF, tyrosinázy, TRP1 a TRP2.

Toto je náš produkt.

Pro více informací klikněte sem.

Bylo publikováno, že hlavní fenolovou kyselinou nacházející se v semenech P. dactylifera L. je kyselina ferulová [69]. Bylo prokázáno, že kyselina ferulová účinně inhibuje syntézu melaninu v melanomových buňkách B16 inhibicí kaseinkinázy 2-indukované fosforylace tyrosinázy způsobem závislým na dávce [70]. Tyto zprávy podporují naše výsledky zobrazené na obrázku 1 – kyselina ferulová ve vodním extraktu semene P. dactylifera L. přispěla k inhibici melanogeneze v buňkách B16F10. Určitě by měly být v blízké budoucnosti prozkoumány další funkční složky v extraktu semen.

Naše výsledky ukázaly, že extrakt ze semen P. dactylifera L. inhiboval melanogenezi v buňkách B16F10 snížením regulace signálních drah PKA. Extrakt ze semen P. dactylifera L. by tedy mohl být použit jako účinné činidlo pro bělení kůže.

5. Závěry

Toto je první zpráva o mechanismu účinku vodního extraktu ze semen P. dactylifera L. při syntéze melaninu. Tato studie prokázala zapojení cAMP/PKA/CREB dráhy do depigmentačního účinku extraktu ze semen P. dactylifera L.. Naše výsledky ukázaly, že extrakt ze semen P. dactylifera L. inhiboval melanogenezi v buňkách B16F10 snížením regulace signálních drah PKA. Extrakt ze semen P. dactylifera L. by tedy mohl být použit jako nové dermatologické činidlo proti melanogenezi a účinné činidlo pro bělení kůže.